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Artigo de método

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

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DOI:

10.3791/54929

⸱

15 de dezembro de 2016

 ,  , 
1Department of Anatomy, Korea University College of Medicine

Neste artigo

Resumo

O estabelecimento de sistemas de cultura para a expansão de células-tronco neurais adultas (aNSCs) permite o exame e a aplicação de aNSCs para terapia. A zona subcalosa (SCZ) foi recentemente reconhecida como uma nova região formadora de neuroblastos em camundongos adultos. Aqui, são descritos métodos para o isolamento, expansão e diferenciação de SCZ-aNSCs.

Resumo

As células-tronco neurais adultas (aNSCs) podem ser usadas para a regeneração do tecido cerebral danificado. As NSCs têm potencial para diferenciação e proliferação em três tipos de células: neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. A identificação de regiões derivadas de aNSC e a caracterização das propriedades de aNSC são críticas para o uso potencial de aNSCs e para a elucidação de seu papel na regeneração neural. A zona subcalosa (SCZ), localizada entre a substância branca e o hipocampo, foi recentemente relatada como contendo aNSCs e continuamente dando origem a neuroblastos. Uma baixa porcentagem de aNSCs da SCZ é diferenciada em neurônios; A maioria das células é diferenciada em células gliais, como oligodendrócitos e astrócitos. Sugere-se que essas células tenham um potencial terapêutico para lesão cortical traumática. Este protocolo descreve em detalhes o processo para gerar SCZ-aNSCs a partir de um cérebro de camundongo adulto. Uma matriz cerebral com intervalos de 1 mm é usada para obter as fatias coronais contendo SCZ e para dissecar com precisão a SCZ de todo o cérebro. As seções SCZ são inicialmente submetidas a uma cultura de neuroesfera. Um sistema de cultura bem desenvolvido permite a verificação de suas características e pode aumentar a pesquisa sobre NSCs. Um sistema de cultura de neuroesferas fornece uma ferramenta útil para determinar a proliferação e coletar os NSCs genuínos. Uma cultura em monocamada também é um sistema in vitro para testar a proliferação e diferenciação. Significativamente, esse sistema de cultura fornece um ambiente mais homogêneo para NSCs do que o sistema de cultura da neuroesfera. Assim, usando uma região cerebral discreta, esses sistemas de cultura serão úteis para expandir nosso conhecimento sobre aNSCs e suas aplicações para usos terapêuticos.

Introdução

NSCs têm características de auto-renovação e diferenciação de múltiplas linhagens. Para confirmar essas propriedades, um sistema de cultura de neuroesferas tem sido amplamente utilizado. O sistema de cultura de neuroesferas foi desenvolvido no início dos anos 1990 e serviu como um sistema padrão de cultura de células-tronco1. Dependendo da potência de auto-renovação, os NSCs proliferam continuamente e geram uma massa celular em uma cultura em suspensão. O número de células e o tamanho da neuroesfera são considerados intimamente associados às propriedades de proliferação dos NSCs. As culturas de monocamada também são amplamente utilizadas para a manutenção e diferenciação de NSCs. Em comparação com a cultura da neuroesfera, o sistema de cultura de monocamada proporciona melhor manutenção homogênea e expansão dos NSCs2. Esses dois sistemas de cultura bem desenvolvidos contribuíram para a caracterização de aNSCs in vitro.

NSCs residem em diferentes regiões do cérebro, como a zona subventricular (SVZ) do ventrículo lateral e a zona subgranular (SGZ) do hipocampo3-5. A zona subcalosa (SCZ) da substância branca subcortical caudal é reconhecida como uma nova região neurogênica6-8. Recentemente, foi relatado que os SCZ-aNSCs têm potencial terapêutico no traumatismo cranioencefálico9. Em comparação com outras regiões neurogênicas, a SCZ reside ao longo da substância branca subcortical. No cérebro humano, a substância branca subcortical ocupa uma região maior do que no cérebro do camundongo10. Portanto, uma compreensão das características das SCZ-aNSCs usando um sistema de cultura in vitro é importante para promover o uso potencial dessas células para regeneração neural. A dissecção precisa da região cerebral desejada é necessária para descartar possível contaminação por regiões indesejadas contendo NSCs ativos ou quiescentes. Por exemplo, aNSCs em regiões não neurogênicas podem ser ativadas e produzir novas células neurais em cérebros lesionados ou durante a cultura in vitro 11. Para obter NSCs da SCZ, as células foram coletadas de fatias de cérebro contendo a SCZ. Em seguida, foi realizada uma microdissecção cuidadosa da região da ZCC com agulha fina. Para gerar a neuroesfera a partir da SCZ, pedaços de tecido SCZ microdissecados foram dissociados em células únicas e depois cultivados como uma suspensão na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Depois que as SCZ-aNSCs formam neuroesferas, elas também podem ser mantidas como neuroesferas ou monocamadas para expansão. Este procedimento também demonstra processos de imunomarcação com vários marcadores para a detecção de NSCs e sua progênie após sua expansão e diferenciação em uma cultura de monocamada. Aqui, um protocolo visual do sistema de cultura SCZ-aNSC é apresentado. Este protocolo contém instruções detalhadas para a microdissecção da região SCZ e para a manutenção e passagem das células.

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Protocolo

1. Preparação de Materiais e Meio de Cultura

  1. Para a dissecção e dissociação do SCZ, enrole a matriz cérebro, lâmina de dois gumes lâmina de barbear, e uma pinça com papel alumínio e, em seguida, esterilizá-los por autoclavagem.
  2. Prepare 50 ml de tampão PBS fria para lavar todo o cérebro do rato.
  3. Defina-se um microscópio de dissecção e preparar os instrumentos cirúrgicos necessários para a dissecção do cérebro (tesouras e pinças) e autoclavados o isolamento do SCZ (seringa de 1 ml, 30 agulha G, matriz cérebro, e uma pinça fina).
  4. Preparação de N2 Médio:
    1. Prepare F-12 / DMEM (+ L-glutamina, + bicarbonato de sódio) forma com 2% B27, 1% suplementos de N2, e 1% de Penicilina-Estreptomicina.
      Nota: O meio de crescimento consiste em factores de crescimento médias e N2 (ml de factor de crescimento epidérmico purificada (EGF) e 20 ng / factor de 20 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico (bFGF2)).
  5. Preparar um tampão de digestão (40 unidades / ml papaína, 2,4 unidades / ml dispase II, e 2% de penicilina-estreptomicina, em PBS) para a digestão de tecido.
  6. Preparação da placa de revestimento e Lamela:
    1. Prepare a poli-L-ornitina (PLO; 0,01%) e laminina (10 ug / mL dissolvidos em dH2O). Para revestir placas de 6 poços para a manutenção de SCZ-aNSCs como uma monocamada ou lamelas 18 mm para a imunocoloração, incubar-los com PLO durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lave-os 3 vezes com DH 2 O. Permitir que as placas e lamelas para secar após a última lavagem.
    2. Em seguida, incubar as placas com laminina durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lave-os 3 vezes com DH 2 O.
      Cuidado: Não seque a laminina, o que afetará a fixação das células.
      Nota: As soluções de revestimento podem ser reutilizados 3 vezes.

2. Isolamento e dissociação do SCZ Adulto

  1. Antes da preparação cultura, colocar a matriz cérebro e lâmina de dois gumes no gelo.
    Nota: Não congelar a matriz cérebro, porque o brain poderia anexar a ele.
  2. Sacrificar um rato (8 semanas de idade) por asfixia com CO2 ou deslocamento cervical.
    1. Cortar a cabeça com uma tesoura afiada após a pulverização de 70% de etanol. Para imobilizar a cabeça, segure ambos os lados da cabeça com força. Cortar a pele com uma tesoura na linha média em sentido caudal-rostral. Isto promove a remoção completa da pele do crânio.
    2. Remova a parte caudal do crânio (posterior ao lambda) em primeiro lugar e, em seguida, inserir a pinça entre o crânio eo cérebro na posição dorsal na linha média. Agarrar o osso parietal esquerda (ou direita) e descasque-o cuidadosamente para fora. Repetir este procedimento para a remoção do outro osso parietal.
      Nota: A desconexão de nervo óptico e remoção das meninges do cérebro tornar mais fácil para separar o cérebro do crânio.
    3. Transferir o cérebro para tampão PBS frio (25 ml) e lave-o duas vezes para remover o excesso de sangue.
  3. Coloque o cérebro na matriz cérebro no gelo e make cortes coronais obter fatias grossas 1 mm. Transferir as fatias de cérebro (1 mm) contendo as regiões SCz que estão localizados na parte posterior do cérebro para um PBS frio num prato de petri de plástico de 35 mm.
    Cuidado: A fim de se obter um plano paralelo de secções coronais, assegurar que a fissura do cérebro é colocado na linha média do cérebro matriz; é fundamental para evitar variações desnecessários nas secções.
    Nota: obter fatias de cérebro em 2-3 mm posterior ao bregma; isto permite a separação do SCZ a partir do SVZ.
  4. Sob o microscópio de dissecção com uma ampliação de baixo, micro-dissecar o SCZ da área de matéria branca do córtex e no hipocampo, com uma agulha de 30G 6,9 dobrada. Em seguida, remova as regiões do córtex acima do SCZ. Coloque a região SCZ dissecados das fatias em um prato de plástico Petri 35 mm no gelo sem PBS frio.
    Nota: A contaminação de regiões extra que contêm neurônios maduros podem afetar a viabilidade de aNSCs e neurosphere formação because eles sofrem morte celular em condições de cultura ANSC.
  5. Usando um 30 G agulha torta, corte imediatamente os tecidos dissecados em pedaços pequenos.
    Nota: Se um tempo maior é necessário para dissecar o tecido SCZ, mergulhar os tecidos dissecados em PBS frio antes de cortar.
  6. Re-suspender o tecido picado com 1 ml de tampão de digestão, o tecido transferir para um tubo de 15 ml contendo 2 ml de tampão de digestão, e incubar durante 30 min num banho de água a 37 ° C.
    Nota: Agitar o tubo a cada 10 minutos para misturar bem.

3. Cultura Adulto Neural Stem Cell Subcallosal Zone-derivado

  1. Toque o tubo suavemente para dissociar o tecido digerido, e em seguida, centrifugar o tubo a 145 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante, re-suspenso do tecido digerido com 1 mL de meio de pré-aqueceu-se N2 para lavar o tampão de digestão, e pipetar suavemente a solução de amostra no máximo 5 vezes usando uma pipeta P1000.
    Nota: Over-trituração com uma estreitapipeta de ponta pode diminuir a viabilidade celular e subsequente crescimento.
  2. Centrifuga-se o tubo a 145 xg durante 5 min. Depois de descartar o sobrenadante, re-suspender o sedimento de células em 1 ml de meio N2.
  3. Prepare 1 ml de meio N2 num prato não-revestido de 6 poços e adicionar 1 mL da suspensão de células para fazer um volume final de 2 ml.
  4. Adicionar EGF (20 ng / ml) e de bFGF (20 ng / ml) em cada poço. Agite suavemente o prato de cultura de 6 poços à mão para misturar os fatores de crescimento adicionados com as células plaqueadas. Manter a placa de 6 cavidades em uma incubadora de CO 2 temperatura de 37 ° C e 5%.
  5. Adicionar EGF (20 ng / ml) e de bFGF (20 ng / mL) a cada poço a cada dia durante 8 dias. Cada terceiro dia, adicionar 200 ul de meios de N2 para manter o volume de 2 ml aproximada do meio.

4. Passaging de NSC como neuroesferas e para culturas em monocamada

  1. Reúna os neurospheres e transferi-los para um novo tubo cônico de 15 ml.
    Nota: O número de neuroesferas (> 50 um de diâmetro) epR bem do SCZ de um único cérebro de rato foi de 64,3 ± 7,31, o que era menos do que a do SVZ (190,5 ± 6.33) 9.
  2. Incubar as neuroesferas com 0,5 ml de tampão de dissociação durante 5 min num banho de água a 37 ° C para dissociar as neuroesferas em células individuais. neurospheres primárias podem ser dissociados em células individuais e mantido ao longo de várias passagens como neuroesferas ou monocamada culturas.
    Nota: Expansão SCZ-aNSCs como uma monocamada é superior a neurospheres porque SCz-aNSCs podem ser passadas> 10 vezes em um formato de cultura em monocamada, mas <5 vezes em um formato de cultura neurosphere.
    Cuidado: EZ-aNSCs exibem agregação forte, e é difícil para dissociar-los em células individuais. Assim, o formato da cultura neuroesfera não é recomendado para a expansão de células de rotina.
  3. Suavemente pipetar a solução amostra cima e para baixo com uma pipeta P1000 menos de 5 vezes e o tubo de centrifugação a 145 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e re-supassar as neuroesferas com 1 ml de meio N2.
    Nota: Mais de trituração com uma ponteira estreita pode diminuir a viabilidade celular e subsequente crescimento.
  4. Para contar as células, fazer uma mistura 1: 1 de suspensão de células (10 uL) e a solução de azul de tripano a 0,4%, e depois contar o número de células vivas em um hematocytometer. Depois de o revestimento de uma placa de 6 poços com PLO / laminina, a chapa células a 2,5 x 10 5 culas / ml com 2 ml de meio para cada poço de N2.
    Nota: As mudanças na densidade celular pode afetar sua condição e potencial de diferenciação.
  5. Manter as SCZ-aNSCs com um tratamento diário de factores de crescimento (2 ml, 20 ng / ml) durante 5 dias, e eles passagem los.

5. Diferenciação de Subcallosal Zona derivados de células-tronco adultas neurais

  1. ANSCs placa sobre uma lamela de 18 milímetros PLO / laminina-revestidas com 1 x 10 5 culas / ml em 1 ml de N2 com factores de crescimento (20 ng / ml) durante a diferenciação dos SCZ-aNSCs.
  2. O dia seguinte,quando as células estão firmemente ligados à lamela, trocar o meio de crescimento com N2 para remover os factores de crescimento.
  3. Após 6 dias, lavar as células diferenciadas com 1 ml de PBS para remover os restos celulares e corrigi-los para a imunocoloração.
    Nota: podem ser de BrdU incorporada no ADN recentemente sintetizado de células em proliferação. Portanto, se desejado, BrdU (10 ug / mL) pode ser adicionado a células vivas antes da fixação das células.

6. Células Estaminais Imunomarcação Adulto Neurais e diferenciado Progenitores

  1. Para a imunocoloração, lavar as células com PBS e corrigi-los com PFA a 4% durante 20 min à temperatura ambiente.
    Cuidado: PFA é altamente tóxico; evitar o contacto com a pele e os olhos.
  2. Remova a PFA 4%, lavar as células fixas com PBS 3 vezes, e em seguida armazená-los a 4 ° Cuntil eles são necessários para a imunocoloração.
  3. Incubam-se as células sobre a lamela com uma solução de bloqueio (3% de albumina sérica bovina e 0,1% de Triton X-100 em 1x PBS) durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente.
  4. Prepare os anticorpos primários em solução de bloqueio fresco e incubar as amostras durante a noite a 4 ° C.
    1. Imunocoloração os aNSCs
      1. Manchar o aNSCs utilizando anticorpos anti-nestina e anticorpos anti-BrdU. Antes de fixação, adiciona-se 20 ug de BrdU para os aNSCs e incubar durante 2 h. Realizar o passo de desnaturação utilizando HCl 2 N durante 20 min a 37 ° Cbefore realizando o passo de bloqueio.
    2. Imunocoloração os progenitores diferenciadas:
      1. Utilizar anticorpos anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) anti-O4, anti-BIII-tubulina, e para marcar os progenitores diferenciadas.
  5. Lavam-se as amostras com PBS 3 vezes e incuba-os com anticorpos secundários conjugados com corantes fluorescentes (1: 500) em solução de bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lavar as amostras 3 vezes com PBS.
    Nota: Utilize anticorpos secundários que correspondem aos anfitriões do primárioanticorpos. Hoechest33343 (1: 2000) é usado para coloração nuclear.
  6. Adicionar solução de montagem a uma lâmina de vidro e prosseguir com a montagem. Observe e imagem da amostra sobre um microscópio confocal de múltiplos comprimentos de onda: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), e Hoechest33343 (405 nm).

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Resultados

Definindo o sistema de cultura para aNSCs da região neurogênica desconhecido é essencial para a compreensão dessas células e para o desenvolvimento de seu potencial uso no reparo do cérebro 12. Sabe-se que as NSC em diferentes estádios de desenvolvimento ou em regiões diferentes se comportam de maneira diferente 3,4. Recentemente, foi relatado que células-derivadas SCZ exibem potenciais diferenciais para a diferenciação neuronal in vivo e in vitro,...

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Discussão

Este documento descreve um protocolo detalhado para gerar NSCs do SCZ do rato adulto e para mantê-los para várias aplicações. Há três passos críticos para o estabelecimento do sistema in vitro cultura necessária para purificar e expandir a EZ-NSC. Em primeiro lugar, é importante para garantir que a região de SCZ é precisamente dissecados a partir de outros potenciais regiões neurogénicos (Figura 1B). Secções espessas e precisos que contêm as regiões SCz foram obtidos com uma matriz cerebral int...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa do Cérebro através da National Research Foundation (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro da Coreia (Grants NRF-2015M3C7A1028790); e por uma doação do Korea Health Technology P&D Project através do Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar, República da Coreia (HI14C3347).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Componentes médios
DMEM/F12 Gibco11320-033+ L-glutamina, + Bicarbonato de sódio
Caneta / StrepInvitrogen15140-122
N2 suplementoGibco17502-048
B27 suplementoGibco17504-044
Fator de crescimento
bFGFR & D233-FB
EGFGibcoPHG0313
Buffer
PBS (10x)BIOSOLUTIONBP007a1x diluição
HBSSGibco14175-095
Dissociattion buffer
Dispase IIRoche04-942-078-001
PapainWorthington3126
AccutaseICTAT-104
Tool
Fine pinçaWPI555229F
TesouraStorzE3321-C
Matriz cerebral (1 mm)RWD68707
Navalha de dois gumesDORCOST-300
Agulha de 30 GSUNGSHIMN1300
MateriaisTubos de
15 mlSPL50015
Tubos de 50 mlSPL50050
Prato de 35 mmSPL10035Prato de Petri
de 100 mmSPL10090Placa de Petri
Lamínula (18 mm)Deckglaser111580
Prato de 12 poçosSPL32012sem revestimento
Prato de 6 poçosSPL32006sem revestimento
< forte > materiais de revestimento< / forte >
PLOSigmaP49570,01%
LamininaGibco23017-01510 mg/ml
Anticorpos primários 
NestinMilliporeMAB353camundongo (1:1.000)
EGFRAbcamab2430coelho (1:1.000)
DCXSanta CruzSC8066cabra (1:500)
Tuj1SigmaT2200coelho (1:2.000)
GFAPInvitrogen13-0300rato (1:1.000)
O4Camundongo MilliporeMAB345(1:500)
BrdUAbcamab6326Rato (1:500)
Anticorpos secundários
anti-camundongo 488InvitrogenA212021:500
anti-camundongo cy3Jackson715-165-151
anti-camundongo 647Jackson715-606-150
anti-coelho 488AlexaA21206
anti-coelho cy3Jackson711-165-152
anti-coelho 647Jackson711-605-152
anti-cabra 488AlexaA11055
anti-cabra cy3Jackson705-165-147
anti-cabra 647InvitrogenA21447
anti-rato 488InvitrogenA21208
anti-rato cy3Jackson712-166-150
anti-rato 647Jackson712-605-153
Immunostaining materials
BSAMillipore82-100-63% BSA com 0,1% Triton X-100 em PBS
Triton X-100usb22686
4% PFABiosesangP2031
Hoechest33342Life TechnologyH3570Corante para coloração de núcleos
prato

Referências

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