Summary
ACT-PRESTO (장기에 거대 분자의 활성 명확하게 기술 압력과 관련된 효율적이고 안정적인 전송) 수동 확산 또는 압력 보조 배달에 의해 삭제 조직으로, 신속하게 효율적으로하지만, 저렴한 조직 청소 및 신속한 항체 침투 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 조직의 넓은 범위는 다중 항체 클리어하여 immunolabeled 및 볼륨 - 이미징 될 수있다.
Abstract
식별 및 장기 또는 세포 수준에서 몸 전체의 세부 조직의 탐구는 생물학의 근본적인 문제입니다. 천이 방법은 프로세스의 각 단계에서 정보의 손실이 발생 상당한 시간 및 3 차원 영상을 얻기위한 노력의 양, 본래 조직 절편 immunolabeling 포함 이미징 직렬 단면 조직을 필요로한다. 손상 조직 내에 고해상도 영상에 대한 최근 개발 된 방법에서, 분자의 특성은 단백질의 표지로 제한되었다. 그러나 장기 청산 현재 사용 가능한 프로토콜은 어려운 실험실에서 조직 정화 기술을 구현하고, 상당히 긴 처리 시간을 필요로한다. 우리는 최근에 신속하고 높은 재현성 프로토콜은 ACT-PRESTO로 명명 설립 (A 뽑은 C larity의 t echnique- P는 ressure의 r은 전자 fficient와의 테이블 t의를 ransfer을 의기 양양몇 시간 내에 조직 통관을 허용 오 rgans)에 고분자의. 또한, ACT-PRESTO은 기존의 방법과 빠른 immunolabeling을 가능하게하고 압력 또는 대류 흐름을 적용하여 조밀하게 형성, 두께 시편의 깊은 층으로 항체 침투를 가속화합니다. 우리는 전기를 사용하여 지방 제거에 의해 삭제하는 방법 조직을 준비하는 방법에 대해 설명하고, 방법을 압력 보조 전달하여 면역 염색. 프로토콜의 신속성과 일관성 차원 조직 학적 연구 볼륨 기반 진단 성능을 촉진한다.
Introduction
신경에서의 과제 중 하나는 신경 회로 배선 그대로 뇌 조직 내의 개별 세포의 가시화된다. 최근까지, 이러한 방법으로 뉴런 간의 연결을 보여주는 조직은 1) 직렬 절편 요구; 이러한 축삭 또는 단백질과 같은 특정 대상, 2) 분자 표지; 전산 등록 또는 2D 직렬 이미지 1의 정렬을 통해 전체 뇌의 3 차원 복원에 의한 3) 시각화. 이 단계에서는, 번잡 많은 시간이 필요하며, 신경 네트워크 매핑 대단히 어렵게 절편 라벨링 동안에 정보가 손실되기 쉽다. 그러나, 단면 처리없이 그대로 조직의 시각화 할 수있는 여러 방법이 개발되어왔다. 생물 조직은 조직 청산 기술 2-10에 의해 광학적으로 투명하게 할 수있다. 주요 방법 중 하나가 손상 조직 차례로 침지 액의 굴절률 차이를 감소시키는따라서 투명한 조직을 렌더링 깊은 구조의 관찰을 가능하게 본래 조직에 광 산란을 감소시킨다. 침지 용액의 일부 유형의 탈수 과정에서 빠른 형광 소광 될 소수성을 갖는다. 따라서, 이러한 방법은 시간이 11, 12의 긴 기간 동안 형광 이미징와 호환되지 않습니다. 대신 소수성 시약, 다른 방법은 생체 조직의 4,6,8의 구조적 정보와 형광을 유지하는 등 SeeDB 4 무서 리터 전자 (6)와 같은 조직 청산을위한 친수성 시약을 사용합니다. 그러나, 거대 분자는 항체를 포함 형 확산에 의해 손상 조직의 중심에 도달 할 수 없다. 따라서, 밀집된 조직의 깊은 영역에서 표적 분자의 미리 라벨링 기술적 도전이다.
최근 개발 조직 소거 방법에있어서, CLARITY 3 하이드로 겔 포함 생체 조직의 전아크릴 아마이드 형성 S 및 지질 도데 실 황산나트륨 (SDS) 함유 용액 하에서 전기 영동에 의해 제거된다. 샘플은 다음 3 광 산란을 감소시키는 정합 굴절률과 용액에 침지된다. 지질 제거 시스템은 나중에 고급 CLARITY (13)와 PACT (수동 명확하게 기술) (10)에 수정되었습니다. 중합 종료 후, 아크릴 사슬은 하이드로 겔을 형성하는 조직, 단백질 가교. 아크릴 아미드와 가교 할 수 없습니다 지질 구성 요소; 따라서, 지질은 SDS 함유 완충액에 따라 전기 영동에 의해 제거 될 수있다. 지질의 활성 제거를 통해 뇌 조직 현저 투명성 9 증가시킨다. 그러나 이러한 방법은 자유 확산에 의해 깊은 라벨의 불가능을 해결하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 두꺼운 조직의 가장 깊은 부분에 시약의 활성 전송에 대한 기술이 필요하다.
CLARITY 조직의 청산과 깊은 조직을 수 있지만시각화, 그것은 쉽게 또는 빠르게 절차 아니다. 그것은 전체 마우스 뇌 7, 14을 취소 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 조직의 신속한 소거 생명 과학 연구 나 볼륨 진단용 기본적인 임상 실험실 설정 이러한 방법의 적용을 위해 필수적이다. 현재의 프로토콜은 압력을 이용한 배달 면역 염색에 의해 생체 조직 통관 이후의 단백질 검출을위한 간단한 방법을 제공한다. 이 촬상 방법과 조합에 의해 출원 된 많은 3 차원 데이터 처리 시스템의 고해상도 볼륨 촬상에 적합하다.
Protocol
동물 실험은 모든 관련 정부 및 기관의 규정을 준수해야합니다.
시약 1. 준비
- 하이드로 겔 모노머 용액 (A4P0)의 경우 : 0.1X 인산 완충 식염수 450 ㎖ (PBS)에 아크릴 아미드의 20g을 추가하고 0.1X PBS로 500 ㎖로 볼륨을 조절합니다.
주의 : 아크릴 아미드 단량체는 독성이. 얼굴 방패, 실험실 코트, 장갑, 및 폐쇄 발가락 신발을 포함, 개인 보호 장비와 흄 후드에서 모든 절차를 수행합니다.- 사용 흄 후드 하에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 2,2'- 아조 비스 [2- (2- 이미 다 졸린 -2- 일) 프로판] 하이드로 겔의 모노머 용액 40 ㎖ (A4P0)에 염산염 100mg을 추가 직전 .
- 영동 조직 지우기 (ETC) 버퍼 : 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 및 탈 H 2 O (DH 2 O)을 800 mL의 붕산의 12.37 g, 40 g을 추가한다. NaOH로 8.5로 pH를 조정하고로 볼륨을 조절추가 DH 2 O 1 L
주의 : SDS은 유해 화학 물질이고; 따라서,주의해서 처리합니다. - 입방 마운트 솔루션 : 크로즈 250g, 우레아 125 g을 N, N, N의 125g DH 2 O의 150 ㎖의 ', N'- 테트라 (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민을 추가 부피를 가지고 DH 2 O와 500 ㎖에
2. 샘플 준비 및 고정
- 마우스의 안락사.
- 같은 주사기에서 alfaxalone (1 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (0.5 ㎎ / ㎏)을 준비합니다.
- 복강 alfaxalone과 자일 라진의 혼합물을 주입하고 마우스 3 분 의식이 될 수 있습니다.
- 마취 마우스가 더 이상 진행하기 전에, 같은 꼬리 핀치로 통증 자극에 응답 할 때까지 기다립니다 없습니다.
주의 : 동물을 처리하기위한 적절한 제도적 지침을 따르십시오.
- 로 transcardially 100 mL의 0.9 %의 염화나트륨 (PH 7.4-7.5) 솔루션 마우스를 관류1X PBS 중의 4 % 파라 포름 알데하이드 100 ㎖ (PFA) (PH 7.4) (14) 다음에 (100 U / ㎖)에게서 피를 뽑다 헤파린을 함유.
주의 : PFA 용액 독성이다. PFA 솔루션 및 모든 후속 처리의 제조는 흄 후드 및 개인 보호 장비를 실시해야합니다. - 마우스 머리를 잘라 피부를 열고, 작은 가위를 사용하여 눈 사이 두개골을 깰.
- 작은, 곡선 집게를 사용하여 두개골 조각을 제거합니다.
- 뇌 또는 원하는 장기를 꺼내.
- 4 ° C에서 하룻밤 후 수정 4 % PFA 솔루션의 뇌와 장기를 품어.
참고 : 특정 지역 조직 지우기를 들어, 특정 지역을 해부 또는 조직 고정 후 조직을 잘라.
주의 : PFA 용액 독성이다. transcardial 관류 이후의 모든 마우스 처리는 흄 후드 및 개인 보호 장비를 실시해야합니다.
3. 하이드로 겔 모노머 주입 및 폴ymerization
- 부드러운 흔들림 12-24 시간 동안 39 ° C에서 A4P0 하이드로 단량체 용액 중의 고정 장기 인큐베이션.
- 하이드로 조직 중합 단량체 풍의.
- 하이드로 단량체 용액 5 ㎖와 10 ㎖ 둥근 바닥 튜브에 시료를 옮긴다. 파라 필름으로 둥근 바닥 튜브의 상단을 감싸.
- 1 분 동안 액체를 통해 질소를 버블 링하여 하이드로 겔 주입 전체 마우스 뇌 샘플이 들어있는 둥근 바닥 튜브에서 산소를 제거합니다. 신속하고 긴밀하게 샘플 함유 튜브를 닫습니다.
- 2 시간 동안 수조 (37 ° C)로 튜브를 옮긴다.
- 초과 하이드로 젤을 제거하기 위해 0.1X PBS와 함께 간략하게 중합 샘플을 씻으십시오.
주의 : 히드로 겔 단량체는 독성이. , 하이드로 겔 단량체와 피부 접촉을 피하기 흄 후드와 얼굴 가리개, 실험실 코트, 장갑을 포함한 개인 보호 장비, 모든 절차를 수행합니다.
참고 : 중합 조직4 ℃에서 2 주 이상 0.1X PBS 포함 된 나트륨 아 지드에 저장 될 수있다.
주의 : 나트륨 아 지드와 높은 급성 독성이다. 얼굴 방패, 실험실 코트, 장갑을 포함, 흄 후드 및 개인 보호 장비로 모든 절차를 수행합니다.
4. 전기 영동 조직 지우기 (ETC)
- 조직 컨테이너에 중합 샘플을 전송하고 ETC 실에서 조직 컨테이너를 배치합니다.
- peristatic 펌프를 사용하여 ETC 버퍼와 ETC 챔버를 입력합니다.
- 전문 의약품 조건을 설정하고 등 실행 다음 설정을 사용합니다.
- 시간 (6.0 시간), 펌프 속도 (30 회전)를 실행, (1.5 A), 온도 (37 ° C) : 전체 기관에 대한 ETC 설정를 들어, 다음 설정을 사용합니다.
- 시간 (2.0 시간), 펌프 속도 (30 회전)를 실행, 전류 (1.5 A), 온도 (37 ° C) : 1 - 2 mm 두께 마우스 뇌 조각에 대한 ETC 설정를 들어, 다음 설정을 사용합니다.
- 전송 t그는 0.1X PBS의 45 mL의 50 ML 원뿔 튜브에 샘플을 삭제. 튜브가 잠시 흔들릴 때 기포가 본 적이 때까지 0.1X PBS로 클리어 샘플을 여러 번 세척 (SDS의 완전한 제거를 확인합니다).
ACT-처리 조직 5. Immunolabeling
- 마우스 뇌 전체 경우 : 1X PBS 6 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 항체 용액 3 mL의 부피에서 샘플을 인큐베이션 0.1 % 트리톤 X-100, 0.01 %의 아 지드 화 나트륨 (항체 희석 용액)을 희석 가벼운 흔들림 37 ° C에서 4 일 동안 티로신 수산화 (TH) 항체 1/500의 요인. 일이 끝의 항체 용액을 대체.
- (3) 45 mL를 0.1X의 PBS로 50 ML 원뿔 튜브에 샘플을 씻으 - 5 시간 버퍼마다 시간을 변경합니다.
- 약한 진탕과 함께 37 ℃에서 4 일 동안 당나귀 항 - 토끼 이차 항체 488의 1/500 희석 인자 항체 희석 용액 3 mL의 부피에서 샘플을 인큐베이션. REPL2 일에 희석 된 항체 솔루션을 에이스.
- 2 mm 두께의 슬라이스 뇌 조직에 1- 들어 : 밤새 또는 최대 1 일 동안 37 ℃ 콜라겐 IV 형 항체 1/500 희석 팩터 항체 희석 용액의 0.5 내지 1 ㎖의 부피에서 샘플을 부화 가벼운 흔들림과 C를 °.
- 1 ~ 2 시간 동안 0.1X PBS의 12 ML의 볼륨과 15 ML 원뿔 튜브에 샘플을 씻으십시오. 버퍼마다 시간을 변경합니다.
- 항 - 토끼 이차 항체 하룻밤 또는 가벼운 흔들림 37 ° C에서 최대 1 하루를 Cy3 공역에 대한 1/500의 희석 배수와 항체 희석 용액의 0.5 1 mL의 부피에 샘플을 품어.
- 3 0.1X에 PBS를 샘플을 씻으 - 5 시간; 버퍼마다 시간을 변경합니다.
- 촬상 전에, 부드러운 진탕 실온에서 1 시간 동안 CUBIC 실장 용액 적절한 양의 시료를 배양한다. 신선한 CUBIC 마운트 솔루션으로 교체하고 추가로 1 시간 동안 배양.
노트: (14)를 포함하여, 마우스 ACT-처리 조직에서 잘 작동했다. 미리 라벨링 된 조직은 가공 조직 ACT 두 이상의 형광 색소의 immunolabeling와 결합 될 수있다.
조밀 한 조직의 6 Immunolabeling (PRESTO)
- C-PRESTO
참고 : C-PRESTO는 전체 고환, 전체 신장, 또는 더 큰 장기의 작은 부분 작은 크기의 샘플에 적합합니다.- 1.5 ㎖의 튜브에 샘플을 이동 콜라겐 IV 형 항체 1/500 희석 팩터 항체 희석 용액 500 μL를 추가하고, 2 시간 동안 600 × g에서 튜브를 원심 분리.
- 30 분 동안 600 × g에서 원심 분리하여 0.1X PBS와 스테인드 샘플을 씻으십시오.
- 2 시간 동안 600 × g에서 Cy3에 접합 된 항 - 토끼 이차 항체와 원심 분리기에 대한 1/500의 희석 배수와 항체 희석 용액 500 μL를 추가합니다.
- 0 스테인드 샘플을 씻으십시오.30 분 동안 600 × g에서 원심 분리하여 1X PBS.
- S-PRESTO
참고 : S-PRESTO 큰 조직에 적합합니다.- 주사기 (30 mL의 부피)를 준비하고, 3 방향 밸브 (도 1a)에 연결한다. 고압 조건 (도 1b)에 대한 접착제 총 밸브를 붙인다.
- 폐쇄 밸브 위치에 3 방 밸브에 연결된 주사기에 샘플을 이동.
- 콜라겐 IV 형에 대한 항체의 1/500 희석 인자 항체 희석 용액 7 mL를 5 - 추가. 밸브를 개방하여 샘플에 항체 솔루션을 놓습니다.
- 주입 / 출금 이동에 충분한 공간을 제공하기 위해 17 ㎖의 위치 주사기 피스톤을 설정한다. 이것은 개방 밸브 위치에서 수행 할 수 있습니다. 주사기 설정이 완료된 후, 3 방향 밸브를 닫는다.
- 주사기 펌프에 샘플이 들어있는 주사기를 넣습니다. 10 ㎖ / 분 주입 / 인출 량과 4-에 주사기 펌프 상태 설정분 연속 사이클 모드 (그림 1C)에 시간을 일시 중지합니다.
주 : 상기 타겟 볼륨 (10 ㎖)하고 짧은 휴지 (4 분) 후 흐름의 방향이 변경 될 때까지 펌프 주입한다. - 실온 (그림 1 층)에서 24 시간 - 3 주사기 펌프를 실행합니다.
- 3 방향 밸브를 열고 0.1X PBS와 솔루션을 교체합니다.
- 주사기 펌프를 이용하여 1 시간 동안 0.1X PBS로 두 번마다 염색 된 샘플을 세척한다.
- Cy3가 접합 된 항 - 토끼 이차 항체 (1/500 희석 인자)을 함유하는 항체의 희석 용액으로 바꾸고 3 주사기 펌프를 실행 - 24 시간.
- 3 방향 밸브를 열고 0.1X PBS와 솔루션을 교체합니다.
- 촬상 전에, 부드러운 진탕 실온에서 1 시간 동안 CUBIC 실장 용액 적절한 양의 시료를 염색 배양한다. 신선한 CUBIC 마운트 솔루션으로 교체하고 추가로 1 시간 동안 배양.
7.maging
- 공 초점 접시에 레이블 조직을 배치하고 조직이 덮여 때까지 CUBIC 마운트 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 조직에 커버 슬립을 놓습니다. 10 배 목표 아래 이미지에 조직 (14)를 공 초점 현미경을 사용합니다.
Representative Results
ACT-조직 지우기
조직 지우기 영향을 미치는 하나의 중요한 요소는 조직 정착된다. PFA 고정 및 아크릴 아미드 주입이 프로토콜에 별도의 단계입니다. 조직 주입 하이드로 겔은 가교 고분자로 내인성 있지만 조직 - 겔 중합 단계 후 프리 A4P0 용액을 중합되지 않는다. 그러므로, 겔 조직 (그림 2A)의 외부를 형성 없습니다. 단백질과 아크릴 사이의 작은 가교의 ACT 절차의 결과는 CLARITY 프로토콜에 비해. 따라서, 하이드로 겔 조직 샘플보다 다공질이다. 이 기능은 지질의 빠른 추출 및 거대 분자의 확산을 가능하게한다. 2 시간 (그림 2B), 5 - - 마우스의 뇌 1- 충분히 1에서 삭제 된 두꺼운 mm 2의 섹션 ETC의 6 시간이 다하기에 충분했다전체 마우스 뇌 (그림 2C)의 learance. 하이드로 겔 매개 조직 청산은 ETC 단계 이후 조직의 확장을 유도하지만, 조직 반사 인덱스 매칭 솔루션의 원래 크기로 돌아왔다. 행위 과정에서 형성된 겔 조직 샘플은 다공성이며, 따라서, 작은 고분자 화합물을 효율적으로 침투 할 수있는 쉽고 (도 3)으로 확산. 티로신 수산화 (TH) 및 콜라겐 유형 IV 항체와 1 mm의 뇌 조각의 2 시간 배양 후 2 차 항체를 가진 이후 2 시간 배양는 500 μm의 깊이에서 도파민 신경 세포를 라벨에 충분했다 (그림 3) .
PRESTO-조직 Immunolabeling
밀도 기관은 일반적으로 조직에 대한 항체의 영향을 침투 ECM 섬유의 높은 농도를 갖는다. 따라서, 항체는 penet배양 12 시간 후, 만 20 ~ 30 μm의 같은 신장 조직으로 조밀 한 조직에서의 깊이로 평가. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 깊은 조직에 시약의 전달, 즉 PRESTO (장기에 거대 분자의 효율적이고 안정적인 전송을 관련 압력) (그림 4)를 활성화 활성 고분자 침투 방법을 설계했습니다. 항체 솔루션, 테이블 탑 원심 분리기와 원심력 (600 XG)의 응용 프로그램 (원심 PRESTO, C-PRESTO) 크게 깊은 조직에 항체 전달을 개선한다 (그림 5)와 ACT-처리 신장 조직의 정적 배양에 비해. 우리가 조밀 한 조직에 C-PRESTO 절차를 적용 할 때, 배양 3 시간은 300 μm의 깊은 구조에 250 레이블을하기에 충분했다. 심각한 조직 손상없이 조직의 왜곡을 개선하기 위해, 또한, 주사기 펌프 (주사기 PRESTO S-PRESTO)와 대류를 제공하는 시스템을 설계 하였다. 이 프로세스는 유사 항체 PE 향상netration 수동 확산 (그림 5)에 비해.
의 S-PRESTO 장치의 그림 1. 준비. A. 주사기 (30 mL) 및 삼방 콕. B. 3 방향 스톱 콕에 연결된 주사기에 붙어. C. 시료와 항체 용액을 함유 주사기 및 주사기 펌프에 배치 된 주사기. D. 주사기 펌프 및 작업 조건 설정. E.는 펌프 시험편으로 라벨링 시약을 함유하는 용액을 주입한다. 상기 지정된 볼륨은 펌핑 방향의 변화 도달 시간의 지정된 기간 이후에 용액을 인출하는 경우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마우스 뇌 그림 2. ACT 조직을 취소합니다. 중합 후 A., 무료 A4P0 솔루션은 중합되지 않습니다 조직 주입 하이드로 겔은 내생 고분자와 가교에 의해 겔화되어있다. 2 mm 두께의 뇌 조각에 B. 1은 1 삭제했다 - 2 시간, 반사 지수의 확장과 크기 복구의 범위는 (RI) -matching 솔루션을 기록 하였다. 완전히 분명 뇌에 충분한 ETC의 6 시간 한 - C. 전체 마우스 뇌의 두께는 약 0.8 cm, 5입니다. ETC 3 시간 후, 비 - 소거 조직 상당량이 있었다. ETC의 6 시간으로, 그러나, 전체 뇌의 청소가 발생했다. 전문 의약품 버퍼 ACT 후 조직의 색깔은 흰색 또는 불투명하다. RI 조정으로 조직을 투명하게. 그녀를 클릭하세요전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
ACT-해제 마우스 뇌 조직 그림 3. Immunolabeling. 콜라겐 유형 IV 및 항체로 염색 중뇌의 일부에 대한 항체로 염색 마우스 뇌 피질을 보여주는 ACT-처리 1-mm 마우스 뇌 조각의 이미지는 수산화 (TH)를 티로신합니다. 스케일 바, 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. PRESTO의 immunolabeling 방법. 항체는 확산에 의해 치밀한 조직으로 침투 할 수 없습니다. PRESTO의 immunolabeling 방법은 적극적으로 거대 분자를 주입하고에 시약을 제공하도록 설계되었다조밀 한 조직. 표준 탁상용 원심 분리기 (원심 PRESTO, C-PRESTO)를 사용하여 원심력의 적용은 현저 항체의 전달을 용이. 항체 침투 향상 주사기 펌프 (주사기 PRESTO S-PRESTO)와 대류를 Appling. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ACT-삭제 조밀 한 조직의 5 PRESTO의 immunolabeling 그림. C-PRESTO 들어, 조직은 일차 및 이차 항체의 침투를 촉진하기 위하여 표준 테이블 탑 원심 분리기를 이용하여 3 시간 동안 600 × g으로 원심 분리 하였다. S-PRESTO 들어, 시린지 펌프는 항체를 제공하는데 사용되었다. 예컨대, 신장, 간 등의 마우스 기관, 콜라겐 IV 형으로 표시 하였다. 종래의 방법 중, 3 시간에 비해C- 또는 S-PRESTO는 현저하게 라벨의 깊이를 향상시킵니다. 50㎛의 (좌측) - 대조 시료 만 (40)의 깊이로 표시되어 있지만, 프레스토 샘플 (오른쪽)에서 350 μm의 또는 깊이 - 신장 및 간에서, Z 축 깊이 (300)에 도달한다. 의 3D 재구성 된 영상은 공 초점 현미경에 의해 수득되었다. 스케일 바, 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
조직에 좋지 고정 또는 하이드로 겔 침수는 단백질의 손실과 조직의 청산 과정에서 조직의 왜곡을 일으킬 수 있습니다. 부드러운 흔들림 18 H - 전체 성인 마우스 뇌 12 겔 단량체 용액을 20 ㎖의 최소 부피에 침지 한 후, 하룻밤 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 배양한다. 뇌 슬라이스와 척수 등의 인체 조직을 포함하여 대규모 조직의 경우, 요구되는 하이드로 겔 단량체 용액에서 시간을 몸을 담글 확장했다. 조직 고정 및 폴리머 주입 단계가 분리되어 있기 때문에 ACT 프로토콜은 고정 된 조직의 청산에 쉽게 적용 할 수있다. 조직 클리어 한 후, 인체 조직은 여러 항체로 잘 염색 하였다. 법 개간 기술은 에탄올과 메탄올 등 알코올 고정 제와 호환되지 않습니다.
조직 - 겔 중합 단계도 클리어 가공 후의 양질 조직을 제조하는 것이 중요하다. 때문에산소 아크릴 아미드의 중합 반응을 억제이를 질소 가스 주입 시스템 하에서 조직 - 함유 용액을 탈기에 의해 제거되어야한다. 다르게는, 탈 산소 23 시간 동안 가열 블록 진공 챔버를 사용하여 실행될 수있다.
지우기 속도는 대부분의 성인 마우스 조직 하룻밤 ETC에 의해 삭제 될 수 등 기관의 크기, 지질 또는 ECM 섬유 단백질의 내용, 고정의 상태 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 그러나의 위험이 불필요한 과잉 소거 및 조직 부종; 따라서, 청소 시간의 차이가 중요한 고려 사항으로합니다. 조직 청산 조건은 경험적으로 결정되어야한다. 중요하게는, ECM의 내용이 클리어 조직의 외관에 영향을 미칠 수있다. ACT는 고밀도 단백질 섬유를 취소하지 않기 때문에 조직의 색상, 심지어 ETC 버퍼의 ACT 후, 흰색 또는 불투명 남아있다. 그러나, 이러한 기관은 RI 정합 용액에 침지하여 상기y를 투명하게되었다.
조직의 팽창 속도는 밀도 기관보다 더 큰 팽창 비율을 전시, 전자 재료 조직의 내용 및 뇌 소프트 기관에 의존 할 것으로 보인다. 증가 된 조직은 조직 청산 절차를 도움이 될 것입니다 붓기 때문에, ACT는 정기적으로 대부분의 경우 수성 버퍼를 증류하여 사용한다. 조직 부종 또는 과도 변형은 배아 같이 바람직되지 않는 경우에, 버퍼 함유 0.1X PBS는 고해상도 영상에 대해 적용 할 수있다. 또한 버퍼의 높은 염 농도는 조직의 수축을 일으킬 수 있다는 것을 주목해야한다.
행위 방법은 마우스 (14)의 전체 기관, 심지어 몸 전체를 명확히 할 수 있습니다. 그러나, 투명 조직의 깊은 조직 이미징은 특수 현미경과 목표를 필요로한다. 따라서, 두꺼운 뇌 조직 1 - 2 mm는 종래의 공 초점 현미경 이미징을위한 가장 효과적입니다. 라벨의 우리의 손에, 제거ACT-처리 조직에서 에드 항체는 항체 의존적이며, 다른 항체 라벨의 라운드는 권장되지 않습니다. 이러한 TH 및 GFAP 등 여러 항체는, 전체 뇌 14 immunolabeling 특히 잘했다. 한편, 이러한 Tuj1 Map2에 또는 일부 항체는 종종 조직의 표면을 표지. 이것은 스위치 (15)와 같은 다른 방법에 의해 개선 될 수있다. 또 다른 잠재적 인 한계가 있기 때문에, 조직이 조직 지우는 단계 동안 팽창 및 수축의 ACT 처리 된 조직에서 미세 단백질 구조를 유지하기 어려울 수도 있다는 것이다.
프레스토 기술은 조직 라벨링 다양한 기술에 적용 가능하다. 예를 들어, SeeDB 4 iDISCO 7로 미리 라벨링 조직을 사용하여 조직 투명한 방법으로, 조밀 한 조직의 immunolabeling는 주에 몇 일 이상 배양 기간이 필요합니다. 그러나 PRESTO 몇 시간 배양 시간을 단축 할 수 있고, 예를1-mm 두께의 치밀한 조직을 갖는 일 이내에 전체 프로세스의 완료를 nabling. PRESTO 두꺼운 깊은 라벨, 조밀 한 조직, 또는 해제 해제 두꺼운 조직의 효율성을 향상시킬 수 있습니다. PRESTO 테이블 탑 원심 분리기 나 주사기 펌프를 사용하며 특별한 장비를 필요로하지 않기 때문에, 일상적인 실험 방법과이 방법을 구현하기 위해 상대적으로 용이하다.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
| Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
| 2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
| Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
| Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
| Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
| Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies - Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
| Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
| Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
| Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
| Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
| ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
| ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
| Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
| Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
| Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
| Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
| Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
| Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
| Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
| Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
| Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
| Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
| Syringe (30 mL) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S30 | s-PRESTO |
| 3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |
References
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