Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para medir a força das interações entre uma superfície inorgânica bem definida e tanto peptídeos ou aminoácidos por única molécula de medidas de espectroscopia de força utilizando um microscópio de força atômica (AFM). As informações obtidas a partir da medição é importante para entender melhor a interfase material de peptídeo-inorgânico.

Abstract

As interacções entre as proteínas ou péptidos e materiais inorgânicos levar a vários processos interessantes. Por exemplo, combinando proteínas com minerais conduz à formação de materiais compósitos com propriedades únicas. Além disso, o processo de incrustação biológica indesejável é iniciada pela adsorção de biomoléculas, principalmente proteínas, nas superfícies. Esta camada orgânica é uma camada de adesão de bactérias e que lhes permite interagir com a superfície. Compreender as forças fundamentais que governam as interações na interface orgânica-inorgânica, é importante para muitas áreas de pesquisa e poderia levar à concepção de novos materiais para aplicações ópticas, mecânicas e biomédicas. Este artigo demonstra uma técnica de espectroscopia de força única molécula que utiliza um AFM para medir a força de aderência entre ambos péptidos ou aminoácidos e superfícies inorgânicas bem definidas. Esta técnica envolve um protocolo para a fixação da biomolécula a AFMponta através de um ligante flexível covalente e única molécula de medidas de espectroscopia de força por parte microscópio de força atômica. Além disso, uma análise dessas medidas está incluída.

Introduction

A interacção entre as proteínas e minerais inorgânicos conduz à construção de materiais compósitos com propriedades distintivas. Isto inclui materiais com elevada resistência mecânica ou as propriedades ópticas únicas. ^{1, 2,} por exemplo, a combinação da proteína de colagénio com a hidroxiapatite mineral, quer gera ossos moles ou duras para diferentes funcionalidades. ³ péptidos curtos, também podem ligar-se materiais inorgânicos com alta especificidade. ^{4, 5, 6} A espe....

Protocol

1. Sugestão Modificação

1. Compra de nitreto de silício (Si ₃ N ₄₎ cantilevers de AFM com pontas de silício (raio cantilever nominal de ~ 2 nm).
2. Limpar cada cantilever AFM por imersão em etanol anidro durante 20 min. Seca-se à temperatura ambiente. Em seguida, tratar as consolas por expondo-os a _O2 do plasma durante 5 min.
3. Suspender as pontas limpas acima (3 cm) contendo uma solução metiltrietoxisilano e 3- (aminopropil) silano em uma proporção de 15: 1 (v / v) em um exsicador sob uma atmosfera inerte (azoto ou árgon) e ligar o exsicador até uma bomba de vácuo. Vácuo durante 2 horas para formar uma monocama....

Results

A Figura 1 apresenta o procedimento de modificação de ponta. No primeiro passo, um tratamento com plasma modifica a superfície da ponta de nitreto de silício. A ponta apresenta grupos OH. Estes grupos serão, em seguida, reagir com os silanos. No final deste passo, a superfície da ponta vai ser coberta por grupos _-NH2 livres. Estas aminas livres vai então reagir com Fmoc-PEG-NHS, um ligante covalente. O grupo Fmoc do ligante é removido por PEG pipyridine, um re.......

Discussion

Os passos 1.3, 1.4 e 1.7 no protocolo deve ser realizado com cuidado extenso e de uma forma muito suave. No passo 1.3, a ponta não deve estar em contacto com a mistura de silano e o processo de silanização deve ser realizada numa atmosfera inerte (de humidade livre). ⁴⁵ Isto é feito a fim de evitar a formação de camadas múltiplas e porque as moléculas de silano prontamente sofrer hidrólise na presença de humidade. ⁴⁵

No passo 1.4, a temperatura.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estabilizadores AFM de nitreto de silício (Si3N4) AFM com pontas de silício	Bruker (Camarilo, CA, EUA)		MSNL10, raio nominal dos cantilares ~2 nm
Metiltrietoxissilano	Acros Organics (New Jersey, EUA)		Para Silailação da ponta AFM
3-(Aminopropil) trietoxissilano	Sigma-Aldrich (Jerusalém, Israel)		Para Silaylation da ponta do AFM
Triisopropylsilane	Sigma-Aldrich (Jerusalém, Israel)		Usado para a desproteção do peptide
N-Ethyldiisopropylamine	Alfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido)		Usado para a modificação da ponta
Triethylamine	Alfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido)		Usado para a ponta modificação
Piperidina	Alfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido)		Usado para desproteção de ponta Fmoc
Fluorenilmetiloxicarbonil-PEG-N-hidroxisuccinimida  (Fmoc-PEG-NHS)	Iris Biotech GmbH (Alemanha, Alemanha)		Usado como ligante flexível covalente (MW = 5.000 Da)
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HBTU)	Alfa Aser (Heysham, Inglaterra)		Usado como reagente de acoplamento.
N-metil-2-pirrolidona (NMP)	Acros Organics (Nova Jersey, EUA)		Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta
DMF (dimetilformamida)	Merck (Darmstadt, Alemanha)		Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta
Chloroform	Bio-Lab (Jerusalém, Israel)		Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta
Etanol (anidro)	Gadot (Netanya, Israel)		Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta
Ácido trifluoroacético (TFA)	Merck (Darmstadt, Alemanha)
Anidrido acético	Merck (Darmstadt, Alemanha)
Peptídeos	GL Biochem (Xangai, China).
Fenilalanina e tirosina	Biochem (Darmstadt, Alemanha)
30% de dispersão de TiO2 na mistura de solvente 2- (2-metoxietoxi) etanol (DEGME) e 3-etoxipropionato de etila (EEP)	Applied Vision Laboratories (Jerusalém, Israel)		(30%) na mistura de solvente 2- (2 metoxietoxi) etanol (DEGME) e 3-etoxipropionato de etila (EEP). Usado para preparação de substrato TiO2
Substratos de mica	TED PELLA, INC. (Redding, Califórnia, EUA)		9,9 mm de diâmetro