Aqui apresentamos um protocolo para medir a força das interações entre uma superfície inorgânica bem definida e tanto peptídeos ou aminoácidos por única molécula de medidas de espectroscopia de força utilizando um microscópio de força atômica (AFM). As informações obtidas a partir da medição é importante para entender melhor a interfase material de peptídeo-inorgânico.
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Artigo de método
Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy
Neste artigo
Resumo
Resumo
As interacções entre as proteínas ou péptidos e materiais inorgânicos levar a vários processos interessantes. Por exemplo, combinando proteínas com minerais conduz à formação de materiais compósitos com propriedades únicas. Além disso, o processo de incrustação biológica indesejável é iniciada pela adsorção de biomoléculas, principalmente proteínas, nas superfícies. Esta camada orgânica é uma camada de adesão de bactérias e que lhes permite interagir com a superfície. Compreender as forças fundamentais que governam as interações na interface orgânica-inorgânica, é importante para muitas áreas de pesquisa e poderia levar à concepção de novos materiais para aplicações ópticas, mecânicas e biomédicas. Este artigo demonstra uma técnica de espectroscopia de força única molécula que utiliza um AFM para medir a força de aderência entre ambos péptidos ou aminoácidos e superfícies inorgânicas bem definidas. Esta técnica envolve um protocolo para a fixação da biomolécula a AFMponta através de um ligante flexível covalente e única molécula de medidas de espectroscopia de força por parte microscópio de força atômica. Além disso, uma análise dessas medidas está incluída.
Introdução
A interacção entre as proteínas e minerais inorgânicos conduz à construção de materiais compósitos com propriedades distintivas. Isto inclui materiais com elevada resistência mecânica ou as propriedades ópticas únicas. 1, 2, por exemplo, a combinação da proteína de colagénio com a hidroxiapatite mineral, quer gera ossos moles ou duras para diferentes funcionalidades. 3 péptidos curtos, também podem ligar-se materiais inorgânicos com alta especificidade. 4, 5, 6 A espe....
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Protocolo
1. Sugestão Modificação
- Compra de nitreto de silício (Si 3 N 4) cantilevers de AFM com pontas de silício (raio cantilever nominal de ~ 2 nm).
- Limpar cada cantilever AFM por imersão em etanol anidro durante 20 min. Seca-se à temperatura ambiente. Em seguida, tratar as consolas por expondo-os a O2 do plasma durante 5 min.
- Suspender as pontas limpas acima (3 cm) contendo uma solução metiltrietoxisilano e 3- (aminopropil) silano em uma proporção de 15: 1 (v / v) em um exsicador sob uma atmosfera inerte (azoto ou árgon) e ligar o exsicador até uma bomba de vácuo. Vácuo durante 2 horas para formar uma monocama....
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Resultados
A Figura 1 apresenta o procedimento de modificação de ponta. No primeiro passo, um tratamento com plasma modifica a superfície da ponta de nitreto de silício. A ponta apresenta grupos OH. Estes grupos serão, em seguida, reagir com os silanos. No final deste passo, a superfície da ponta vai ser coberta por grupos -NH2 livres. Estas aminas livres vai então reagir com Fmoc-PEG-NHS, um ligante covalente. O grupo Fmoc do ligante é removido por PEG pipyridine, um re.......
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Discussão
Os passos 1.3, 1.4 e 1.7 no protocolo deve ser realizado com cuidado extenso e de uma forma muito suave. No passo 1.3, a ponta não deve estar em contacto com a mistura de silano e o processo de silanização deve ser realizada numa atmosfera inerte (de humidade livre). 45 Isto é feito a fim de evitar a formação de camadas múltiplas e porque as moléculas de silano prontamente sofrer hidrólise na presença de humidade. 45
No passo 1.4, a temperatura.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. agradece o apoio do Conselho de Israel para o Ensino Superior.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Estabilizadores AFM de nitreto de silício (Si3N4) AFM com pontas de silício | Bruker (Camarilo, CA, EUA) | MSNL10, raio nominal dos cantilares ~2 nm | |
| Metiltrietoxissilano | Acros Organics (New Jersey, EUA) | Para Silailação da ponta AFM | |
| 3-(Aminopropil) trietoxissilano | Sigma-Aldrich (Jerusalém, Israel) | Para Silaylation da ponta do AFM | |
| Triisopropylsilane | Sigma-Aldrich (Jerusalém, Israel) | Usado para a desproteção do peptide | |
| N-Ethyldiisopropylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido) | Usado para a modificação da ponta | |
| Triethylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido) | Usado para a ponta modificação | |
| Piperidina | Alfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido) | Usado para desproteção de ponta Fmoc | |
| Fluorenilmetiloxicarbonil-PEG-N-hidroxisuccinimida (Fmoc-PEG-NHS) | Iris Biotech GmbH (Alemanha, Alemanha) | Usado como ligante flexível covalente (MW = 5.000 Da) | |
| 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HBTU) | Alfa Aser (Heysham, Inglaterra) | Usado como reagente de acoplamento. | |
| N-metil-2-pirrolidona (NMP) | Acros Organics (Nova Jersey, EUA) | Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta | |
| DMF (dimetilformamida) | Merck (Darmstadt, Alemanha) | Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta | |
| Chloroform | Bio-Lab (Jerusalém, Israel) | Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta | |
| Etanol (anidro) | Gadot (Netanya, Israel) | Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta | |
| Ácido trifluoroacético (TFA) | Merck (Darmstadt, Alemanha) | ||
| Anidrido acético | Merck (Darmstadt, Alemanha) | ||
| Peptídeos | GL Biochem (Xangai, China). | ||
| Fenilalanina e tirosina | Biochem (Darmstadt, Alemanha) | ||
| 30% de dispersão de TiO2 na mistura de solvente 2- (2-metoxietoxi) etanol (DEGME) e 3-etoxipropionato de etila (EEP) | Applied Vision Laboratories (Jerusalém, Israel) | (30%) na mistura de solvente 2- (2 metoxietoxi) etanol (DEGME) e 3-etoxipropionato de etila (EEP). Usado para preparação de substrato TiO2 | |
| Substratos de mica | TED PELLA, INC. (Redding, Califórnia, EUA) | 9,9 mm de diâmetro |
Referências
- Addadi, L., Weiner, S. Control and design principles in biological mineralization. Angew. Chem., Int. Ed. 31 (2), 153-169 (1992).
- Meyers, M. A., Chen, P. Y., Lin, A. Y. M., Seki, Y. Biological materials: Structure and mechanical properties. Prog. Mater. Sci. 53 (1), 1-206 (2008).
- Villee, C. A. J.....
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Reimpressões e permissões
