Estudar processos dinâmicos de Nano porte Objects no líquido utilizando a Transmissão Microscopia Eletrônica de Varredura

Summary

Este protocolo descreve o funcionamento de um suporte de amostra de fluxo de líquido para microscopia electrónica de varrimento de transmissão de AuNPs em água, tal como utilizado para a observação de processos dinâmicos em nano-escala.

Abstract

Amostras totalmente incorporado no líquido pode ser estudado em uma resolução espacial em nanoescala com Digitalização em Microscopia Eletrônica de Transmissão (STEM), utilizando uma câmara microfluídicos montados no suporte do espécime para a Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e STEM. O sistema microfluídico é composto por dois microchips de silício de apoio janelas de membrana fina de nitreto de silício (SiN). Este artigo descreve os passos básicos de carregamento de amostras e aquisição de dados. O mais importante de tudo é o de assegurar que o compartimento de líquido é correctamente montado, proporcionando assim uma camada de líquido fino e um selo de vácuo. Este protocolo também inclui uma série de testes necessários para realizar durante o carregamento da amostra, a fim de garantir a montagem correta. Uma vez que a amostra é colocado no microscópio eletrônico, a espessura líquido precisa ser medido. A montagem incorrecta pode resultar em um líquido demasiado espesso, enquanto um líquido muito fina pode indicar a ausência de líquido, tal como quando uma bolha é formada. Finalmente, o protocoloexplica como as imagens são tomadas e como os processos de dinâmica pode ser estudada. Uma amostra contendo ambas AuNPs é fotografada em água pura e em solução salina.

Introduction

Convencional Digitalização Microscopia Electrónica de Transmissão (STEM) é limitada pela gama das amostras adequadas para análise, especificamente as amostras secas e sólidas adequadas para a colocação em alto vácuo. No entanto, muitas questões científicas e tecnológicas preocupar materiais e processos em meio líquido em nanoescala. Amostras totalmente incorporado no líquido pode agora ser estudado com STEM usando um conceito que envolve uma câmara microfluídicos montados no suporte do espécime para a Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e STEM ^1. Esta técnica recém-desenvolvida tornou-se cada vez mais popular, já que oferece uma nova visão sobre os processos importantes de vários temas de investigação, incluindo o crescimento, a dissolução, e os processos de agregação de nanopartículas ^{2, 3, 4, 5, 6.} Não apenas metais, mas também biominerals ⁷ e os sistemas biológicos podem ser estudados ^{8, 9, 10, 11.} O carregamento de amostras e aquisição de imagem para STEM em fase líquida é diferente do que para STEM de amostras secas e envolvem um protocolo que requer treinamento dedicado.

O sistema de microfluidos consiste de dois chips de silício de suporte de nitreto de silício janelas (SIN) membrana transparente para o feixe de electrões a 200 keV de energia ¹² (ver figura 1A). Os detalhes das dimensões e da manipulação desses microchips podem ser encontrados em outros lugares ^{12, 13.} A amostra normalmente contém objectos em nano-escala. Neste trabalho observamos nanopartículas de ouro (AuNPs). Os AuNPs são imobilizadas na janela superior (em relação a um feixe de electrões para baixo-viajando) ou flutuar no Liquidentidade. Resolução espacial em nanoescala em STEM é obtida fazendo a varredura do feixe de elétrons ao longo dos AuNPs e coleta de elétrons espalhados transmitidos usando o detector anular escuro Field (ADF) ^9. Os dois microchips são colocados numa pequena ranhura na ponta do suporte TEM fluxo do líquido ¹ (o titular opera tanto para caule e MET mas é referido como o suporte do MET). Uma das micropastilhas contém um espaçador de modo a que um compartimento de líquido é formada entre os microchips. Anéis de vedação em ambos os lados dos dois microchips proporcionam uma vedação de vácuo do líquido do compartimento ¹³ (ver Figura 1B).

O objetivo deste artigo é demonstrar as etapas básicas de carregamento de amostras e aquisição de dados para que os usuários interessados ​​podem encontrar fácil acesso a esta nova técnica emergente. Um sistema disponível a partir de uma companhia específica é utilizado, mas o protocolo é também válido para os sistemas de outras empresas. A técnica émais complexo do que MET convencional e a haste, e um certo número de aspectos práticos deve ser considerado quando se trabalha com um sistema de recipientes de líquido ^13. O mais importante de tudo é o de assegurar que o compartimento de líquido é correctamente montado, proporcionando assim uma camada de líquido fino e um selo de vácuo. Portanto, é muito importante para o trabalho de forma limpa e para evitar a formação de pó durante a preparação e montagem do suporte TEM fluxo do líquido. Em particular, os O-rings e os dois microchips de silício precisam ser isenta de qualquer contaminação. Mesmo as pequenas partículas de pó sobre uma das micropastilhas pode aumentar fortemente a espessura da célula montada, o que pode impedir a consecução de uma resolução espacial útil. Um selo de vácuo é importante para que haja contaminação ou danos será deixado no microscópio electrónico após a experiência. Este protocolo descreve o procedimento de carregamento e vários testes necessários. A operação do microscópio eletrônico é simples, but ele requer alguns passos extras em comparação com a microscopia de amostras sólidas. Com o aumento da espessura líquidos, mais elétrons são absorvidos e espalhados pelo líquido; uma medida da espessura do líquido é essencial. Finalmente, o protocolo explica como as imagens são tiradas e como processos dinâmico pode ser estudada.

Figura 1: celular fluxo líquido para digitalização Microscopia Eletrônica de Transmissão (STEM). (A) Representação esquemática da célula de líquido montado. Dois microchips de silício com janelas de membrana de nitreto de silício (SIN) são posicionadas entre dois anéis de vedação. O líquido é colocado entre a membrana SiN e é assim separada do vácuo no microscópio eletrônico. Uma campanha de exames de feixe de elétrons sobre a amostra. Contraste é obtido a partir de electrões dispersos. As nanopartículas de ouro (AuNPs) são imobilizadas no interior do líquido na membrana de SiN, mas também se pode mover nalíquido. (B) seção transversal esquemática vista lateral da pilha de dois microchips com o-rings. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Figura 2: Procedimento de limpeza dos Microchips Si. (A) em duas provetas são preenchidos com 40-60 ml de acetona e etanol cada. Microchips (B) O Si são colocados no recipiente cheio com acetona. O lado com a membrana SiN deve estar voltado para cima. A reflexão dos dois microchips Si mostra claramente a ranhura na parte de trás de dois microchips. (C) Depois de 2 minutos, as micropastilhas de Si são transferidos para o segundo recipiente enchido com etanol. Após mais 2 min, as micropastilhas de Si são transferidos para uma sala limpa de tecido para a secagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Líquido Fluxo de Eletrônica de Transmissão Microscopy (TEM) Equipamento Holder. (A) O titular TEM fluxo de líquido com tubos de plástico e uma seringa para o fluxo de líquido. (B) A ponta do suporte TEM fluxo do líquido retirado do eixo do suporte, a tampa do compartimento do líquido celular, anéis de vedação, e duas microchips de silício. A tubagem projecta a partir do lado esquerdo da ponta. (C) O compartimento da célula líquido que mostra um anel de vedação, a ranhura para a colocação do microchip. (D) Diferentes pinças em uma superfície livre de poeira (folha de alumínio). (E) A tampa do compartimento da célula líquido com os seus dois anéis de vedação. (F) Dois microchips de silício com janelas de membrana pecado. Esquerda: o microchip amostra sem um espaçador; direita: o microchip tampa com um 200 um espaçador. (G) Um sistema de bomba de microfluidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figuré.

1. Preparação da Microchips

1. Limpeza dos microchips

1. Prepare um espaço de trabalho com um baixo nível de poeira em uma capa laminar fluxo de ar com um filtro de partículas de poeira.
2. Limpar uma lâmina de microscopia de vidro claro com um tecido livre de fibras e etanol puro para a colocação e transporte dos microchips. Colocar a lâmina de vidro sobre um tecido de sala limpa numa placa de Petri.
   NOTA: Evite a utilização de etanol técnica em todos os momentos.
3. Selecione 5 microchips Base (sem um espaçador) para a colocação de amostra e 5 microchips com um espaçador 200 nm de espessura.
   NOTA: As dimensões da janela são de 20 x 400 mm ² e a espessura pecado é 50 nm. Uma vez que existe uma certa tolerância nas dimensões, é recomendado verificar as dimensões utilizando um microscópio de luz.
4. Use pinças revestidas de carbono para remover os microchips da caixa de armazenamento e colocá-las sobre a lâmina de vidro. Pegue os microchips com firmeza, mas com cuidado em seu lolados GN. Lidar com o microchip de tal forma que o lado da membrana do pecado é sempre virado para cima.
   NOTA: Evite tocar a membrana SiN frágil no lado superior. Também deve ter cuidado com a manipulação dos microchips para evitar rachaduras suas bordas afiadas, que podem causar problemas devido a partículas de silício que residem no microchip ou fugas posteriores.
   NOTA: treinamento para o procedimento para remover os microchips da superfície pegajosa pode ser realizado em (barato) microchips fictícios.
5. Colocar os microchips para uma sala limpa de tecidos em uma caixa de Petri. Feche o prato e transferi-lo para o exaustor.
   NOTA: Os passos que envolvem a acetona são realizadas em um exaustor para a segurança química.
6. Pegue dois copos de vidro de 120 ml. Lavar uma proveta com acetona e o outro com etanol para limpá-los. Encher o primeiro com 40-60 ml de acetona e a outra com 40-60 mL de etanol.
   NOTA: É importante o uso de líquidos HPLC-grade também para esta etapa no protocolo.
7. Transferiros microchips para o copo com acetona de modo a remover o protector resistir camada. Mova cuidadosamente o copo com a mão para lavar eficazmente os microchips, mas tenha cuidado para não transformar os microchips de cabeça para baixo - veja a Figura 2.
8. Após 2 min, remover os microchips e transferi-los rapidamente para a taça com o etanol. Mova cuidadosamente o copo à mão com etanol por 2 min para remover qualquer resíduo da camada de resistir. Cobrir o copo com folha de alumínio e transferi-lo para o ambiente de trabalho fluxo de ar laminar.
   NOTA: Não deixe que os microchips secar durante a transferência para evitar a deposição de detritos.
9. Retire os microchips do copo e coloque-os em um novo tecido sala limpa. Deixe-os secar durante alguns minutos e transferir os microchips sobre a lâmina de vidro de microscópio de luz na placa de Petri.
   NOTA: Os microchips molhadas podem facilmente virar em torno, virar de cabeça para baixo, ou ficar com as pinças ao ser libertado. Isto pode ser evitado por prescantar os microchips suavemente sobre o papel de filtro e puxando as pinças de distância na direção horizontal.
10. Fechar a placa de Petri e transferir os microchips para o aspirador de plasma.
11. Colocar a lâmina de vidro com os microchips para dentro do aspirador de plasma. Executar um programa de limpeza 5 min a tornar a superfície da membrana hidrofílica e nitreto de silício para remover hidrocarbonetos.
    Nota: Os ajustes adequados aplicados para o nosso aspirador de plasma são: 70 mTorr, o fluxo de gás de 11,5 sccm de _O2 e 35,0 sccm para Ar, alvo de 50 W para a frente de radiofrequência (RF), 5 W área RF, max refletido RF. Qualquer plasma capaz de induzir uma carga de superfície é adequado.
12. Colocar a lâmina de vidro com o microchip de volta para a placa de Petri, fechar a tampa, e transferi-lo para o microscópio de luz.
13. Examine os microchips sob um microscópio de luz para possíveis rupturas de membranas ou restantes partículas de sujeira. Tome especial cuidado com as áreas de janela e verificar se há pequenas manchas, indicando arupture da membrana. Dispensar microchips com membranas danificadas.
14. Feche a caixa de Petri e armazená-lo no ambiente de trabalho fluxo de ar laminar.

2. Preparação da amostra sobre os microchips

1. Preparar uma solução aquosa AUNP (citrato estabilizado) através da mistura de pequenas quantidades de soluções de reserva contendo 30 nm de diâmetro, AuNPs estabilizado com citrato numa concentração de ~ 3 M.
2. Coloque os microchips em uma superfície limpa e pegajoso em uma caixa de transporte para a deposição de gotículas application / amostra.
3. Coloque uma gota (1-2 mL) da solução de amostra no lado da membrana o pecado do microchip limpa-plasma fresco (usar um microchip sem espaçador) e deixar a solução seca na bancada fluxo de ar laminar.
   NOTA: Este procedimento pode ser repetido de modo a aumentar a concentração de AuNPs na membrana SiN.
4. Aplicar 1 mL de água desionizada para o microchip para a remoção de sal e / ou agentes tensioactivos. Após 30 s, cuidadosamenteremover a gotícula de água com papel de filtro. Deixe os microchips secar ao ar no ambiente de trabalho fluxo de ar laminar.
   NOTA: Um número suficientemente grande de AuNPs terão aderido ao microchip e não serão lavados em água mais.
5. Use os microchips de amostras preparadas dentro de 4 h, como o pecado perde suas propriedades de superfície hidrófila ao longo do tempo, o que pode fazer com que o líquido se comportar de forma diferente durante um experimento. Nota: Consulte a seção de discussão para mais detalhes.
6. Use uma caixa de transporte fechado para o armazenamento e transferência dos microchips.

2. Preparação do Titular Líquido Fluxo TEM

1. Limpeza do porta TEM o fluxo de líquido
   1. Limpe todas as ferramentas (pinças e uma chave de fenda) que estarão em contacto com peças de vácuo, utilizando acetona e etanol num banho de ultra-sons e colocá-los na superfície livre de poeira fornecido por um pedaço de nova folha de alumínio colocados na bancada de trabalho. Trabalho com luvasa evitar a contaminação do suporte TEM fluxo do líquido.
      NOTA: As ferramentas não tem que ser extensivamente limpos, se é certo que eles estão limpos para o trabalho com peças de vácuo. As luvas podem ser evitados se uma é capaz de lidar com o equipamento sem tocar nas peças de vácuo.
   2. Coloque o suporte TEM fluxo do líquido sob a luz do microscópio binocular de tal maneira que a ponta do suporte contendo a câmara de líquido pode ser observada. Veja a Figura 3.
   3. Remover a tampa da ponta do suporte e colocá-lo sobre a superfície livre de poeiras.
      NOTA: A tampa de titânio é sensível a riscos causados ​​por materiais mais duros, como as pinças. Recomenda-se usar uma pinça revestidos com polímero para materiais sensíveis.
   4. Preparar pelo menos 1-2 mL de água pura (grau HPLC).
      NOTA: Se não se utilizar o líquido HPLC-grade, em seguida, recomenda-se verificar se os líquidos utilizados não contêm micro partículas que poderia levar a obstruções do sistema de fluxo; filter a quantidade de água necessária com um filtro de micro-poro.
   5. Usar uma seringa de vidro (1 ml) para lavar o sistema de fluxo de todo com 0,5 ml de água pura. Recomenda-se a utilização de um sistema de bomba de seringa microfluídico. Usar uma pipeta e / ou papel de filtro para remover o líquido a ser ejectado no compartimento da célula o líquido. Teste toda a tubulação para o fluxo de líquido. Seca-se a ponta de suporte depois utilizando papel de filtro e / ou uma pipeta.
   6. Use a luz do microscópio para verificar se a ponta do titular está limpo e seco. Se necessário, lava-se a ponta do suporte com água ou com etanol para remover quaisquer resíduos sólidos que poderiam ter sido deixadas para trás pela solução seca. Remover pedaços de poeira ou restos de fibras também. Remova cuidadosamente estas peças com uma pinça, evitando assim arranhões na superfície de titânio. Além disso, verifique no interior das ranhuras de O-ring e remover os restos de líquido com um pequeno pedaço de tecido sala limpa.
      NOTA: Se o titular não se torne limpo com este procedimento, em seguida, recomenda-separa remover a ponta do suporte e limpá-lo em acetona durante 2 min e em etanol durante mais 2 min, utilizando um banho de ultra-sons.
   7. Inspecione todas as outras partes da ponta (O-rings, tampa e parafusos), sob o microscópio de luz e remover o pó, fibras, etc ...
      NOTA: Ocasionalmente, pequenos pedaços provenientes dos parafusos ou as micropastilhas de Si deve ser removido tão bem. Se necessário, limpar as partes brevemente a vácuo com etanol de grau HPLC. A tampa e os parafusos podem ser limpos com ultra-som, como explicado pela dica. Evite colocar os anéis de vedação com frequência em etanol, uma vez que pode fazer os anéis de vedação quebradiços ao longo do tempo, diminuindo a sua tensão vácuo. O sistema é operado sem graxa de vácuo, mas se ocorrerem problemas de vedação, graxa de vácuo pode ser usado.
   8. Reinserir os anéis de vedação nas respectivas ranhuras do suporte e verificar se eles se encaixam e não se projetam em qualquer lado da ranhura.
   9. Mantenha titular TEM o fluxo de líquido livre de poeira até que o carregamento da amostra (por exemplo,., Cobrindo-o com uma folha de alumínio).
2. Montagem titular TEM o fluxo de líquido
   NOTA: O procedimento a seguir descreve o procedimento de carregamento de microchips em um suporte de amostra com orientação ideal para STEM. Nesta configuração, o microchip base com a amostra será o microchip superior uma vez transferido para o microscópio. Veja a Figura 4. Para MET, a mais alta resolução espacial é obtido na parte inferior da célula de líquido em relação a um feixe de electrões para baixo-itinerante. Assim, os microchips seria montado o contrário.
   1. Use pinças curvas para agarrar o microchip amostra no lado longo e colocá-la no interior da ranhura (bolso) na ponta do suporte TEM fluxo do líquido. Mantenha o lado de SiN virada para cima. Verifique a colocação correta do microchip na ranhura utilizando um microscópio óptico binocular.
      NOTA: Se o O-ring abaixo do microchip não é colocado corretamente, o microchip pode sobressair fROM O slot.
   2. Coloque uma gota de 0,3 mL do líquido filtrado para a experiência sobre o microchip amostra utilizando uma micropipeta. Se necessário, corrigir o microchip no lugar com uma pinça, como as forças capilares da gota pode puxar o microchip para fora do seu bolso.
   3. Use uma pinça de cabeça para baixo curvas para tirar a segunda microchip (aquele com a camada de espaçador). Vire com cuidado o microchip de cabeça para baixo. Coloque o microchip espaçador no microchip de base na ranhura.
      NOTA: Este procedimento precisa ser feito de forma suficientemente rápida para evitar a secagem da gotícula na microchip amostra.
   4. Inspecione o posicionamento correto usando um microscópio de luz binocular enquanto se move um pedaço de material de reflexão de luz abaixo da ponta do suporte da amostra. Ambos os microchips devem estar alinhados exatamente paralela para conseguir a melhor sobreposição das janelas pecado.
      NOTA: No caso das janelas não se sobreponham, os microchips podem ser reposicionados, empurrando de um lado com uma ponta dea pinça, mas evitar mover os microchips muito, como a membrana SiN podem ser facilmente danificados. Alguns microchips possuem uma configuração cruzada (a janela de um microchip é perpendicular à janela na outra microchip); esta configuração facilita o alinhamento das duas micropastilhas ainda também reduz o campo de visão no microscópio electrónico.
   5. Pegue a parte da frente da tampa da câmara de amostra com a pinça e transformá-lo de cabeça para baixo. Sem tocar os microchips, coloque o lado traseiro da tampa na ponta. Lentamente abrir a pinça de tal modo que a tampa repousa unicamente sobre o ramo inferior da pinça. Cuidadosamente abaixe a tampa até que repousa sobre os dois microchips. Retire as pinças.
   6. Verifique novamente o alinhamento das janelas de ambos os microchips. Se necessário, remover a tampa, ajustar o posicionamento das micropastilhas, e posicionar a tampa novamente.
   7. Coloque os parafusos e corrigi-los em seus lugares habituais. Verificar o alinhamento das duas janelas. Euf necessário, remover os parafusos novamente e ajustar os microchips.
      NOTA: Não fixar os parafusos com muita força, pois isso pode causar danos. Um selo de vácuo é conseguido quando os parafusos de apertar apenas.
   8. Verifique a selagem por iniciar um fluxo de líquido através do sistema usando uma taxa de fluxo de 4 mL / min. Se há vazamento é observada em ambos os lados da ponta, isto é uma boa indicação da tensão vácuo.
   9. Transferir o titular da estação de bomba de vácuo e verificar o aperto de vácuo. O nível de vácuo deve atingir pelo menos 10 ^-5 mbar dentro de 5 min de bombeamento.
      NOTA: Recomenda-se testar a estação de bomba com um suporte de manequim antes do uso.
   10. Transferir o titular ao microscópio eletrônico, em seu gabinete para impedir que ele a ganhar pó.
       NOTA: Cada detentor comercial vem com um gabinete.

3. caule de um espécime em líquido

1. Ajustar o microscópio eletrônico para STEM NOTA: A operação do microscópio eletrônico descrito neste protocolo é baseado em procedimentos padrão que podem ser encontrados no manual do usuário. O protocolo descreve o detalhe exigido para além dos procedimentos padrão para aquisição de dados em amostras líquidas.
   1. Inicie o microscópio com STEM modo alinhado. No suporte da amostra, insira uma amostra de teste consiste de um filme de carbono fino com AuNPs. Ajuste as configurações do microscópio STEM da seguinte forma: definir a corrente de sonda para 0,18 nA ea convergência semi-ângulo do feixe de elétrons para 20 mrad, selecionando um tamanho de ponto de 4C e a abertura objectivo de 30 mm. Selecione um comprimento câmera de 8 cm.
   2. Anote a densidade de corrente indicada medido na tela de fluorescência, enquanto o detector ADF está inserido. Remover o suporte da amostra.
      NOTA: Este valor actual é necessário mais tarde, para estimar a espessura do líquido.
   3. Iniciar o fluxo de líquido com água pura. Não exceda um fluxo de 2mL / min.
   4. Insira o suporte TEM fluxo do líquido no microscópio eletrônico e começar a evacuação. Verifique tanto a indicação de vácuo da câmara de pré-vácuo e a duração da evacuação. Se o nível de vácuo é padrão e a duração do processo de bombagem não exceda o tempo normal de evacuação (de cerca de 1 min) por um factor de dois, inserir o suporte.
   5. Abrir a válvula de feixe quando o vácuo da câmara de amostra principal está na gama que permite a sua abertura. Insira o detector ADF premindo o botão ADF.
      NOTA: Este protocolo refere-se a um detector ADF posicionada acima da tela de fósforo do microscópio eletrônico.
   6. Defina o microscópio no modo de aquisição de imagem contínua usando um tamanho de imagem de 512 x 512 pixels, um tempo de pixel de permanência de 2 mS, e uma ampliação de 20.000. Procurar a janela de SiN, traduzindo o estágio no direções x e y.
      NOTA: Os microchips bloquear quaisquer elétrons que passam através da amostra para a detecçãoou; sinal só é visível no local do pecado. Veja a Figura 5. Às vezes, é mais fácil encontrar a janela de SiN, visualizando a tela de fluorescência.
   7. Uma vez que a janela foi encontrado, ajustar as configurações de contraste e brilho (utilizando os respectivos botões) para que a borda da janela torna-se visível. Mover a borda para o centro do campo de vista, premindo os botões de X e Y de tradução da fase da amostra. Pressione o botão de reset da lente objetiva.
      NOTA: O brilho deve ser largamente reduzido em comparação com uma amostra de vácuo em virtude da forte dispersão no líquido.
   8. Proceder por grosso focar a curva fechada na borda da janela do SiN, ajustando a posição vertical (z-translation) da fase de amostra. Verifique se a posição da amostra está na altura eucentric rodando o palco por 5 ° e rodando-a de volta. Características da amostra e no canto da janela do pecado não deve mudar em baixas ampliações.
      
   9. Reajustar a posição vertical, conforme necessário para colocar a borda da janela no meio da área de visualização novamente. Guardar a posição do estágio utilizando o botão de armazenamento do software.
   10. Mover-se para uma posição em que pequenos pedaços de detritos ou outros objetos de alto contraste (por exemplo, AuNPs) estão presentes, traduzindo o estágio no direções x e y. Ajuste o foco da lente objetiva, para que todos os objetos aparecem nítidas no foco.
   11. Adicione nota de a densidade de corrente medida na tela de fósforo visível através do software de funcionamento, indicando o corrente transmitida através do suporte líquido e através da abertura do detector de AAD. Calcula-se a espessura da célula de líquido usando a Equação 1. Prosseguir apenas se o líquido espessura foi determinada e não excede 3 um.
       14
       equação 1
       com t _Sin a espessura da membrana de nitreto de silício amorfo e _água t a espessura da camada de água. O percurso livre médio comprimentos montante a l _SiN = 0,79 mm do pecado, e = l _{de água} = 3,0 mm de água para o detector de abertura semi-ângulo de 35 mrad ^14.
   12. Observar cuidadosamente o líquido nas ampliações menores para garantir que as bolhas de gás não estão presentes. As bolhas de gás pode ser evitada por utilização do fluxo de líquido contínua e sonda de corrente inferior a 5 0. Na.
   13. Traduzir o estágio nas direções X e Y até uma área que contém pelo menos 20 AuNPs has foi encontrado. Defina o tamanho da imagem para 1.024 x 1.024 pixels, o tempo de permanência de pixels a 19 mS, e a ampliação para 400.000. Adquirir imagens de AuNPs aderidas à membrana SiN, premindo o botão de aquisição.
       NOTA: Uma vez que as imagens tenham sido obtidos em que os AuNPs são visíveis com um forte contraste e arestas (veja a Figura 6), pode-se ter certeza de que o experimento está configurado corretamente. No caso de problemas inesperados ocorrem, não prossiga com a experiência, mas certifique-se de resolver a causa.
2. STEM da dissolução da AuNPs
   1. Retirar o suporte TEM fluxo do líquido a partir do microscópio e parar o fluxo de líquido.
   2. Preparar pelo menos 1 mL de uma solução de 0,1 M de cloreto de sódio em água de grau HPLC numa seringa de vidro.
   3. Ajustar o sistema de fluxo a uma velocidade de 20 mL / min e lave o sistema de fluxo de todo com 0,3 mL da solução salina. Use papel de filtro para recolher o líquido a ser ejectado naoutra extremidade do tubo. Em seguida, re-ajustar o sistema de fluxo de 2 mL / min.
   4. Verifique a integridade da janela do SiN usando um microscópio de luz binocular. Se nenhuma fuga for observado, reinserir titular TEM fluxo do líquido para dentro do microscópio.
   5. Verifique a indicação do vácuo da câmara de pré-vácuo e a duração da evacuação. Se o nível de vácuo é padrão e a duração do processo de bombagem não exceda o tempo normal de evacuação (de cerca de 1 min) por um factor de dois, inserir o titular
   6. Coloque a parte posterior estágio do microscópio de volta à sua posição anterior, utilizando a posição estágio armazenado. Defina o microscópio no modo de aquisição de imagem contínua usando um tamanho de imagem de 512 x 512 pixels, um tempo de pixel de permanência de 2 mS, e uma ampliação de 20,000X. Ajustar o contraste, brilho, foco e altura eucentric, conforme descrito nos passos 3.1.7-3.1.9.
   7. Encontre um local de interesse, traduzindo o estágio no direções x e y. Defina o tamanho da imagem1.024 x 1.024 pixels, o tempo de permanência do pixel a 2 microsiemens e a ampliação para 500.000. Gravar uma série de imagens STEM manualmente pressionando o botão de aquisição uma vez que a imagem anterior foi registrada.
      NOTA: As AuNPs começar a dissolver-se assim que o feixe de electrões é digitalizado através da amostra. As partículas fora da área irradiada não é afectado e pode ser observado imediatamente após. O carimbo de tempo é armazenado no cabeçalho da imagem. É também possível usar um software automatizado para a recolha de uma série de imagens em um filme.
3. A desmontagem e limpeza do suporte de MET após o experimento
   1. Quando as experiências de MET em fase líquida são concluídos e o detentor é retraído do microscópio electrónico, limpar o tubo, a câmara de líquido, e seus componentes, a fim de remover quaisquer partículas sólidas ou sal restante que podem influenciar experiências futuras.
   2. Solte o parafuso de trás um pouco para que ele ainda é fixona respectiva ranhura mas a tampa pode ser facilmente removida. Solte o parafuso da frente, removê-lo e colocá-lo em um ambiente livre de poeira.
   3. Remover a tampa e colocá-lo em ambiente isento de poeira para o armazenamento.
   4. Remova os dois microchips do bolso. Separá-los mergulhando-as cuidadosamente em água ou na solução remanescente da experiência. Coloque os microchips sobre papel com o lado da membrana do SIN para cima e deixe-os secar ao ar para análise posterior.
   5. Remova os anéis de vedação e limpar as respectivas ranhuras com água de grau HPLC. Armazenar os anéis de vedação em um ambiente livre de poeira.
   6. Usar uma seringa de vidro (5 mL) para lavar todos os tubos (entrada e saída), cada um com 5 mL de água de grau HPLC. Recolhe-se o líquido com um pequeno copo colocado debaixo da ponta do suporte MET. Após a lavagem, utilizar uma pipeta e / ou papel de filtro para remover o líquido restante a partir do compartimento de líquido.
   7. Inspecione a ponta do porta-TEM e remover resíduos como bordas quebradas do micro siliconebatatas fritas, fibras ou pó. Se o sal é ainda visível, repita o procedimento de limpeza. Devolver os anéis de vedação para os seus sulcos.
   8. Armazenar o suporte do TEM e seus componentes em um ambiente livre de poeira.
4. Alternativa procedimento para 3.2: STEM de mover nanopartículas de ouro
   NOTA: Um procedimento de montagem diferente é necessária para estudar o movimento de AuNPs em líquido.
   1. Omitir o passo 1.2. Coloque os AuNPs sobre o microchip de silício imediatamente antes de inseri-los no Suporte TEM no passo 2.2. Manter a amostra coberta por uma camada de líquido em todos os momentos, a fim de evitar uma forte ligação das AuNPs para a membrana SiN. Os outros passos do protocolo são os mesmos. Uma série de imagens haste é obtido no passo 3.2.6.

Figura 4: Montagem do suporte líquido Fluxo TEM. (A) O compartimento da célula líquido com the menor O-ring colocado na respectiva ranhura. A inserção mostra a vista superior. (B) O microchip de base é colocado no respectivo encaixe. A inserção mostra a vista lateral em tal ângulo que o microchip é visível de reflexão da luz. (CD) Uma gota da solução é adicionada ao microchip. (EG) A colocação do microchip tampa. (HI) Colocação da tampa do compartimento da célula do líquido. (J) de fixação da tampa, com os dois parafusos. (K) montado titular TEM fluxo de líquido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Posicionamento inicial e Focando usando micrografias STEM. (A) Para localizar a janela SiN, o palco é movido para o sig mais brilhantenal. O microchip de silício é fina o suficiente para alguns elétrons de passar por perto da janela. (B) A borda da janela SiN focado mostrando algumas AuNPs aparecem brilhantes na janela de membrana SiN escuro (menos de espalhamento). A borda do microchip é clara, devido ao espalhamento excessivo. (C) A focagem é feito no canto da janela do pecado. As imagens mostram sub-focalizado, em foco, e situações de sobre-foco. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Results

O titular TEM fluxo líquido foi usado para estudar o comportamento de AuNPs em líquido. AuNPs foram imobilizados de forma estável na membrana pecado em água pura e foram fotografadas com a resolução nanoescala usando STEM em fase líquida (Figura 6). Excelente contraste foi obtido sobre o ouro fortemente de dispersão. A densidade de corrente na tela de fósforo medida para uma amostra seca foi de 20 pA / cm², enquanto se elevava a 8 pA / cm² com o titular TEM fluxo do líquido inserido. Utilizando a Equação 1, t = _água de 2,4 ± 0,5 um, muito maior do que o que se esperava com base na espessura do espaçador de 200 nm. No entanto, a espessura não é demasiado grande para a imagem dos AuNPs com resolução espacial nanométrica. A espessura líquido era mais espessa do que a 200 nm, definido pelo separador devido ao abaulamento da SiN membranas, não-planicidade das micropastilhas, e detritos que residem no microchip.

16, embora os produtos da radiólise reactivos (e ^- _aq, H ^•, H ^+, OH ^•) proveniente da interacção do feixe de electrões com água pode oxidar individuais átomos de ouro, levando a uma mudança da forma da AuNPs ^15. No entanto, quando o sistema de escoamento do líquido foi usado para introduzir iões cloreto numa segunda experiência, a estabilidade dos AuNPs alterado. Os iões de cloro são capazes de estabilizar átomos de ouro oxidados sob a forma de tetrachloroaureat, AuCl ₄ ^-. A Figura 7 mostra que as AuNPs lentamente dissolvidos durante uma série de lapso de tempo de imagem STEM, semelhante aos resultados relatados anteriormente ^16. Para a taxa de dose de elétrons usado, levou ~ 300 s para dissolver os 30 AuNPs tamanho nm-.

Os movimentos de AuNPs em wate R foram estudados numa terceira experiência (Figura 8). Antes do experimento, o suporte TEM fluxo do líquido foi limpa de modo a remover quaisquer vestígios de sal. Que difere do primeiro experimento, uma abordagem alternativa a preparação da amostra foi utilizado para alcançar uma fixação mais fraca das AuNPs para a membrana ¹⁴ SiN. Nesta experiência, a solução foi colocada AUNP na micropastilha de silício e montada no suporte TEM fluxo do líquido sem deixar que a solução seque. Desta forma, os AuNPs facilmente separado da membrana pecado sobre imagiologia à taxa de dose utilizada. Alguns dos AuNPs afastou-se do campo de visão para as soluções a granel, enquanto os AuNPs restantes mantiveram-se dentro do campo de visão em estreita proximidade com a janela do pecado. Foram observados movimentos destes AuNPs, e eventualmente eles aglomeradas. Depois de um tempo, esses aglomerados também separado da membrana SiN e mudou-se para fora do campo de visão e na solução.

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Figura 6: A digitalização Microscopia Eletrônica de Transmissão (STEM) Micrografia da AuNPs 30 nm de diâmetro no topo de uma camada de água pura. A imagem mostrada é uma área selecionada da imagem original. O tamanho da imagem foi de 1.024 x 1.024 pixels, o tempo de permanência do pixel foi de 19 mS, o tamanho do pixel foi de 0,73 nm e, a ampliação foi 400,000X. A dose de electrões se assim 7,1 x 10 ^{4-E -} / nm². A densidade de corrente medida na tela de fósforo foi de 8 pA / cm ^2, de modo que a espessura do líquido foi calculada a ascender a 2,4 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Série Time-lapsede micrografias caule de AuNPs em Saline. (AD) Imagens extraído da série time-lapse de imagens STEM no s intervalos de 30. Os AuNPs gradualmente se dissolvem em líquidos, como uma consequência da presença de iões cloreto. O tempo de permanência do pixel foi de 2 mS, o tempo fotograma da série lapso de tempo foi de 1,75 s, o tamanho do pixel foi de 0,44 nm e, a ampliação foi 500,000 ciclos. A dose de elétrons por imagem foi de 1,2 x 10 ⁴ e ^- / nm². A espessura de líquido foi de 2,4 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: STEM Micrografia da AuNPs em movimento na água pura. (A) da membrana pecado com AuNPs, dos quais vários são selecionados com setas. (B) faixas de movimentodos AuNPs selecionados (ver A). Alguns AuNPs afastar-se do campo de visão durante o tempo de imagiologia. Os AuNPs restantes mover-se lateralmente ao longo da membrana pecado e começar a aglomerar. Ao atingir um tamanho crítico aglomerado, que é entregue a partir da membrana e afastar-se do campo de pixel de view.The tempo de permanência foi de 1 mS, o tempo de estrutura foi de 0,52 s, o tamanho do pixel foi de 1,8 nM, e a ampliação foi 120,000X. A dose de elétrons por imagem foi de 3,5 x 10 ² e ^- / nm² ea espessura líquida foi de 2,4 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O protocolo descrito permite haste do AuNPs em um líquido, incluindo a observação de processos dinâmicos. A montagem do suporte é uma técnica fácil de aprender. No entanto, vários aspectos devem ser considerados quando se trabalha com o titular TEM fluxo do líquido. Por exemplo, as arestas quebradas do microchip Si ou partículas grandes de os anéis de vedação pode resultar em fuga de líquido da célula. Por outro lado, as partículas grandes (> 200 nm, por exemplo, pó ou Si detritos) na membrana SiN pode resultar num aumento da espessura da célula de líquido, que conduz a um baixo contraste de imagem ou a uma baixa resolução espacial e pode até causar janelas pecado a quebrar. Importante, resíduos de sal ou outros produtos químicos podem influenciar o resultado dos experimentos de uma forma indesejada. Portanto, é crucial que as diferentes etapas de preparação das amostras e montagem titular são realizadas com cuidado e em um ambiente limpo e livre de poeira.

A espessura da ce líquidoLL determina a resolução possível, assim como o contraste de imagens obtidas ^17. Esta espessura pode ser ajustada por intermédio de separadores localizados em um dos dois microprocessadores de Si. Dependendo das dimensões da amostra, as diferentes espessuras da célula líquido pode ser realizado. Para o estudo de AuNPs, é possível utilizar pequenas espaçadores (200-500 nm), enquanto que as células eucarióticas inteiros precisa espaçadores maiores de até 5 um. A espessura da célula de líquido é ainda influenciada pelo abaulamento das janelas de membrana SiN resultantes da diferença de pressão entre a célula e o líquido de vácuo envolvente. Este efeito torna-se mais pronunciada com janelas de membrana SiN maiores. Assim, de modo a minimizar a espessura da célula de líquido, é recomendado o uso de janelas de membrana SiN pequenas. No caso, é difícil encontrar uma sobreposição entre duas pequenas janelas, eles podem ser montados numa configuração cruzada utilizando um microchip de base diferente. configurações alternativas largEly evitar abaulamento e consistem de um microchip ¹⁸ ou membrana monolíticas janelas sustentados por pilares ^19, mas essas desvantagens exposição sobre o carregamento da amostra. Um dos aspectos mais difíceis da tecnologia atual é a falta de um controle preciso sobre a espessura líquida. Muitas vezes, o líquido é muito mais espessa do que o esperado a partir das dimensões espaçadores utilizados, como foi mostrado aqui. Vários grupos utilizaram câmaras fechadas líquidos ^{4, 20, 21, 22;} estes sistemas têm algumas vantagens em relação à resolução espacial, como a espessura do líquido pode ser reduzida através da indução de uma bolha no líquido. Em alternativa, as janelas SiN pode ser forçado a entrar em colapso, o que leva a uma camada mais fina de líquido. Em terceiro lugar, o gabinete de outras janelas mais finas existe (por exemplo, o grafeno) ^23, também resultando em líquidos muito mais finodo que é possível com o sistema descrito neste protocolo. No entanto, é impossível para o fluxo de líquido em tais sistemas.

Como para qualquer técnica de microscopia de alta resolução, deve ser considerado um número de aspectos experimentais. O aspecto mais importante, é a interacção do feixe de electrões com o líquido ou a amostra. Além de danos de radiação, o que limita a resolução espacial possível para muitas amostras sólidas ^24, as amostras líquidas também são influenciadas pelos electrões gerados produtos de feixe ^{15, 25} de radiólise. Uma vez que estes produtos podem influenciar a experiência, a interpretação dos dados cuidadosas e design experimental são fundamentais ^26. As configurações do microscópio deve ser escolhido de acordo com os objectivos de um estudo particular. STEM ADF é mais poderoso para as nanopartículas de imagem de alto número atômico (Z) em maiores espessuras da célula líquido, while TEM dá um melhor contraste de materiais de baixo-Z e é tipicamente mais rápido, mas requer mais finas camadas líquidas ^3. Em vez de usar o detector ADF, o (BF) detector Campo brilhante é por vezes utilizado para a imagem da célula líquido, desde BF STEM é vantajoso para imagiologia materiais de baixo Z em camadas espessas ^27. Com o aumento da espessura da célula de líquido, é necessário mais atual. No entanto, isto também aumenta a concentração de produtos de radiólise e aumenta os danos da radiação. Deve também ser notado que uma inversão de contraste é observado no detector de ADF para líquidos muito grossas (> 10 uM para água).

As condições foram alteradas líquidos entre as nossas experiências, removendo o suporte do microscópio e troca tanto a amostra e o líquido. Para além da alteração da concentração de sal, é facilmente possível mudar as outras propriedades do líquido que flui através de diferentes líquidos (por exemplo, um podeusar soluções tampão, a fim de definir um pH específico ou ¹⁶ podem introduzir soluções orgânicas ou outros aditivos). É também possível mudar o líquido enquanto que o suporte é ainda inserido no microscópio de líquidos fluindo através do sistema de microfluidos. No entanto, neste caso, não se sabe em que ponto de tempo o líquido para as mudanças de amostra. É também digno de nota que os microchips de apoio eléctrodos estão disponíveis, assim experiências electroquímicas nanoescala pode ser levada a cabo ^28.

Os objectos de estudo não estão limitados a AuNPs em água, mas uma grande variedade de amostras pode ser estudada usando o protocolo descrito acima, incluindo sílica, óxido de titânio, e polímeros. Se os movimentos dos objectos são demasiado rápido para capturar uma imagem em dentro da aquisição, a viscosidade pode ser reduzida por uma ordem de magnitude, utilizando uma mistura de 50% de glicerol e 50% de água.

A partir dos pontos acima mencionados,um número de vantagens, possibilidades, e também desvantagens tornam-se aparentes. Quando se trabalha com a haste de fase líquida, as suas desvantagens mais importantes a considerar são os seguintes: 1) qualquer experiência é influenciada pela interacção dinâmica do feixe de electrões com toda a amostra (o objecto sob observação, o líquido, e as membranas SIN); 2) o tratamento de amostras é tedioso, e muitas vezes é difícil de conseguir uma camada fina de líquido, porque a amostra ou as micropastilhas contêm algumas partículas de tamanho micrométrico; 3) a espessura do líquido normalmente difere grandemente da espessura destina definido pelo espaçador; e 4) a resolução espacial e contraste depende fortemente da espessura do líquido e a diferença entre a densidade de mudança do objecto sob observação e o líquido.

Atualmente, existem amplas métodos para a microscopia de objetos em líquido com resolução espacial nanométrica. Microscopia eletrônica em gelo amorfo é uma técnica poderosa ^29,mas os procedimentos experimentais envolvidos são delicadas, nem todos os experimentos permitem a preparação da amostra em gelo, e as experiências resolvidas no tempo são impossíveis. Microscopia de raios X ^{30, 31} pode, em princípio, ser utilizados, mas tem uma resolução espacial limitada e não estão amplamente disponíveis em laboratórios. Microscopia de força atômica em líquido foi estabelecida, mas é uma técnica de superfície ^de apenas ^{32, 33, 34, 35.} A microscopia de luz não exibem resolução espacial suficiente. No presente, a microscopia de electrões no estado líquido parece ser a técnica mais poderosa para microscopia directa de objectos em nano-escala e os processos em líquido.

TEM-fase líquida e STEM ainda não são técnicas de análise de rotina, mas ainda estão em desenvolvimento. O número de parâmetros a ter em conta é considerável, e é ofteN difícil de reproduzir os resultados experimentais. Além disso, os dados quantitativos é difícil de obter, porque os efeitos sob investigação estão interligados com os processos que ocorrem como um resultado do feixe de electrões. O protocolo aqui descrito destina-se a padronizar o protocolo experimental, representando, assim, para todos os aspectos de bases relevantes do experimento. Esperamos que este protocolo vai levar a melhor reprodutibilidade do trabalho experimental neste campo emergente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio de luz binocular	Leica	M60 CMO
Mircoscópio eletrônico de transmissão de varredura com corretor de aberração esférica	JEOL	ARM200F
Porta-amostras TEM de fluxo líquido	DENS Solutions	Ocean
Bomba de seringa microfluídica	Harvard Scientific	PicoPlus
Limpador de plasma	Gatan	Solarus950
Chemicals
Acetona, Rotisolv  Plus para HPLC	Sigma-Aldrich	7328.2
Água, chromasolv Plus para HPLC	Sigma-Aldrich	34877-2.5L
Etanol, Rotisolv HPLC grau	Carl Roth	P076.2
Citrato coloidal de ouro estabilizado, diâmetro 30 nm	British-Biocell	EM. GC20
Materials
Base microchips de silício com membranas de nitreto de silício de 50 nm de espessura e dimensões de 20 µ m x 0,40 mm	DENS Soluções	para sistema
Microchips de silício espaçadores com membranas de nitreto de silício de 50 nm de espessura, dimensões de 20 µ m x 0,40 mm, e espessura do espaçador de 200 nm	Soluções DENS	para sistema
Tubulação de peek microfluídica	Upchurch Scientific	1570
Pinças de plástico
(corpo de aço inoxidável antimagnético antiácido com pontas ESD PVDF (SV))	ideal-tek	2ASVR.SA
pinças de aço dobradas revestidas de Teflon (EMS SA com "PTFE" Revestimento)	Ciências de Microscopia Eletrônica	78322-7Te
Pinças de aço de bico largo revestidas com Teflon (Revestimento EMS 2A "PTFE")	Ciências de Microscopia Eletrônica	78322-2ATe
Seringa Hamilton, 1 mL, estanque a gás (Modelo 1001 TLLX SYR)	Hamilton	81323
Tecido de sala limpa Sontara Micropure AP (224 x 224mm)	DuPont	Sontara MicroPure