Eficiente e Rotulagem de anticorpos por cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain Site-specific

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para introduzir sondas químicas específicas do local em um fragmento de anticorpo, incorporando geneticamente um aminoácido contendo azida e, subsequentemente, acoplando a azida a uma sonda química por cicloadição de azida-alcino promovida por cepa (SPAAC).

Resumo

Atualmente muitas ferramentas químicas disponíveis para introduzir sondas químicas em proteínas para estudar sua estrutura e função. Um método útil é a conjugação de proteínas geneticamente pela introdução de um aminoácido não natural contendo um grupo funcional bioorthogonal. Este relatório descreve um protocolo detalhado para site-specific a conjugação de anticorpos. O protocolo inclui detalhes experimentais para a incorporação genética de um aminoácido contendo azida, e a reacção de conjugação por cicloadição azida-alcino promoveu-deformação (SPAAC). Esta reacção promovida por deformação prossegue por mistura simples das moléculas de reacção a pH e temperatura fisiológicos, e não requer reagentes adicionais, tais como cobre (I) e os iões ligandos quelantes de cobre. Por conseguinte, este método seria útil para a conjugação de proteínas em geral e ao desenvolvimento de conjugados de anticorpo e fármaco (ADCs).

Introdução

Uma vez que a incorporação genética de p -methoxyphenylalanine em Escherichia coli foi relatado, ¹ mais de 100 aminoácidos não naturais (UAAS) foram incorporados com sucesso em várias proteínas. ^1-3 Entre estes UAAS, os aminoácidos contêm grupos funcionais bioorthogonal têm sido extensivamente estudados e representam a maior proporção. Os grupos funcionais bioorthogonal utilizados nos UAAS incluem cetona, ⁴ azida, alcino ^{5, 6} cyclooctyne, tetrazina ^{7, 8} α, amida β-insaturado, ⁹ norbonene, ¹⁰ transcyclooctene, ¹¹ e biciclo [6.1.0] -nonyne.

Protocolo

1. O plasmídeo Construção

1. Construir um plasmídeo de expressão (pBAD-HerFab-L177TAG) que expressam o gene do anticorpo alvo (pBAD-HerFab-WT) com um Sua _6-tag, e substituir o codão para a leucina-177 com o códon de âmbar (TAG) ^27, utilizando técnica de mutagénese dirigida ao local convencional.
   Veja a Tabela de Materiais.
2. Construir outro plasmídeo de expressão (pEVOL-AFRS) contendo os genes para o tRNA ^Tyr evoluiu e aminoacil-tRNA sintetase par (RAA). Use o vector plasmídeo especialmente concebido, pEVOL, para incorporação eficiente do UAAS. Os protocolos de informação plasmídeo e clonagem de....

Resultados

Neste estudo, um fragmento de anticorpo foi local especificamente conjugado com um fluoróforo por incorporação de um aminoácido contendo azida no fragmento e fazendo reagir o fragmento de anticorpo mutante com um cyclooctyne tensas (Figura 1). HerFab foi seleccionado como o fragmento de anticorpo-alvo em que AF foi incorporado como um aminoácido contendo azida. Para escolher o resíduo em HerFab para a substituição com FA, foi analisada a estrutura de cristal de raios-X d.......

Discussão

A incorporação genética de aminoácidos não naturais em proteínas tem várias vantagens sobre outros métodos utilizados para a modificação de proteínas. ^3/1 Uma das vantagens importantes é a sua aplicabilidade em geral a qualquer tipo de proteína. Em princípio, não há limitação na escolha de uma proteína alvo e um local alvo da proteína. No entanto, a substituição de um resíduo estruturalmente ou funcionalmente importante com um UAA pode resultar na alteração da estrutura e função da proteína alvo. Geralmente, .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1. Construção de plasmídeo
		plasmídeo	Opcionalmente, contém o códon de parada âmbar (TAG) na posição desejada. Ko, W. et al. Marcação de anticorpos eficiente e específica do local por cicloadição de azida-alcino promovida por cepa. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmídeo pEvol-AFRS			Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., e Schultz, P. G. Um sistema aprimorado para mutagênese de aminoácidos não naturais em E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B	Invitrogen	C6400-03	Expression
Host Plasmid Mini-prep kit	Nucleogen	5112	200/pacote
Agarose	Intron biotechnology	32034	500  g
Brometo de etídio	Alfa Aesar	L07482	1 g
LB Caldo	BD Difco	244620	500  g
2. Preparação de Cultura
2.1 Eletroporação
Micro pulsador	BIO-RAD	165-2100
Micro cubeta de pulso	BIO-RAD	165-2089	0.1  cm de folga do eletrodo, pacote de 50
Ampicilina Sódica	Wako	018-10372	25 g
Cloranfenicol	Alfa Aesar	B20841	25 g
de Ágar	SAMCHUN	214230	500 g
SOC médio	Sigma	S1797	100 mL
3. Expressão e purificação de HerFab-L177AF
3.1 Expressão de Herfab-L177AF
p-azido-L-fenilalanina (AF)	Bachem	F-3075.0001	1 g
L(+)-arabinose, 99%	Acros	104981000	100 g
Ácido clorídrico, 35~37%	SAMCHUN	H0256	500 mL
3,2 Lise celular
Tris(hidroximetil)aminometano, 99%	SAMCHUN	T1351	500 g
de sal dissódico EDTA di-hidratado, 99,5%	SAMCHUN	E0064	1 kg
Sacarose		Sigma S9378	500 g
Lisozima	Siyaku	126-0671	1 g
3,3 Cromatografia de afinidade Ni-NTA
Ni-NTA	QIAGEN	30210	25 mL
Coluna de polipropileno	QIAGEN	34924	50 / pacote, capacidade de 1 mL
Imidazol, 99%	SAMCHUN	I0578	1 kg
Fosfato de sódio monobásico, 98%	SAMCHUN	S0919	1 kg
Cloreto de sódio, 99%	SAMCHUN	S2907	1 kg
4. Conjugação de HerFab-L177AF purificado com sondas de alcino usando cicloadição de azida-alcino promovida por cepa (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO	FutureChem	FC-6119	1 mg
5. Purificação de
Filtros Centrífugos HerFabAmicon Ultra 0,5 mL	MILLIPORE	UFC500396	96/pacote, 500 μ L capacidade
6. Análise SDS-PAGE de HerFab rotulado e varredura de gel fluorescente
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99,5%	Sigma	10708984001	10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x	Thermofisher	NP0007	10 mL
MES running buffer	Thermofisher	NP0002	500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE géis	Thermofisher	NO0321	12 poços
Coomassie Brilliant Blue R-250	Wako	031-17922	25 g
Typhoon 9210 gerador de imagens de modo variável	Amersham Biosciences

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