Summary
يصف هذا البروتوكول تحريض نموذج نقص التروية ضخه (الأشعة تحت الحمراء) على الجلد الأذن الماوس باستخدام المغناطيس لقط. باستخدام نموذج التصوير حيوي داخلي مبنية خصيصا، ندرس في الاستجابات الالتهابية الجسم الحي بعد ضخه. الأساس المنطقي وراء تطوير هذه التقنية هو توسيع نطاق فهم كيفية استجابة الكريات البيض إلى إصابة الأشعة تحت الحمراء الجلد.
Introduction
تحدث إصابة نقص التروية ضخه (IRI) عندما يكون هناك نقص الأكسجة عابرة بسبب انسداد تدفق الدم (نقص التروية)، يليه إعادة الأوكسجين اللاحق للأنسجة (ضخه). في الجلد، ويعتقد أن نقص التروية ضخه (IR) ليكون واحدا من العوامل التي تسهم في الفيزيولوجيا المرضية لقرحة الضغط، حيث الراحة في الفراش لفترات طويلة يهيئ المرضى في المستشفيات على المدى الطويل للإصابة. في هؤلاء المرضى، ويتعرض كل من الجلد والعضلات الأساسية باستمرار للضغط الوزن المبذولة على مناطق من بروز عظمي، مما أدى إلى وقوع إصابات المترجمة التي، إذا ما تركت دون علاج، يمكن أن تصبح نخرية 1.
الأضرار تشارك في المعهد الجمهوري الدولي ذات شقين. خلال نقص التروية، وانسداد الأوعية الدموية يؤدي إلى انخفاض حاد في وصول الأكسجين إلى الأنسجة. وهذا يؤدي إلى انخفاض ATP ودرجة الحموضة، والذي يعطل ATPases تشارك في الأيض الخلوي. بدوره، مستويات الكالسيوم الخلوية السنبلة، وأكدت أو ألحقت أضرارا جملتعلمي اللغة اإلنكليزية الخضوع موت الخلايا المبرمج أو نخر 2. الافراج عن محتويات الخلايا أو الضرر المرتبطة أنماط الجزيئية (الخام)، مثل HMGB1، ويسهم في الاستجابة الالتهابية 3. وتحدث هذه الإهانة الثانية خلال ضخه. على الرغم من أن تتم استعادة مستويات الأوكسجين ودرجة الحموضة أثناء ضخه، وهذا يؤدي إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، الأمر الذي يؤدي إلى أكسدة الدهون داخل الخلايا، والحمض النووي، والبروتينات. ونتيجة لذلك، يتم تنشيط وسطاء الموالية للالتهابات، والذي ينطلق من الاستجابة الالتهابية الثانوية ينطوي على تجنيد الخلايا المناعية لموقع التهابات 2. في حين أن سلسلة من الأحداث البيوكيميائية التي أدت إلى استجابة التهابية وصفت بشكل جيد، والتنظيم المكاني والزماني للأنشطة الخلايا المناعية ليست مفهومة جيدا.
هنا، نحن تصف نموذج IR قوي على الجلد الماوس الأذن باستخدام بسيط المغناطيس لقط. إلى جانب التصوير multiphoton حيوي داخلي (MP-IVM)، ونحنأقامت نموذجا للدراسة في الجسم الحي الاستجابات الالتهابية التي تحدث بعد يأخذ ضخه مكان. الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذه التقنية هو محاولة لفهم كيفية استجابة كل من خلايا الخلالية والتسلل إلى الأشعة تحت الحمراء في الوقت الحقيقي.
النماذج الحالية من الأشعة تحت الحمراء باستخدام تقنية تحامل على الجناح الجلد هي الغازية للغاية، كما أنها تتطلب زرع جراحيا من ألواح الصلب في الجهة الجلد، مما يجعلها أقل من مثالية للدراسات المناعية 4. وقد وصفت تقنية تحامل غير الغازية مماثلة في 5،6 الماوس الجلد الجناح. ومع ذلك، بسبب إدراج عنصر التصوير حيوي داخلي في هذه الطريقة، ونحن بدلا من ذلك اختارت الجلد الأذن كموقع الأشعة تحت الحمراء المستهدفة، كما تلتف الحركات بسبب التنفس ويوفر الاستقرار أثناء التصوير 7،8. وعلاوة على ذلك، مجموعات فرعية الكريات البيض التي تمتد الخلالي متطابقة بين الجلد الأذن والجهة الجلد، على الرغم من أنقد تختلف الأرقام والنسب قليلا 9. وبالتالي، يمثل الجلد الأذن موقع التصوير المثالي.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم البيانات التي تم استردادها من هذه النماذج IRI محدودة لتقييم العيانية (الدرجات من القرحة) والتحليلات المجهرية من نقطة النهاية مؤشرات التهابات 10. استخدام هذا النموذج، يتم تمكين الوقت الحقيقي التصور من الاستجابة الخلوية العدلات بعد ضخه في جلد الفأر مراسل الفلورسنت. ويستخدم نموذج التصوير الأذن حيوي داخلي نشرت سابقا 8 مع تعديلات إضافية (الشكلان 1 و 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب على التعامل مع الحيوانات الحية وفقا لكل استخدام الحيوانات ذات الصلة والمبادئ التوجيهية واللوائح الرعاية.
1. اختيار الفئران مراسل فلوري
- استخدام منذ 12 أسابيع 6- لLysM-EGFP 11 الفئران (أي تفضيل للذكور أو إناث).
ملاحظة: استخدام مختلف الفئران مراسل فلوري خلية محددة يمكن التصور من الخلايا المناعية المختلفة في الجسم الحي. في هذه السلالة، وتعميم العدلات (خلايا GFP مرحبا)، وتعميم حيدات (خلايا GFP لو)، والضامة عن طريق الجلد (خلايا GFP لو) يمكن تصور. مع المعلمات التصوير المستخدمة، وسيتم الكشف فقط إشارات مضيئة من العدلات GFP إيجابية.
ملاحظة: قائمة سلالات الفلورسنت مراسل الماوس المناعي خلايا محددة مناسبة لهذا النوع من الدراسة التصوير الجلد يمكن العثور عليها في المرجع 8.
ملاحظة: ينصح بشدة أن يتم استخدام الفئران البيضاء للتصوير، كما pigmenالفئران تيد هي أكثر عرضة للphotodamage. وذلك لأن الجلد المصطبغ الأذن هو أكثر من ذلك بكثير حساسية لالتنقيط التي يسببها الليزر (يدل على حرق الأنسجة). ونتيجة لذلك، التوظيف العدلة وتراكم يمكن ملاحظة حتى في حالة مستقرة 8،12. - الحفاظ على الفئران في (SPF) شروط معينة خالية من مسببات المرض مع دورات ضوء الظلام 12 ساعة.
2. الماوس التخدير
- تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين-زيلازين (8 ميكرولتر ز -1 وزن الجسم)، ويتألف من خليط من 15 ملغ مل -1 الكيتامين و 1 ملغ مل -1 زيلازين الذائبة في الماء المعقم.
- ضع الماوس على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية في جميع أنحاء الداخلي الإعداد. تحقق للتخدير كافية من خلال مراقبة غياب منعكس قرصة أخمص قدميه.
ملاحظة: بعد الساعة الأولى، سوف تحتاج جرعات الربع اللاحقة من مخدر على أن تدار تحت الجلد لد- تستمر لحوالي 0.5 ساعة لكل منهما. قد يشير إلى حركة الشوارب أو الذيل أيضا أن التخدير والخفوت، وأنه لا بد من زيادة الرصيد. - استخدام مواد التشحيم العيون على العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
3. إزالة الشعر
- تطبيق بعناية كريم مزيل الشعر إلى الأعلى ثلثي الأذن ظهري الماوس باستخدام أدوات تطبيقها القطن طرف.
- انتظر 2-3 دقائق قبل إزالة كريم باستخدام الرطب تطبيقها القطن غيض بطريقة شاملة ولكن لطيف.
ملاحظة: لا تسمح لكريم إزالة الشعر للبقاء على الأذن الماوس لفترة طويلة جدا، لأنها قد تحفز التهاب 13،14.
4. تحريض نقص التروية وضخه إصابة
- استخدام مطلية بالذهب، N42 الصف المغناطيس النيوديميوم، مم 12 × 2 مم، ومع تصنيف غاوس ما يقرب من 3000 للحث على نقص التروية في الجلد الماوس الأذن.
ملاحظة: في هذه الحالة، ووجه مدمل من المغناطيس DENOقسم التدريب والامتحانات شمال القطب. - فتحة المغناطيس إلى أدلة البلاستيك الفردية.
ملاحظة: دليل البلاستيك يعمل على تخفيف التنسيب وفصل مغناطيس عالية القوة. بسبب القوة المغناطيسية القوية بعد انخفاض المقاومة للكسر، لا تضع المغناطيس الفردية على مقربة من بعضها البعض أو المعادن الأخرى. قد يحدث الكسر وانشقاق إذا كانت سحب تجاه بعضهم البعض. - ضع الأول (الظهرية) المغناطيس بحيث فقط حافة على اتصال مع الثاني (بطني) المغناطيس (الشكل 3A)
ملاحظة: يمنع هذا المغناطيس من التقاط معا قبل أن يتم وضعه بشكل صحيح. - وضع كل من المغناطيس بحيث المغناطيس بطني شقة تقع على الأذن (الشكل 3A).
ملاحظة: قبل أن يتم الناجم عن نقص التروية، وضمان أن يتم الاحتفاظ الماوس عند 37 درجة مئوية، ويتم الحفاظ على التخدير الكافي (راجع الخطوة 2.2). - مرة واحدة على استعداد، دعونا بعناية المغناطيس معا (الشكل 3A ملاحظة: لأغراض التصوير، المشبك نصف فقط من الأذن بحيث الأشعة تحت الحمراء والمنطقة غير الأشعة تحت الحمراء ويمكن ملاحظة.
- بعد 1.5 ساعة من نقص التروية، وإزالة المغناطيس قبل التواء المغناطيس بعيدا عن بعضها البعض باستخدام أدلة البلاستيكية، والسماح ضخه لتأخذ مكان.
يجب توخي الحذر لمنع الآذان من التجعيد عندما يتم وضع مغناطيس: مذكرة. نقص التروية ناقصة واضح إذا كانت الأوعية الدموية الرئيسية واضحة ظاهريا على اعادة يروي فورا (أي الدم يملأ السفن فورا) بعد إزالة المغناطيس. على الرغم من أن لا يحدث ضخه مباشرة بعد إزالة المغناطيس، وانسداد الأوعية الدموية عابرة فقط. على هذا النحو، لا بد من إعداد الأذن الماوس لتصوير بأسرع وقت ممكن.
5. حقن من وكلاء وصفها الأوعية الدموية
- مباشرة بعد إزالة المغناطيس وإدارة عن طريق الوريد (عبر الرجعية المداري أو ذيل حقن الوريد) ايفانز الأزرق (10 ملغ مل -1في برنامج تلفزيوني أو المالحة. 1 ميكرولتر ز -1 وزن الجسم) أو آخر الأوعية الدموية وصفها وكيل الاختيار.
ملاحظة: قبل الحقن، وضمان لا تزال تحتفظ أن التخدير الكافي من أداء طيف معسر أخمص قدميه.
6. موضع الأذن على منصة التصوير
- قطع 2 قطعة من الشريط اللاصق 1.5 سم في الطول و 1.8 سم في العرض.
- السماح للالجانبين لاصقة لتلتصق ببعضها البعض مع ترك حوالي 1 ملم من مادة لاصقة على طول عرضه.
- قطع الشريط اللاصق في اثنين، بالطول، لاستيعاب وضعها داخل شق على منصة الأذن.
- إدراج هذه اخفاء الشريط حول منتصف الطريق من خلال فتحة، مثل أن الجانب اللاصق يواجه عقوبة تصل.
- ضع الماوس على وسادة التدفئة، بحيث الأذن للتصوير بجوار الشريط اخفاء الشريط.
- باستخدام اثنين مبلل برنامج تلفزيوني تطبيقها القطن طرف، اضغط بلطف الأذن ضد شريط لاصق.
- استخدام الشريط كدليل، وجلب الأذن الماوسمن خلال شق في حين ضبط في وقت واحد الماوس أقرب نحو المرحلة.
- لإزالة شريط لاصق، لأول مرة إضافة قطرة من برنامج تلفزيوني للحد من الإلتصاق من الشريط.
- فصل الأذن الماوس من اخفاء الشريط بلطف ممكن باستخدام الفرشاة الجميلة.
- تتسطح الأذن ضد منصة الأذن من قبل المتداول بلطف قضيب من القطن طرف رطبة على الأذن.
- وضعت قطرة من برنامج تلفزيوني تحت ساترة (والتي يتم الاحتفاظ بها في الموقف على حامل ساترة باستخدام الشحوم، الشكل 2) وبلطف وضعه على الأذن. أعلى حتى مع أكثر PBS إذا لزم الأمر.
ملاحظة: حامل ساترة يزيد من الاستقرار أثناء التصوير. - إدراج التحقيق في درجة الحرارة المستقيم وتوصيل الأسلاك إلى نظام التدفئة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: ضبط درجة الحرارة لوحة التدفئة الجسم إلى 37 درجة مئوية، والأذن منصة المسرح إلى 35 درجة مئوية.
7. Multiphoton مجهر مجموعةيصل والتصوير معلمات
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول شعاع واحد، multiphoton المجهر مع الانضباطي (680 - 1080 نانومتر) تي: سا الليزر (3.3 W في 800 نانومتر، ومدة النبضة 140 خ م، و 80 ميغاهيرتز معدل التكرار) مع هدف 20X المياه (NA = 1.0) للدراسات التصوير حيوي داخلي.
- فتح برامج التصوير.
- محاذاة الليزر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- ضبط الطول الموجي الإثارة إلى 950 نانومتر.
ملاحظة: GFP وايفانز الأزرق يمكن أن يكون سعيدا في وقت واحد في 950 نانومتر. - إلى المعاينة، واستخدام الإعدادات التالية: 500 ميكرون 2 scanfield، 505 س 505 بكسل القرار، وتردد المسح الضوئي 800 هرتز في مسح سطر واحد. انقر على "معاينة".
- تبديل المخفف (ليزر) السلطة. التأكد من أن جميع الإشارات الأساسية يتم انتقاؤها من دون تعريض مجال التصوير لكميات كبيرة من الطاقة ليزر، التي ربما تتسبب في ضرر الحرارة.
ملاحظة: تبدأ في قوة المخفف منخفضة وزيادة إذا كانت الاشاراتل قاتمة. كما العدلات سيكون غائبا عن الخلالي في وقت مبكر يشير بعد ضخه، ويمكن استخدام الضامة كمقياس لتحديد السلطة الحد الأدنى المطلوب، كما في السابق هي باهتة من العدلات.
ملاحظة: إذا كانت هذه الخطوة ينبغي القيام به لأول مرة، وضبط الإعدادات في منطقة غير الدماغية، حيث من المتوقع سلامة الأوعية الدموية سليمة وسيسهل وضع قوة المخفف. في تجارب لاحقة، هذه الإعدادات لا تتطلب الكثير من التعديل ما لم تكن قوة الليزر غير مستقرة. - ضبط إعدادات PMT.
ملاحظة: تحقق مع الشركة المصنعة للالأقصى الأمثل الجهد مكسب للPMT. ووضع التيار الكهربائي PMT خارج العتبة الموصى بها يؤدي إلى ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. التوصية العامة هي لضبط الجهد الربح PMT إلى عتبة الموصى بها لزيادة القوة المخفف عند الضرورة ينبغي أن تكون إشارة خافت جدا. - تحديد منطقة التصوير التي هي على مقربة منعلى حافة نقص التروية، والتي تتميز الهائل ايفانز تسرب الأزرق.
- جمع GFP وايفانز إشارات الزرقاء باستخدام 525/50 ممر الموجة (BP) و655/40 المرشحات BP، على التوالي. لتوليد التوافقي (SHG) إشارات الثانية من ألياف الكولاجين داخل مقصورة الجلدية، واستخدام 475/42 مرشح BP.
- إنشاء مجلد لحفظ الصور في تنسيق متوافق للبرمجيات تحليل الصور المتاحة.
- في اكتساب جنسيتها أو استخدام الإعدادات التالية: 500 ميكرون 2 scanfield، 505 س 505 بكسل القرار، ومسح تردد 400 هرتز في مسح سطر واحد.
- 100 ميكرون ض المكدس مع حجم خطوة من 4 ميكرون يمكن الحصول عليها مرارا وتكرارا على مر الزمن، في 1 فترات دقيقة، لرصد العدلات تسلل.
ملاحظة: وخاصة بالنسبة للالكريات البيض (على سبيل المثال، العدلات) مع سرعة المهاجرة أعلى، وهي فترة أطول من 1 دقيقة قد يؤدي الى صعوبات خلال تحليل تتبع الخلية. في هذه الحالة، يمكن للمستخدم إما أن تخفف من سماكة ميلانquisition كومة أو زيادة وتيرة المسح الضوئي.
ملاحظة: على الرغم من كومة اكتساب المطلوبة المنطقة الدماغية قد تظهر أصغر نتيجة للضغط (تتميز بدلا من شدة مجموعات المساعدة الذاتية أعلى)، وضخه بعد ذلك التاريخ التهاب الهائل الذي يتسبب في الأذن وارما. ومن المتوقع الانجرافات كبيرة في Z-الاتجاه. على هذا النحو، واقتناء كبير ض المكدس ضروري لاستيعاب الانجراف. - في جميع أنحاء التصوير، أعلى حتى من برنامج تلفزيوني والماء بانتظام للحفاظ على الأذن رطبة والعدسة الشيئية مغمورة في الماء.
ملاحظة: تجربة نموذجية عادة ما يستمر لمدة 2-4 ساعات. اعتمادا على التصميم التجريبي، وإلى جانب وجود نظام التخدير تسيطر عليها بشكل جيد، تمديد مدة التصوير غير ممكن.
8. إنهاء التجربة
- الموت ببطء الماوس خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون وفقا لمؤسسة لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم (IACUC) العلاقات العامةocedures.
ملاحظة: الموت ببطء دائما الماوس عن طريق الطرق المعتمدة على النحو الذي تحدده المؤسسة القواعد والأنظمة، والمبادئ التوجيهية. إذا كانت هناك حاجة التصوير المتكررة، والحفاظ على الماوس على لوحة التسخين حتى ترتدي التخدير خارج. مرة واحدة على الفأرة استعاد وعيه كافية وغير المحمول، وعودة الماوس لقفصه.
تحليل 9. صورة
ملاحظة: البيانات الناتجة عن تجربة التصوير يمكن تصور من قبل حزم البرمجيات المختلفة.
- فتح البرنامج تحليل التصوير.
- تحت فق الوضع، استيراد ملف (فتح → حدد أي ملف في المجلد المطلوب → اضغط على "فتح").
- تحرير الزائفة الألوان إذا لم يتم تطبيق الألوان الافتراضية (تعديل تحرير → عرض → تحت علامة التبويب قناة، حدد اللون المطلوب من لوحة الألوان).
- ضبط السطوع والتباين، والخلفية (تحرير → تعديل العرض → تبديل ماكس والقيم مين). تأكد من أن أبعاد الملف صحيحة (تحرير خصائص → → صورة تحت علامة التبويب الهندسة، والتحقق من حجم فوكسل في هذا البروتوكول، X = 0.99، Y = 0.99، وZ = 4).
ملحوظة: اشتقاق X و Y بقسمة البعد scanfield من قبل بيكسل. Z هو سمك بين كل شريحة.
ملاحظة: يمكن عرض إخراج هذه مجموعات البيانات كما القصوى الأفلام الإسقاط.
ملاحظة: مطلوب تحليل تتبع لتوصيف كامل الأنشطة الخلوية والتفاعلات من أجل فهم وظيفتها في الجسم الحي. تعليمات مفصلة لتتبع الخلية باستخدام وظيفة بقعة المتاحة في البرنامج ويمكن العثور عليها في البروتوكول في مرجع 15.
ملاحظة: هناك العديد من الطرق لقياس الهجرة الكريات البيض، والتفاصيل التي يمكن العثور عليها في المادة مراجعة في مرجع 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يستخدم هذا البروتوكول الجلد الأذن منصة التصوير مبنية خصيصا، كما هو مبين في الشكل 1. العديد من الميزات من هذه المنصة تم تصميمها خصيصا لتسهيل التصوير مع الحفاظ على إعدادات الفسيولوجية. وضع الأذن على منصة النحاس ساخنة لا يحافظ فقط على الأذن عند درجة حرارة الفسيولوجية من 35 درجة مئوية، ولكن بل عزل الأذن من الحركات التي لا مفر منها بسبب التنفس. إضافة مشبك معدني على منصة النحاس يخلق فجوة لمنع حامل ساترة من ممارسة الوزن على الأذن، وبالتالي الحفاظ على تدفق الدم دون انقطاع. تم تصميم منصة المسرح أيضا لاستيعاب وسادة التدفئة التي من شأنها الحفاظ على الماوس عند 37 درجة مئوية في جميع أنحاء الإجراء التصوير.
تم تصميم حامل ساترة (الشكل 2) للسماح للساترة ترفق على حامل معدني بمساعدة العظمى! فراغحد ذاتها. توصيل حامل ساترة لموقف يسمح التكيف المرن في المحاور الأفقية والعمودية مع مساعدة من محول. بهذه الطريقة، يمكن للمستخدم ضبط أول بدقة موقف ساترة على الأذن، وبعد ذلك إصلاح هذا الموقف من خلال تشديد الخناق على المحول.
في هذا البروتوكول، ونحن قد وصفت استخدام مغناطيس لمحاكاة نقص التروية وضخه. الشكل 3B يعرض وجهات ممثلة للآذان قبل ومباشرة بعد نقص التروية. في ظل الظروف الفسيولوجية والأوعية الدموية الرئيسية يمكن تصور ظاهريا. تأثير معسر من المغناطيس ينبع من تدفق الدم، والتي يمكن رصدها من قبل تأثير ابيضاض عابر (السهم الأسود) عندما تتم إزالة المغناطيس مؤقتا.
في هذه المظاهرة معينة، ويركز التصوير على حافة المنطقة الدماغية (الشكل 3C (الشكل 3D). وهذا يخلق المعالم الهامة للدراسات التصوير حيوي داخلي ويساعد على الحفاظ على الاتساق بين تجارب مستقلة.
وتشير البيانات إلى أنه استجابة لإهانة الأشعة تحت الحمراء، تسلل العدلات الخروج إلى الخلالي من الأوعية الدموية سليمة بطانة حافة منطقة الدماغية وتهاجر نحو موقع الإصابة (الشكل 3D والسينما 1). نتوقع تأخر الرد من العدلات المهاجرة في الخلالي بالمقارنة مع النماذج التهاب الأخرى نظرا لعدم وجود perfusing الأوعية الدموية قادرة على البقاء في نقطة زمنية سابقة بعد ضخه. لوصف الكامل لهذه الخليةأنشطة جزيئية، قد تكون عاملة تحليل تتبع الخلايا لفهم وظيفتها في الجسم الحي. سرعة، يعني تشريد، ومؤشر الكيميائي هي بعض من المحتملة للقراءة الرافضة التي يمكن الحصول عليها من تحليل خلية تتبع.
الشكل 1. الرسم التخطيطي لمرحلة الأذن الجلد من صنع مخصص لحيوي داخلي Multiphoton التصوير. (أ) أعلى نظرا للمرحلة التصوير الأذن مع أبعادها. (ب) عرض أمامي والأبعاد. لاحظ أن لوحة من النحاس الأصفر هو أكثر سمكا في الجانبين، من أجل توفير الاستقرار للمنصة، وأرق في الوسط، للحد من منطقة تماس مع الجلد، وضمان تدفق الدم دون انقطاع عندما يتم طي الأذن على حافة الشق و تقع على المنصة. عرض (ج) جانب من حامل المنحني الذي يعلق أسفل التحقيق ردود الفعل. لوحة التدفئة يمكن أن يكونثابت على المنصة باستخدام الشريط اللاصق (لا يظهر). تعديل من لي وآخرون، نات Protoc، 2012 8. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تصميم لحامل ساترة. الجانب والأعلى مشاهدة. صاحب ساترة يحمل ساترة في وضع ثابت، وبالتالي يقلل ض الانجراف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الأشعة تحت الحمراء النموذجي. (A) رسم تخطيطي يظهر المواقع من المغناطيس. (ب) (C) تخطيطي من الأذن تظهر المنطقة تصويرها فيما يتعلق حيث كانت قد وضعت المغناطيس. (D) كثافة القصوى-المتوقع ض لقطات من تسلسل الوقت الفاصل تظهر العدلات تسلل بعد ضخه في الماوس LysM-EGFP. الوقت المنقضي يظهر في تنسيق hh: مم. مقياس شريط: 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1. العدلات التوظيف في الأشعة تحت الحمراء الإصابات. تسلسل الوقت الفاصل بين الحد الأقصى الإسقاط تظهر العدلات (الأخضر) تسلل ردا على ضخه في LysM-EGFP البيضاء الماوس الجلد الأذن بعد 1.5 ساعة من نقص التروية. في نقطة زمنية سابقة، وعدم وجودايفانز إشارة الزرقاء (أحمر) إلى انسداد الأوعية مؤقت بعد نقص التروية. الكولاجين (الأزرق والجيل الثاني التوافقي). الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أهمية
الأشعة تحت الحمراء هي واحدة من الأسباب الرئيسية للقرحة الضغط الجلد. في المراحل المبكرة (الأول والثاني) من قرحة الضغط تصف حالة الجلد البشري (بالمقارنة مع الأنسجة تحت الجلد الكامنة والعضلات). ومع ذلك، فهم المسببات المناعية ما زالت ناقصة. هنا، نقدم نموذج IR بسيط وقوي على الماوس الجلد الأذن من أجل معالجة هذه الفجوة. نحن محاكاة نقص التروية قبل لقط الأذن الماوس بين اثنين من المغناطيس، وبعد دراسة الاستجابات المناعية المصب بعد إزالة المغناطيس (ضخه). باستخدام المغناطيس لتوليد الضغط المستمر على كل أذن لفترة محددة من الزمن، الأمر الذي أدى نقص التروية، ونحن قادرون على ضمان استنساخ والاتساق بين التجارب.
قوة هذا النموذج الأشعة تحت الحمراء غير الغازية أيضا يكمن في قدرته على إظهار، في الوقت الحقيقي، في الجسم الحي الاستجابات المناعية عن طريق استخدام نموذج راسخة من IMAGIN حيوي داخليغرام من الجلد الأذن، والتي توفر المزيد من الاستقرار أثناء التصوير بالمقارنة مع إجراء الجناح الجلد. بعض النماذج الجناح الجلد الحالية تنطوي على العمليات الجراحية التي قد تغير المشهد المناعي للجلد 4. وبالإضافة إلى ذلك، التصوير الجهة الجلد نفسه يمثل تحديا تقنيا، والحركات الجهاز التنفسي يمكن أن تسهم في الأعمال الفنية ذات الصلة الحركة أثناء التصوير 5،6. لدينا النموذج الحالي تلتف هذه المشاكل.
بالإضافة إلى دراسة الاستجابات الفسيولوجية للخلايا المناعية إلى الأشعة تحت الحمراء، قد يكون هذا النموذج ينطبق أيضا على إعدادات المرضية مثل مرض السكري، حيث السكري قد تتفاقم الإصابة الأشعة تحت الحمراء من خلال زيادة الاكسدة. وفهم الاستجابات المناعية يسهم في فهم التئام الجروح.
خطوات حاسمة
وبمجرد أن الفأر هو تحت التخدير، وضعف التنظيم الحراري ودرجة حرارة الجسم الأساسية قطرات بشكل كبير. لمنع hypothermia والتدفئة الخارجية أمر ضروري للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية عند 37 درجة مئوية. الأذن، وتقع إلى أقصى حد لجوهر الجسم، وأكثر برودة من الناحية الفسيولوجية التي كتبها 1-2 درجة مئوية، ويجب أن تظل في 35 درجة مئوية. وهذا الاتساق في التدفئة أيضا ضمان استنساخه قراءة الرافضة للديناميات الخلية. وفي الوقت نفسه، يجب أن يتم فحص نظام التدفئة للتأكد من أن الفأر هو عدم الإفراط في التدفئة في جميع أنحاء طول التخدير.
من المستحسن استخدام الفئران البيضاء (BALB / ج و C57BL / 6-C 2J) لجميع الدراسات التصوير الجلد للغاية لتجنب وقوع اصابات التنقيط الناجمة عن الصباغ. إذا الفئران البيضاء غير متوفرة، وخفض قوة الليزر خلال الحصول على الصور قد تخفف من المشكلة بالنسبة للفئران المصطبغة. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين، وانخفاض عمق اختراق الأنسجة يمكن أن يؤدي إلى نتائج الاستحواذ الأكثر فقرا.
الجلد الأذن حساسة جدا. وبالتالي، يجب توخي الحذر لتجنب أي ظرف من الظروف أنقد يسبب التهاب. وتشمل الأمثلة على تقنيات غير لائق، ولكن ليس على سبيل الحصر، ما يلي: 1) ترك كريم مزيل الشعر على لكمية زائدة من الوقت على ما هو الموصى بها؛ 2) تطبيق الاحتكاك المفرط على الأذن عندما يصل الأذن من خلال الشق من منصة التصوير الأذن أو عند فصل الأذن من الشريط اللاصق. و3) ارتفاع حرارة الأذن، إما بسبب نظام التدفئة خلل أو درجة الحرارة في غير محله ردود الفعل التحقيق التي يمكن أن تسجل درجة الحرارة المحيطة بدلا من درجة الحرارة الأساسية الماوس.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
معظم المشاكل المتعلقة بإجراءات إعداد الأذن تم المذكورة سابقا 8. إذا تم تصويرها الأذن في وقت لاحق نقطة زمنية ما بعد ضخه، قد تتورم الأذن وراء الفجوة 0.5 ملم التي تم إنشاؤها بواسطة مشبك معدني لاستيعاب سمك الأذن (الشكل 1). في هذا السيناريو، وضع ساترة على الأذنقد تعوق تدفق الدم، وهو ما يتضح عندما تختفي الأوعية الدموية واضحة ظاهريا عن الأنظار. وهو ما يجب تلافيه من خلال خلق فجوة أكبر بين صاحب ساترة ومنصة النحاس. ويمكن أن يتم ذلك بطريقتين، إما عن طريق ضبط ارتفاع صاحب ساترة (الشكل 2) يدويا أو باستخدام مشبك معدني سمكا.
القيود المفروضة على تقنية
في هذا البروتوكول، وكنا ايفانز الأزرق لتحديد موقع المنطقة الدماغية، منذ تسرب من فراغ ايفانز في الخلالي يصادف حدود المنطقة الدماغية في نقاط زمنية مبكرة بعد نقص التروية. يستخدم ايفانز الأزرق عادة باعتبارها الأوعية الدموية وصفها وكيل. ومع ذلك، في ظل ظروف التهابات، وللخطر سلامة الأوعية الدموية بشدة. وهذا يؤدي إلى تسرب ايفانز الأزرق إلى الخلالي. في هذا النموذج، نلاحظ خسارة قاسية من التباين بين الأوعية الدموية والخلالي بعد ضخه قريبا. على هذا النحو، في الحادي والعشرينudies التي تشارك فيها تفاعلات الكريات البيض البطانية، نوصي تجارب مع وكلاء العلامات الأوعية الدموية الأخرى من مختلف الأحجام (على سبيل المثال، dextrans، الخ.).
التطبيقات المستقبلية
إلى جانب استخدام الماوس LysM-EGFP لشرح كيفية الاستجابة العدلات إلى الأشعة تحت الحمراء الجلد، ويمكن لهذا النموذج أن تستخدم أيضا لدراسة الردود الكريات البيض الأخرى، سواء في التسلل (حيدات) وبيني المقيمين (الضامة) الكريات البيض. ويمكن أيضا أن يمتد هذا النموذج إلى دراسات أخرى فحص الدم وسلامة اللمفاوية، وكذلك التفاعلات الكريات البيض البطانية بعد إصابة الأشعة تحت الحمراء. إلى جانب القدرة على تصور الكولاجين كإشارات مجموعات المساعدة الذاتية من خلال MP-IVM، أنه سيكون من المثير للاهتمام مراقبة سلامة الكولاجين بعد الأشعة تحت الحمراء أو أثناء التئام الجروح. وباختصار، فقد وضعنا غير الغازية، نموذج قوي من الأشعة تحت الحمراء للتصوير حيوي داخلي من أجل دراسة الاستجابات المناعية في الجلد الماوس الأذن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J.
