Corrida roda e complexidade ambiental como uma intervenção terapêutica em um modelo animal de FASD

Resumo

O exercício cardiovascular e estimulantes experiências em um ambiente complexo ter benefícios positivos em várias medidas de neuroplasticidade dentro do cérebro de roedores. Este artigo irá discutir a implementação destas intervenções como um "superintervention", que combina corrida roda e complexidade ambiental e abordará as limitações dessas intervenções.

Resumo

O exercício aeróbico (por exemplo, roda de corrida (WR) amplamente utilizado em pesquisas com animais) impacta positivamente muitas medidas de potencial neuroplastic no cérebro, tais como taxas de neurogênese adulta, angiogênese e expressão de factores neurotróficos em roedores. Esta intervenção também foi mostrado para mitigar os aspectos comportamentais e neuroanatômicos de os impactos negativos da teratogens (ou seja, a exposição de desenvolvimento a álcool) e neurodegeneração relacionada com a idade em roedores. complexidade Ambiental (CE) foi mostrado para produzir inúmeros benefícios neuroplásticas em estruturas corticais e sub-corticais e pode ser acoplado com a roda de corrida para aumentar a proliferação e sobrevivência de novas células do hipocampo de adulto. A combinação destas duas intervenções fornece um "superintervention" robusto (WR-CE), que pode ser implementada numa variedade de modelos de roedores de distúrbios neurológicos. Vamos discutir a implementação de WR / CE e seu constituinteintervenções para utilização como uma intervenção terapêutica mais forte em ratos utilizando o modelo animal de exposição pré-natal ao álcool em humanos. Também vamos discutir quais elementos dos procedimentos são absolutamente necessários para as intervenções e quais podem ser alterados dependendo da pergunta ou instalações do experimentador.

Introdução

Elevando em diferentes ambientes tem sido conhecido por causar mudanças em várias medidas de bem-estar neurológica. Muitos estudos olhar para os efeitos benéficos da criação em um ambiente complexo (CE) começando com uma pesquisa inovadora pela Diamond e Rosenzweig (por exemplo, ^{1, 2)} e Greenough (Por exemplo, ^{3, 4).} CE foi demonstrada para ter um efeito positivo sobre inegáveis alterações sinápticas e celulares no cérebro ^{5, 6, 7.} CE pode afectar uma multiplicidade de regiões do cérebro, incluindo o hipocampo ^{8, 9} e córtex visual ^{10, 11,} estriado ventral ^{12, 13,} bemcomo função neuroimune ampla-cérebro (revisto em ^14). Interesse particular tem desenvolvido a partir dos estudos sobre hipocampo quando foi demonstrado que a CE, pode aumentar a taxa de sobrevivência de células de grânulos de nascidos de adultos do giro denteado através de plasticidade dendrítica ^{9, 13.} Este último ponto reuniu muito interesse devido ao crescente corpo de literatura indicando que o exercício cardiovascular promove neurogênese adulta, tanto no cérebro saudável e danificou ^{15, 16, 17, 18.} Execução de rodas (W) é um fácil de implementar forma de atividade cardiovascular voluntário que tem sido mostrado para ser benéfico em modelos de roedores de distúrbios neurológicos ou envelhecimento ^{17, 19, 20.} WR afecta a expressão de factores de crescimento tanto no sistema nervoso central e periférico ^{21, 22, 23.}

Combinando (subsequentemente) WR e CE numa "superintervention" (WR-CE) (isto é, 12 dias de WR seguido por 30 dias em CE) proporciona um aumento robusto em adultos neurogenesis hipocampo e aumento da sobrevivência das células recém-proliferadas ^8, o efeito que, no modelo animal de SAF não é alcançada pelos componentes individuais (ver abaixo). Desde ambos os componentes do WR-CE afectam uma diversidade de estruturas dentro do cérebro ¹³ (WR revisto em ^22, CE revisto em ^24), a execução dessa intervenção pode ser facilmente aplicada a modelos de roedores de ambos os modelos início da vida de desenvolvimento e posteriores do neurológica impairment (por exemplo, álcool exposição neonatal, envelhecimento, estresse precoce).

nt "> Integração da WR-CE nos períodos adolescente e início de adultos (ou seja, dias pós-natal 30 - 72) pode melhorar alguns dos efeitos negativos de um modelo de rato de perturbações do espectro do alcoolismo fetal (FASDs) ⁸ Uma coleção de estudos. demonstraram que os roedores expostos ao álcool a partir do dia pós-natal (PD) de 4 a 9 de exibição déficits significativos em medidas neuroanatómicos como complexidade dendrítica ^25, o desenvolvimento do cerebelo ^{26, 27} e capacidade de resposta neuroimmune ^28, bem como manifestações de prejuízo no aprendizado e na memória ^{29, 30, 31} . Mesmo uma quantidade reduzida de exposição ao álcool dentro desta janela de tempo (ou seja, PD 7 a 9) pode levar a déficits de aprendizagem e memória em ratos adolescentes e adultos ³² enquanto algumas estruturas já não vê sigimpairment neuroanatômica signi- ^27. Muitos desses déficits -, além de deficiências comportamentais em tarefas dependentes do hipocampo - foram atenuados após a exposição a este paradigma WR-CE ^{8, 33} ou WR sozinho ^{25, 31.} Embora WR sozinho tem sido amplamente utilizada uma intervenção, a combinação de WR-CE ainda não foi utilizado na literatura, apesar da sua capacidade de manter os benefícios relativamente mais curto prazo de WR ^8. Este artigo irá discutir a implementação da intervenção WR-CE durante a adolescência. Embora este paradigma é usado no contexto da exposição precoce álcool pós-natal, que pode ser introduzido para vários modelos de roedores para avaliar o potencial para o cérebro neuroplasticidade nos modelos de perturbações cerebrais.

Protocolo

Declaração de Ética: O protocolo seguinte foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Delaware.

1. Exposição do Desenvolvimento (ou Modelo de Binge-como a exposição ao etanol)

1. Em PD3, determinar o sexo de cada animal e cross-promover quaisquer animais se necessário para manter o tamanho da leitegada (8 animais) e distribuição por sexo (4 machos: 4 fêmeas) consistente dentro de cada ninhada.
   NOTA: É importante para manter o tamanho da leitegada e distribuição por sexo tão consistente quanto possível, para evitar problemas metodológicos. Embora este protocolo usa 8 filhotes (4 homens e 4 mulheres) por ninhada, os tamanhos da maca alternativos ou distribuições de sexo pode ser adaptado às necessidades do projeto experimental.
2. Por via subcutânea injetar uma pequena quantidade de tinta preta Índia nas patas para identificar os animais dentro de cada ninhada.
3. Pseudo-aleatoriamente atribuir ninhadas como experimentais (contendo 50% de controlo da entubado simulada (AE exposta-álcool) e 50% (SI) pups) ou mamar controle (SC) (animais que não sejam objecto de nenhuma intubação, recorte cauda, ​​ou protocolos de separação de PD 4-9, exceto para a pesagem diária e orelha-perfuração).
   1. Para manter o tamanho do grupo consistente, atribuir o dobro de ninhadas experimentais como ninhadas SC.
4. Pesar cada animal, em seguida, devolvê-lo à sua gaiola. Pesagem de animais deve ocorrer diariamente durante o período de intubação (DP 4-9).
   1. Remova todo o lixo da barragem.
   2. Coloque filhotes na almofada aquecida.
   3. Grave o peso de cada filhote individual.
5. Em PD4, depois de pesar cada animal calcular a quantidade de álcool necessária para um total de 5,25 g / kg / dia por cada animal (com base no peso das crias a partir do passo 1.4) ^8.
   1. Administrar álcool como 11,9% de etanol-em-substituto do leite (vol / vol).
6. A partir de 09:00, remover um filhotes de maca da mãe de cada vez.
7. Administrar o etanol-in-leite para cada filhote AE 34.
8. Sham-entubar cada filhote SI ^8.
9. Repita os passos 1.5. através de 1.8. para cada ninhada experimental.
10. Duas horas após a primeira dose, repetir o procedimento de dosagem (1,5 passos através de 1,8) para uma segunda dose de álcool.
11. Uma hora e meia após a segunda dose de álcool (o ponto em que o conteúdo de álcool no sangue diária de pico é alcançada), recolher e sangue centrífuga dos filhotes AE e SI através da cauda de recorte para o futuro de álcool no sangue de análise de conteúdo ^35.
    1. Recolha de 60 mL de sangue.
    2. Coloque sangue num tubo de microcentrífuga de 1 mL. sangue centrífuga de 1,5 g durante 25 min.
    3. Recolher cuidadosamente o soro sobrenadante do tubo de centrífuga e poupar para a análise de conteúdo de álcool no sangue futuro.
12. Repita o procedimento de dosagem (passos 1.5 através de 1.8) usando leite em vez de etanol no leite para evitar déficits nutricionais de incapacidade de enfermagem em AEfilhotes.
    1. Execute um total de 2 doses de leite suplementares 2 h separados no PD 4.
13. Repita os passos 1.4 a 1.12 (excepto para o passo 1.11) em DP 5-9.
14. Após a dose de leite suplementar final sobre PD9, orelha perfurar todos os filhotes para a identificação na gaiola CE.
    1. Coordenar ouvido perfurado com alguma medida de número de maca ou identificador (por exemplo, ninhadas ímpares dentro de uma coorte seria obter a sua orelha esquerda perfurada enquanto os animais de ninhadas de número par iria ficar orelha direita perfurada). Isto tornará mais fácil para identificar os animais na gaiola CE deverá vários animais de ninhadas diferentes têm o mesmo padrão pawmark.

2. O desmame

1. Em PD 23, casa todos os animais em gaiolas de 2-3.
   1. Assegurar que todos os animais alojados na mesma gaiola são do mesmo sexo.
   2. Incluir um SC, um SI, e um animal por gaiola AE quando possível.
   3. Minimize o número de companheiros de gaiola thAT são da mesma ninhada.
   4. Certifique-se de todos os animais são capazes de acesso a alimentos e água.

Corrida 3. Roda

1. No PD30, destinar metade das gaiolas com animais a WR. Casa estes animais em gaiolas com livre acesso à roda de corrida de aço inoxidável anexado.
   1. Certifique-se de que as rodas têm um contador para avaliar o número total de rotações.
2. Pesar todos os animais em PD 30 e PD 36.
3. Verifique o número de voltas de cada roda às 9 da manhã todos os dias.
4. Deixar os animais em sua respectiva condição de habitação para 12 dias.

4. Complexidade Ambiental

1. Prepare a gaiola CE, antes de 09:00 no dia que corresponde ao PD 42 para animais experimentais.
   1. Obter um 30 "x 18" x 36 "gaiola de aço galvanizado.
      NOTA: A gaiola deve ter vários níveis, ser capaz de suportar o peso de vários ratos, ser preenchido com padrãoroupa de cama, e tem vários locais para prender garrafas de água e dispensadores de alimentos.
   2. Coloque novela, objetos coloridos de tamanhos variáveis ​​e formas na gaiola.
      1. Coloque 6 grandes brinquedos na gaiola CE. Assegurar que cada brinquedo é grande o suficiente para 3 ou mais ratos para interagir com simultaneamente.
      2. Coloque 6 brinquedos médias na gaiola CE. Assegurar que cada brinquedo é grande o suficiente para 3 - 4 ratos para interagir com simultaneamente.
      3. Coloque um lote (pelo menos 20) de brinquedos mais pequenos na gaiola CE.
      4. Use brinquedos de cores diferentes, formas, tamanho, etc. novidade é crítico para esta intervenção (ver discussão).
   3. Coloque dois pratos de comida em extremidades opostas da gaiola.
   4. Colocar duas garrafas de água em extremidades opostas da gaiola.
2. Às 9 horas da manhã de PD 42, pesar todos os animais e realocar os animais WR para a gaiola CE. Cada gaiola CE deve conter 9 - 12 animais.
   1. Certifique-se de que nenhum animal têm ambos o mesmo pawmark e orelha-punpadrões ch.
3. Verifique todos os alimentos e água diariamente.
4. De dois em dois dias, remover os brinquedos da gaiola CE e substituí-los (de acordo com o passo 4.1.2.).
5. A cada três dias, limpar a gaiola CE.
   1. Retire os animais da jaula CE e colocá-los em gaiolas de detenção temporária de 2 - 3 animais.
   2. Remover tudo do leito a partir do fundo da gaiola.
   3. Retornam os mesmos brinquedos para a gaiola, a menos que este dia coincide com o cronograma de substituição brinquedo (de acordo com o passo 4.4.).
   4. Substitua toda a comida e água.
   5. Substitua os ratos na gaiola CE.

5. Tissue Collect

NOTA: recolha de tecidos (por exemplo, a perfusão com paraformaldeído) e de armazenamento (por exemplo, congelamento, embebidos em parafina) pode ser realizada com uma variedade de métodos. A seguir irá explicar o processo de perfusão com 4% de paraformaldeído em 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (4% de paraformaldeído em PBS) Solução a ^8.

Atenção: O paraformaldeído é cancerígeno e pode também causar irritação da pele, reacção alérgica cutânea ou lesões oculares. Use proteção para os olhos / pele adequado.

1. Expor um rato de cada vez ao isoflurano para anestesiar levemente o animal.
2. Injectar por via intraperitoneal a ratos com 2 ml / kg de mistura de cetamina / xilazina (1,5 mL xilazina misturado com 10 mL de cetamina).
   NOTA: A cetamina e xilazina são ambos em concentrações de estoque de 100 mg / mL antes de combinar para mistura de injecção.
3. Depois de rato não é mais sensível, perfundir o animal com fosfato 0,1 M de solução salina tamponada (PBS; pH = 7,2) seguido por paraformaldeído a 4% em PBS (pH = 7,2).
4. Remover cérebro e armazenar em paraformaldeído a 4% em PBS a 4 ° C durante 48 h.
5. Após 2 dias, a transferência de solução de sacarose a 30% adicionado a 4% de paraformaldeído em PBS a 4 ° C.

Resultados

A fim de avaliar o efeito da intervenção super, temos de olhar para os efeitos de cada um dos seus elementos constitutivos - WR e CE - em nossas medidas de interesse. As Figuras 1 a 3 (abaixo) apareceu em uma publicação anterior utilizando este paradigma ^8. Figura 4 apareceu em uma tese de doutoramento ^36. Estes dados ilustram o impacto da WR-CE sobre a neurogênese adulta hipocampal no giro...

Discussão

No protocolo anterior, nós demonstramos uma intervenção oportuno resgatar déficits neuroanatómicos após exposição neonatal álcool. Esta intervenção poderá ser usado como um agente terapêutico em outros modelos animais, devido à robustez de cada um dos componentes da intervenção. Actividade cardiovascular voluntária sob a forma de WR foi mostrado para beneficiar várias resultados comportamentais ^{38, 39} e induzir alterações plásticas funcionais em regiões do céreb...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fêmea grávida Long Evans Rats	Envigo (Anteriormente: Harlan, Inc.)		O tamanho médio da ninhada é de 8 a 10 filhotes
Black India Ink	Higgins (Chartpak, Inc.)	44201
Seringas e agulhas de injeção	Becton, Dickinson and Company (BD)	Sortido	Para injeção de tinta de marcação de patas, administração de solução de álcool de leite
Ear Punch	Kent Scientific Corporation	INS750076
Running Wheels	Wahmann Labs		Wahmann Running Wheel é descontinuado. Um por gaiola.
Gaiola EC	Gaiolas de Martin, Inc.	R-695
Brinquedos EC Pequenos	Sortidos
Brinquedos EC	Sortidos		Devem caber 1 - 2 ratos dentro/em cima do objeto
Brinquedos EC Grandes	Sortidos		Devem caber 3 ou mais ratos dentro/em cima do objeto