Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando Drosophila melanogaster

Resumo

Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa.

Resumo

Nós descrevemos um protocolo para a medição do etanol auto-administração em moscas da fruta (Drosophila melanogaster) como um proxy para mudanças nos estados de recompensa. Nós demonstramos uma forma simples de explorar o sistema de recompensa mosca, modificar experiências relacionadas a recompensa natural, e use o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa. A abordagem serve como uma importante ferramenta para estudar os neurônios e genes que desempenham um papel nas mudanças mediada por experiência de estado interno. O protocolo é composto de duas partes distintas: expor as moscas para experiências gratificantes e nonrewarding, e ensaiando o consumo voluntário de etanol como uma medida da motivação para obter uma recompensa de droga. As duas partes podem ser utilizadas de forma independente para induzir a modulação da experiência como um passo inicial para mais ensaios a jusante ou como um ensaio de alimentação de duas escolha independente, respectivamente. O protocolo não requer uma instalação complicada e, portanto, pode ser aplicada em qualquer LABORATORY com ferramentas básicas de cultura de mosca.

Introdução

Modificação do comportamento em resposta à experiência permite animais para ajustar seu comportamento às mudanças no seu ambiente ^1. Durante este processo, os animais integrar o seu estado fisiológico interno com as condições variáveis ​​do ambiente externo e, posteriormente, escolher uma ação sobre o outro para aumentar suas chances de sobrevivência e reprodução. Sistemas de recompensa evoluído para motivar comportamentos que são necessários para a sobrevivência dos indivíduos e das espécies, reforçando comportamentos que aumentam a sobrevivência imediata, como comer ou beber, ou aqueles que garantir a sobrevivência a longo prazo, tais como o comportamento sexual ou cuidar de filhos ^2. Compostos artificiais como drogas de abuso também afetam os sistemas de recompensa por vias neurais cooptação que medeiam recompensas naturais ^2.

Durante as duas últimas décadas, a mosca da fruta Drosophila melanogaster tem sido estabelecido como um modelo para estudar o promissor Molecular e mecanismos neuronais que estão moldando os efeitos do etanol sobre o comportamento ^3,4.

Anteriormente, nós identificamos um subconjunto de neurônios peptidérgicas em moscas (receptor NPF / NPF (R) neurônios) que o casal recompensas naturais, como a experiência sexual, para a motivação de obter recompensas de droga ^5. expressão NPF é sensível a ambas as experiências sexuais e recompensas de drogas, tais como a intoxicação por etanol. Alterações nos níveis de expressão NPF são convertidos em alterações em etanol auto-administração ^5, onde a alta NPF reduz e baixa NPF aumenta a preferência para consumir etanol. Ativando neurônios NPF é gratificante para as moscas, como eles exibem forte preferência por um odor emparelhado com a ativação, o que também é refletido pelo consumo de etanol reduzida. Mais importante ainda, a activação de neurónios NPF interfere com a capacidade das moscas de modo a formar uma associação positiva entre a intoxicação etanol e um taco de odor. O nexo de causalidade entre o NPF / Rsistema, a memória recompensa, e o consumo de etanol sugere que é possível utilizar etanol auto-administração como uma medida para alterações nos estados de recompensa ^5.

Nesta publicação, demonstrar uma abordagem integrada para explorar o sistema de recompensa natural, mosca e mudanças ensaiar em estados de recompensa. A abordagem consiste em duas peças separadas, um protocolo de treino para manipular experiências naturais relacionados com a recompensa, seguido por um ensaio de alimentação capilar de dois escolha (CAF) etanol para avaliar a auto-administração como uma estimativa para alterações nos estados de recompensa. O ensaio CAFE é análogo aos ensaios de escolha de dois garrafa utilizados em estudos com roedores para a droga auto-administração e foi mostrado para reflectir determinadas propriedades de comportamento de dependência, como em moscas ^6.

Protocolo

Nota: Visão geral do desenho experimental: O delineamento experimental inclui um protocolo adaptado para a supressão de corte ^7-9 em que as moscas macho são expostos a experiências gratificantes e nonrewarding em 3 sessões de treino consecutivas ao longo de 4 d. No final da fase de experiência, as moscas são testados num ensaio de consumo voluntário de etanol em duas escolha para 3-4 d. O protocolo aqui inclui vários passos preparatórios, alguns dos quais pode ser efectuada previamente, para ser utilizado em mais do que uma experiência, enquanto outros devem ter lugar de uma forma atempada, antes do início da experiência (Tabela 1).

1. Passos preparatórios

1. Preparando o sistema de alimentação capilar
   1. Aquece-se uma agulha G 27, e usá-lo para perfurar pequenos orifícios ao longo de um frasco (Figura 1).
   2. Cortar o bujão do frasco de metade (transversalmente), utilizando uma lâmina de barbear. Mark quatro pontos sobre a superfície do bujão, criando um square forma a posicionar os suportes em capilares. Utilize uma agulha de 18 G para fazer orifícios 4 através do tampão (Figura 1b).
   3. Usar uma lâmina de barbear para cortar micropipetas de modo que eles podem segurar firmemente capilares de vidro 5? L, que servem como adaptadores.
   4. Insira 4 adaptadores capilares nos plugues preparadas.
   5. Marque a posição dos 2 etanol- e dois capilares contendo nonethanol sobre a ficha.
      Nota: Recomenda-se manter as posições dos 2 tipos de capilares consistentes em todos os frascos. Prestar atenção ao tamanho dos furos, como grandes furos permitem a fuga de moscas fora dos frascos. Além disso, é recomendável usar o lado mais liso da ficha (normalmente oposto ao lado de corte) como o lado que está voltado para baixo quando inserida para dentro do frasco, como o corte do tampão cria algumas fibras pequenas, soltas que as moscas podem ficar presos em .
   6. Preparar um grande número de tubos de ensaio e adaptadores a serem usados ​​para o sistema de alimentação capilar (CAF)experiências descritas no passo 2.3.
2. Preparando frascos de alimentos em pequena vidro
   1. Um dia antes de coletar as moscas (passo 1.4), arranjar 200 frascos de vidro em prateleiras tubo de microcentrífuga. Melt voar alimentos (de acordo com a receita melaço de farinha de milho, consulte a Tabela de Materiais), utilizando um forno de microondas. Despeje 2 mL de alimentos voar em frascos de vidro (tentar não manchar a comida nas paredes do frasco). Deixe a endurecer comida, e cobrir os frascos com filme plástico.
      NOTA: Os frascos de vidro contendo o alimento pode ser mantida a 4 ° C durante várias semanas.
   2. No dia da coleta de mosca, dê os frascos fora da geladeira e deixá-los chegar RT antes de usá-los para abrigar moscas.
      NOTA: Se frascos de alimentos são várias semanas de idade, certifique-se de que a comida ainda está intacto e não separado do frasco, como as moscas podem ser presos nas fendas entre a comida e o vidro.
3. Fazendo solução estoque de alimentos para o ensaio de alimentação capilar
   1. para prépare a solução estoque de alimentos (5% de sacarose e 5% de extracto de levedura), dissolve-se 5,88 g de extracto de levedura e 5,88 g de sacarose em 100 ml de água destilada.
      Nota: A solução estoque é altamente propenso à contaminação. Portanto, recomenda-se a autoclave lo (121 ° C, 30 min, e sem um ciclo de secagem) e alíquota de 850 uL em que alíquotas de trabalho para ser mantida a 4 ° C até uso posterior. A concentração de ingredientes na solução estoque é 5,88% e irá atingir a concentração final de 5% após a adição de 15% de etanol ou de água (150 uL em 850 uL de solução de alimentos premade) imediatamente antes da sua utilização no passo 2.3.
4. Coletando moscas experimentais
   1. Colete 200 moscas macho naive usando uma almofada de CO _2.
      Nota: Use qualquer estirpe de laboratório relevante para a questão experimental. 250 moscas podem ser facilmente coletadas de cinco garrafas de moscas na sua fase de eclosão escolha. Ao coletar as moscas, prestar muita atenção ao colmoscas onar que eclosed recentemente (moscas-olhando virgens: moscas brilhantes, com um ponto de mecônio em seu abdômen). moscas experimentais devem ser mantidos individualmente em pequenos frascos de vidro contendo alimentos e envelhecida a 3-4 d velho antes de ser utilizado na experiência.
   2. Use tampões macios para fechar os frascos.
      Observação: O mesmo plugues macios será muito útil para a fase de treinamento, quando por meio de aspiração boca para inserir as fêmeas para dentro e fora dos frascos durante a fase de experiência.
5. Coletando moscas instrutor
   NOTA: Todas as moscas recolhidos devem ser mantidos em um 12 h / 12 h de luz / obscuridade incubadora a 25 ° C e 70% de umidade relativa (UR). A 12 h / 12 h de luz / escuro de ciclo pode ser alterado para um tempo de partida conveniente.
   1. moscas instrutor de fêmeas virgens
      1. Colete 500 virgem instrutor fêmea voa a partir de um estoque WT ou um estoque virginator para uso como fêmeas receptivas virgens. Mantenha as moscas fêmeas em grupos de 25 por de tamanho regular frasco alimentos, e todosow-los à idade de 3-4 d idade antes de os utilizar no experimento.
   2. Acasaladas moscas instrutor do sexo feminino
      1. Colete 300 moscas fêmeas virgens de um estoque WT ou um estoque virginator se submeter acasalamento antes da fase de treinamento (passo 1.6.1).
         NOTA: moscas fêmeas são mantidos em grupos de 10 fêmeas por frasco de tamanho regular de alimentos e envelhecida a 3-4 d velho antes de ser utilizado na experiência.
   3. moscas macho usado para gerar moscas instrutor do sexo feminino acasalados
      1. Colete 150 moscas macho (não necessariamente virgem).
         NOTA: As moscas são mantidos em grupos de 15 machos por frasco de alimentos de tamanho regular e envelhecido ao 3-4 d idade antes de ser emparelhado com a fêmea virgem voa para criar as fêmeas acasaladas instrutor.
6. Gerando moscas fêmea instrutor acasaladas
   1. Para gerar feminina acoplado voa para ser usado como formadores, grupos de pares de 10 do sexo feminino virgem voa com 15 do sexo masculino voa lançando um frasco contendo macho em uma fêmea-Containing frasco 16-18 h antes da fase de treinamento (passo 2.1) ^10.
      NOTA: Este deve normalmente ter lugar na noite antes da sessão de treino. A 1.5: 1 relação entre o macho voa para moscas fêmeas assegura que todas as mulheres será acoplado.
   2. No dia da experiência, separar as fêmeas acasaladas dos machos por aspiração os machos para fora do frasco utilizando um aspirador de boca. Realizar esse direito antes do início de cada dia de treinamento.

2. Passos Experimentais

1. Configurando a fase de experiência
   1. Iniciar a experiência o mais próximo possível para o início da fase de luz na incubadora. Coloque as fêmeas instrutor (ambos virgens e acasaladas) na câmara de comportamento.
      NOTA: Recomenda-se a realizar o experimento em uma câmara de comportamento, ou em qualquer ambiente isolado que é calmo e definido para 25 ° C e 60 - 65% RH. Mantendo a umidade acima de 50% é muito importante, uma vez que o comportamento de corte e acasalamentos depender de detecção de feromonas, que é conhecido por ser sensível à humidade.
2. Expondo moscas macho para experiências gratificantes e nonrewarding
   1. Disponha os frascos de vidro contendo as moscas macho individuais em prateleiras de microcentrífuga, posicionando os frascos ao longo das margens do rack.
      NOTA: Este acordo permite o experimentador de observar facilmente os pares de moscas que se submetem a cópula sem levar os frascos fora do rack.
   2. Prepare (conforme descrito na etapa 2.2.1) 2 grupos de 100 frascos de vidro contendo único macho voa em prateleiras separadas para homens submetidos a experiências de acasalamento gratificantes e nonrewarding (ou seja rejeitado e acasaladas).
   3. fêmeas instrutor aspirado e adicioná-los a cada frasco contendo as moscas macho. Definir o temporizador para 1 h. Começando com o grupo rejeitado, adicionar uma fêmea acoplado a cada frasco. Em seguida, passar para os machos a serem acasaladas e adicionar uma fêmea virgem a cada frasco.
   4. Observe atentamente os encontros de acasalamentopara certificar-se de que os machos que interagem com fêmeas virgens acasalar com sucesso dentro da primeira hora e que os machos que interagem com as fêmeas acasaladas anteriormente não acasalar. Para monitorar a coorte rejeitada no decurso de 1 h, defina um segundo temporizador durante 15 min e assistir os machos a cada 15 min.
   5. Descarregar os machos da coorte rejeitou que conseguiu acasalar e os homens da coorte acoplado que não terminou até o acasalamento até o final da primeira sessão de treinamento.
   6. Terminar a primeira sessão de treinamento, aspirando os formadores do sexo feminino anteriormente acasalados em um frasco regulares mosca comida, e mantê-los para a próxima sessão condicionado. Siga este passo, aspirando suavemente as fêmeas do grupo masculino acoplado.
   7. Deixe as moscas descansar por 1 hora.
   8. Repita os passos 2.2.3 - 2.2.7 duas vezes.
   9. Repita o treino nas etapas 2.2.3 - 2.2.8 todos os dias por mais 3 d.
3. Gravação de consumo (CAFE)
   1. No final do último EstadoEmg sessão (quarto dia), aspirar os homens solteiros e agrupá-los em frascos de alimentação capilar. Use um plug macio para cobrir o frasco de alimentação capilar ao inserir as moscas, e substituí-lo rapidamente com o capilar plugue alimentador de ready-made, após ter sido inserido todas as moscas. Grupo 6 - 8 moscas de cada um dos grupos experimentais para um frasco, criando não menos do que 8 frascos por condição.
   2. Molhar os tampões suavemente adicionando 5 ml de água para a parte superior do obturador. Tenha cuidado ao adicionar a água para evitar o derramamento nos frascos. Adicionar igual volume de água a cada frasco.
      NOTA: Este passo é feito para reduzir a evaporação dos capilares. Portanto, é repetida todos os dias durante o resto da experiência. Dependendo da humidade relativa, os dias seguintes podem requerer menos água a ser adicionada para as velas.
   3. Preparar duas soluções alimentares separadas por adição de etanol ou água para as alíquotas de estoque de alimentos para criar uma concentração final de 15%.
   4. Para preencher o capillAries com as duas soluções de alimentos, criação de 5 uL de alimentos líquidos em gotas uma tira de filme de laboratório e permitir que a solução para encher o capilar até que ele atinja a marca de 5 uL. Certifique-se de usar o fim claro do capilar, que é perto da linha de marca preta 5 mL.
      NOTA: Para encher vários capilares de uma só vez, é possível ligar 6 - 8 adaptadores capilares em conjunto e utilizá-los como uma inserção para segurar os capilares.
   5. Toque os capilares suavemente na faixa de parafina para posicionar a solução alimentar exatamente na marca preta. Selar os capilares por imersão do final de cada capilar em pequenas gotas de óleo mineral. Este passo minimiza o potencial de evaporação da solução de alimentação.
   6. Inserir dois capilares contendo etanol e dois capilares nonethanol contendo através dos adaptadores 4 / detentores na ficha até os lados expostos dos capilares apenas espreitar a partir do interior do frasco (1 mm ou menos a partir da superfície do bujão).
      NOTA:Manter a abertura dos capilares perto do plugue molhada reduz a evaporação e permite fácil acesso aos alimentos, como moscas normalmente sentar-se sobre as fichas e desça na capilar exposto para se alimentar.
   7. Além de frascos que contêm moscas experimentais, prepare um frasco simulada sem moscas. Este controlo serve para avaliar evaporação natural.
      NOTA: Tente manter relativamente igual posicionamento da abertura capilar em comparação com as velas, como as diferenças podem levar à evaporação variável e enganosa dados de consumo. Manter a umidade adequada durante o experimento e posicionar as aberturas capilares, tanto quanto possível para o plug molhado, como baixa umidade e grande distância entre o plug molhado pode tanto resultar em evaporação descontrolada.
   8. Grave a posição relativa do líquido em cada um dos vasos capilares no que diz respeito à linha de marca negra em milímetros com uma régua, e escrever esses valores para baixo.
      NOTA: Se a solução está posicionada exatamente no l pretoINE, o valor deve ser igual a zero, e se ele for superior ou inferior, que deve ser valores positivos ou negativos, respectivamente. Os níveis iniciais do líquido definir os pontos de referência para os valores de consumo final, o / n.
   9. Definir os frascos de volta na incubadora durante 24 h. Substituir os capilares numa altura constante ao longo de toda a experiência.
   10. Remover os capilares suavemente a partir dos frascos e medir os níveis de líquido no que diz respeito à linha de marcação preta.
   11. Verifique cuidadosamente o nível do líquido no frasco simulada.
       NOTA: Se os níveis caíram mais de 2 mm, isso indica que a evaporação é alta e os níveis de consumo não são confiáveis.
   12. Amortecer as fichas cuidadosamente com 2 ml de água e inserir um novo conjunto de capilares, como indicado nos passos 2.3.3 - 2.3.10. Definir os frascos de volta na incubadora durante 24 h.
4. determinando preferências
   1. Calcule o consumo total de cada capilar subtraindo-se o nível final do inível nitial no ponto de partida.
   2. Combinar os valores de ambos os capilares com o mesmo alimento (isto é, nonethanol capilares separadamente dos capilares contendo etanol).
   3. Calcular preferência etanol, subtraindo a quantidade consumida a partir dos capilares não-etanol a partir da quantidade consumida a partir dos capilares contendo etanol e dividir o valor por os valores de consumo total de todos os capilares do mesmo frasco.
   4. Calcular a média dos índices de preferência de todos os frascos do mesmo grupo experimental.
      
      NOTA: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), Etanol 1 (E1), Etanol 2 (E2), nonethanol Total (NE Total) = NE1 + NE2, etanol Total (E Total) = E1 + E2, soma total Índice de consumo (total Soma) = total NE + total e, e Etanol preferência (PI)

Resultados

FPreviously, Devineni et ai. mostrou que, quando as moscas de fruta são dadas a opção de consumir alimentos contendo etanol, eles exibem uma forte preferência por alimentos contendo etanol sobre nonethanol contendo alimentos ^6. Mostrado aqui estão alguns resultados representativos que obtivemos quando se examina a preferência etanol inato de moscas macho ingênuos que não foram submetidos ao protocolo de treinamento.

Discussão

Aqui, ilustramos os detalhes de uma abordagem integrada para medir alterações no comportamento de busca de recompensa, com base em trabalhos anteriores descritos por Devineni et al.⁶ e Shohat-Ophir et al⁵. A primeira seção do protocolo usa diferentes tipos de interações sexuais como entrada de experiência, e a segunda seção usa um ensaio de alimentação de duas opções para avaliar o efeito da experiência na preferência pelo consumo de etanol.

Como mostrad...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frascos de Poliestireno 25 x 95 mm FlyStuff		32-109
frascos de plástico estreito flugs	FlyStuff	42-102
18 G e 27 G	pode ser adquirido por qualquer empresa		1,20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") , 0,40 X 13 mm (27 G x 1/2")
10 x 75 mm Tubos de Cultura Descartáveis de Vidro Borosilicato	Kimble Chase	73500-1075
pipetas calibradas 5 μ L	VWR	53432-706	codificado por cores brancas para conter 5 μ L
Óleo Mineral	Sigma-Aldrich	M5904
Sacarose, Grau de Biologia Molecular	CALBIOCHEM	573113
Extrato de levedura em pó para microbiologia	pode ser adquirido por qualquer empresa
Etanol	Sigma-Aldrich	32221
pipetas padrão Ponteiras (micropipetas)	ThermScientific	T114R-Q	volume: 0,1 - 20 μ L (ultramicro)
IDENTI-PLUGS (Plugs de Tubo de Espuma)	Jaece	L800-A	se encaixa na abertura de 6 - 13 mm
IDENTI-PLUGS (Plugs de Tubo de Espuma)	Jaece	L800-D	se encaixa na abertura de 35 - 45 mm
virginator fly stock	bloomington drosophila stock center	#24638
Frascos Estreitos, Bandeja Embalada (PS)	Genesee Scientific Corporation	# 32-109BR
Drosophila Media Recipes and Methods	Bloomington Drosophila Stock Center	http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm
ácido propiônico	Sigma-Aldrich	P5561
ácido fosfórico	Sigma-Aldrich
4-hidroxibenzoato de Methl	Sigma-Aldrich	H3647
Agar Agar pode	ser adquirido por qualquer empresa
farinha de milho	pode ser adquirido por qualquer empresa
Melaço da vovó	B & G Foods, Inc	não indicou
que fermento seco instantâneo	pode ser adquirido por qualquer empresa