Artigo de método

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

DOI:

10.3791/54976

⸱

28 de dezembro de 2016

 ,  , 
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie.

Resumo

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Os avanços na genômica levantaram a possibilidade de sondar a biodiversidade em uma escala sem precedentes. No entanto, a sequência por si só não será informativa sem ferramentas para estudar a função do gene. O desenvolvimento e compartilhamento de protocolos detalhados para o estabelecimento de novos sistemas modelo em laboratórios e para ferramentas para realizar estudos funcionais é, portanto, crucial para alavancar o poder da genômica. Os coleópteros (besouros) são o maior clado de insetos e ocupam praticamente todos os tipos de habitats do planeta. Além de fornecer modelos ideais para pesquisa fundamental, os estudos de besouros podem ter impactos no controle de pragas, pois muitas vezes são pragas de residências, agricultura e indústrias alimentícias. Protocolos detalhados para criação e manutenção de colônias de laboratório de D. maculatus e para a realização de interferência mediada por dsRNA em D. maculatus são apresentados. Os procedimentos de RNAi embrionário e parental - incluindo configuração do aparelho, preparação, injeção e recuperação pós-injeção - são descritos. Também são apresentados métodos para análise de fenótipos embrionários, incluindo viabilidade, defeitos de padronização em larvas eclodidas e preparações de cutícula para larvas não eclodidas. Esses ensaios, juntamente com a hibridização in situ e a imunocoloração para marcadores moleculares, tornam D. maculatus um sistema modelo acessível para pesquisa básica e aplicada. Eles também fornecem informações úteis para estabelecer procedimentos em outros sistemas de modelos de insetos emergentes.

Introdução

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Em 1998, Fire and Mello relatado que o RNA de cadeia dupla (ARNcd) pode induzir a inibição da função do gene em Caenorhabditis elegans 1. Esta resposta desencadeada por ARNdc foi denominado ARN de interferência (RNAi), e tal silenciamento de genes mediada por ARNi foi relatado para ser conservado em animais, plantas, fungos e 2-7. Em alguns animais e plantas, as funções de ARNi sistemicamente, o que significa que o efeito pode espalhar a outras células / tecidos onde ARNcd não é introduzida directamente (revisto em 8-10). Os cientistas fizeram uso desta resposta RNAi celular endógeno através da concepção de dsRNAs para alvejar genes de interesse, batendo assim, reduzir a função do gene, sem manipular diretamente o genoma (revisto em 11-14).

RNAi é uma poderosa ferramenta para estudos funcionais devido às seguintes vantagens. Em primeiro lugar, mesmo com informação da sequência do gene mínimo, um gene pode ser alvejado usando RNAi. Isto é especialmente importante para rudies de organismos não-modelo que faltam dados genômicos ou transcriptomic. Em segundo lugar, em organismos em que a resposta é robustamente ARNi sistémica, RNAi mediada por silenciamento de genes pode ser realizado em praticamente qualquer estágio de desenvolvimento. Este recurso é muito útil para estudar a função de genes pleiotrópicos. Em terceiro lugar, em alguns casos, os efeitos de ARNi para espalhar as gónadas e descendência, tais fenótipos que são observadas em prole 15,16. Este fenómeno, conhecido como parental RNAi (pRNAi), é especialmente vantajoso para os genes que afetam o desenvolvimento embrionário, tão numerosos descendentes produzidos por um único pai injetada podem ser examinados sem manipulação direta de ovos. Por estas razões, pRNAi é o método de escolha. No entanto, se pRNAi é ineficaz, por exemplo, para os genes necessários para a oogénese, então embrionário RNAi (eRNAi) deve ser usado. Em quarto lugar, o RNAi pode ser utilizado para gerar o equivalente a uma série de alelos em que a quantidade de ARNcd entregues pode ser variada ao longo de uma gama para produzir fraco para defeitos fortes. Tal gradação de fenótipos podem ser úteis para a compreensão da função do gene quando o gene está envolvido num processo complexo e / ou perda completa da função é letal. Em quinto lugar, a entrega de dsRNA é geralmente fácil e viável, especialmente em animais que mostram robustos respostas RNAi sistémicos. dsRNA pode ser introduzido por microinjeção 1,5, alimentação / ingestão 17,18, imersão, 19,20 e vírus / entrega de bactérias mediadas 21,22. Em sexto lugar, ao contrário de alguns genes métodos de segmentação / edição, não há necessidade para triagem de organismos portadores da mutação ou para realizar cruzamentos genéticos para gerar homozigotos ao usar RNAi. Portanto, em comparação com muitas outras técnicas para o estudo da função dos genes, RNAi é rápido, barato, e pode ser aplicado para telas de grande escala 23-25.

A ampla utilidade de RNAi fornece meios para realizar estudos funcionais em uma ampla gama de organismos, ampliando a gama de espécies disponíveis para estudo beyond os sistemas de modelos tradicionais para as quais foram desenvolvidas ferramentas genéticas. Por exemplo, estudos usando sistemas não-modelo são obrigados a dar insights sobre a evolução de genes e redes de genes, comparando as funções de ortólogos de espécies que representem os diferentes modos de desenvolvimento ou exibindo características morfológicas distintas 26-29. Estes tipos de estudos irá proporcionar uma melhor compreensão da diversidade biológica, com impactos para a pesquisa aplicada e básica.

Sendo o maior grupo de animais no planeta, insetos fornecem uma grande oportunidade para explorar os mecanismos diversidade subjacente. Além disso, os insetos são geralmente pequenos, têm ciclos de vida curtos, alta fecundidade, e são fáceis de criar em laboratório. Nas últimas duas décadas, RNAi tem sido aplicado com sucesso em insetos abrangendo encomendas, incluindo Diptera (moscas verdadeiras) 5, Lepidoptera (borboletas e mariposas) 30, Coleoptera (besouros) 16,31, Hymenoptera (Sawfmentiras, vespas, formigas e abelhas) 32, Hemiptera (percevejos), Isoptera (cupins) 34, Blattodea (baratas) 35, Orthoptera (grilos, gafanhotos, gafanhotos e gafanhotos) 36 e Phthiraptera (piolhos) 37. Aplicação bem sucedida de RNAi forneceu dados funcionais para estudos de padronização na embriogênese precoce (eixo ântero-posterior 32, eixo dorso-ventral 28, segmentação 26,38), a determinação do sexo 39,40, quitina / cutícula biossíntese 41, ecdisona sinalização 42, comportamento social 43, e muito mais. ARNi métodos desenvolvidos para diferentes espécies de insectos pode ser um benefício adicional na medida em que eles são susceptíveis de serem úteis para o controlo de pragas (revisto em 44-46). efeitos de RNAi será tão bem como específicas de espécies específicas de gene, enquanto regiões não conservados são escolhidos para segmentação. Para as espécies de insetos benéficos como abelhas e bichos da seda, tendo como alvo genes vitais para a sobrevivência devírus ou parasitas para controlar a infecção pode proporcionar uma nova estratégia para proteger estas espécies 47,48.

Dermestes maculatus (D. maculatus), nome comum hide besouro, é distribuído em todo o mundo, exceto na Antártida. Como um inseto holometabolous, o ciclo de vida D. maculatus inclui embrionário, larval, pupal e estágios adultos (Figura 1). Porque se alimenta de carne, D. maculatus é usado em museus para esqueletizar animais mortos e entomologistas forenses podem usá-lo para estimar o tempo de morte 49,50. D. maculatus alimenta de produtos de origem animal, incluindo carcaças, carne seca, queijo e as pupas / casulos de outros insetos e, assim, provoca danos às famílias, alimentos armazenados, e a seda, queijo e indústrias de carne 51,52. Aplicando RNAi neste besouro poderia fornecer uma maneira eficiente e ambientalmente amigável para minimizar o seu impacto económico. Nosso laboratório tem usado D. maculatus como um novo modelo inseto para estudar segmentação 53. Além de ser passível de criação do laboratório, D. maculatus é de interesse para a investigação fundamental, pois é um desenvolvedor intermediário de germes, tornando-se uma espécie úteis para estudar a transição entre o curto eo desenvolvimento a longo germe.

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Figura 1: Ciclo de Vida de D. maculatus. Fotografias de D. maculatus em diferentes fases da vida, como indicado. O ciclo de vida de ovo a adulto demora três semanas a 30 ° C, mas mais tempo em temperaturas mais baixas. (A, F) de embriões recentemente estabelecidas são de cor branca a amarelo claro e oval, aproximadamente 1,5 mm de comprimento. Embriogênese leva ~ 55 h a 30 ° C. (B, C e G) As larvas têm listras escuras pigmentados e são cobertas com cerdas. As larvas passam por vários estádios, dependendo do ambiente e seu comprimento pode estender-se a mais de 1 cm. (D, H) (E, I) Logo após a eclosão, pigmentação escura aparece sobre o corpo adulto besouro. Os adultos podem viver até vários meses e uma fêmea pode colocar centenas de embriões sobre sua vida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Anteriormente, mostramos que a RNAi é eficaz para derrubar a função do gene em D. maculatus 53. Aqui a nossa experiência criação de colônias de D. maculatus em laboratório é compartilhada junto com o passo-a-passo protocolos para ambos embrionário e parental RNAi set-up, injeção, cuidados pós-injeção, e análise fenotípica. O knockdown e métodos de análise de genes dsRNA mediadas introduzidas aqui não só fornecer informações detalhadas para abordar questões em D. maculatus, mas também têm potencial relevância for aplicação de RNAi em outros não-modelo besouro / espécies de insetos.

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Protocolo

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1. Criação de D. maculatus

NOTA: A colônia de reprodução de D. maculatus foi criado em laboratório dos autores usando adultos e larvas adquiridos comercialmente. A identidade da espécie foi verificada utilizando DNA barcoding 53.

  1. Para configurar uma nova gaiola no laboratório, espalhe uma fina camada de aparas de madeira em uma gaiola de insetos de tamanho médio (30,5 x 19 x 20,3 cm3). Coloque a ~ 10 x 6 x 3 cm 3 pedaço de isopor na gaiola para deixar hide larvas para pupation. Adicionar 20 - 50 besouros (adultos ou larvas tarde). Besouros vai esconder nas aparas de madeira.
  2. Adicionar comida de gato molhado em uma placa de Petri ou um barco de pesagem. Cobrir a gaiola com um pano de malha e colocar a gaiola numa incubadora.
  3. Para a manutenção de uma colónia de reprodução no laboratório, ajustar a temperatura entre 25 e 30 ° C. D. maculatus cresce mais rapidamente a temperaturas mais elevadas, mas isto também promove o crescimento de fungos e ácaros. Para manter uma curartua colónia, use 25 - 28 ° C para a manutenção estoque regular e 30 ° C para a rápida expansão da colônia. O ciclo de vida leva aproximadamente três semanas a quatro meses, dependendo de fatores ambientais 50 (Figura 2).

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Figura 2: D. maculatus Lab Colony. Fotografia de uma típica inseto gaiola D. maculatus é mostrado. aparas de madeira são espalhadas para deixar os besouros esconder. comida de gato é adicionado em uma pequena placa de Petri ou pesando barco. Isopor é colocado na gaiola como um refúgio para larvas final para pupate. A gaiola mostrado aqui é 30,5 x 19 x 20,3 cm3 e abriga algumas centenas de larvas, pupas e adultos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. pradove ovos na gaiola para amadurecer. Para expandir a colônia, estabelecer novas gaiolas com ovos (recolhidos como descrito na Seção 2), larvas ou adultos, como acima. D. maculatus põem ovos em toda a gaiola, especialmente perto da fonte de alimento.
  2. Substitua alimentos gato molhado cerca de duas vezes por semana.
    NOTA: Devido ao odor desagradável de comida de gato molhado, fontes alternativas de alimentos também foram testadas (ver discussão).

Coleção 2. Embrião

  1. Para configurar uma coleção, separar, pelo menos, 50 machos e 50 fêmeas da colônia. Os jovens adultos são os melhores. Adultos lugar em um tamanho mini-cage (17,8 x 10,2 x 12,7 cm3) sem aparas de madeira. Adicionar comida de gato em um barco de pesagem.
  2. Antes de iniciar a coleta, verifique a gaiola cuidadosamente qualquer embriões presentes e removê-los. Coloque uma bola de algodão esticado na gaiola, e deixar a gaiola em um 30 ° C incubadora. Após a janela de tempo adequado, a bola de algodão estará pronto para a colheita de embriões.
  3. Dobraum pedaço de papel de construção preto (tamanho A4) ao meio para criar um vinco, em seguida, desdobre.
  4. Retire a bola de algodão esticado da gaiola. Remover adultos da bola de algodão e colocá-los de volta para a jaula.
  5. Ao ajeitar a bola de algodão esticada muito suavemente, rasgá-la lentamente em filamentos de algodão fino para deixar os ovos caem no papel preto.
    NOTA: embriões D. maculatus são frágeis e difíceis de ver em algodão. Eles podem ser facilmente esmagado se segurando a bola de algodão com muita força.

3. Preparação dsRNA

  1. Preparação molde de ADN para síntese de dsRNA
    1. Executar 4 - 6 reacções de PCR de 50 ul, utilizando iniciadores contendo sequências do promotor T7 em ambos os terminais 5 'para amplificar molde de ADN de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Purifica-se o produto de PCR, utilizando um kit de purificação de PCR comercial, seguindo as instruções do fabricante. A concentração final ideal de molde de ADN é ≥100 ng / ul.
  2. Injecção tampão de preparação de
    1. Preparação de 100 ml de tampão de injecção (0,1 mM de NaH 2 PO 4, 5 mM de KCl). Ajustar o pH para 6,8 com NaOH 5 M.
    2. alíquotas armazenar a -20 ° C.
  3. dsRNA Síntese
    1. Defina-se uma reacção em um tubo de 0,2 mL de PCR em gelo e levar a cabo uma reacção de transcrição in vitro com polimerase de T7, seguindo as instruções do fabricante, usando o modelo de ~ 500 ng por reacção.
    2. Incubar o tubo a 37 ° C durante a noite.
    3. Digerir o molde de ADN com ADNase, seguindo as instruções do fabricante.
    4. Aqueça o tubo a 94 ° C e manter a 94 ° C durante 3 min.
    5. Para emparelhar o ARNcd, lentamente arrefecer o tubo de 1 ° C / min até atingir 45 ° C após 1 hora.
      NOTA: As etapas através 3.3.2 3.3.5 pode ser realizada em um termociclador.
    6. Ao etanol precipitado de dsRNA, adicione 280 mLda RNase água livre de 20 ul de reacção para ajustar para um volume final de 300 ul. Adicionar 30 uL de NaOAc 3 M (pH 5,2) e 650 ul de etanol. Coloque tubo no freezer -20 ° C durante a noite.
    7. Após centrifugação a 15682 xg durante 30 min a 4 ° C, lava-se a pelete ARNcd com 70% de etanol. sedimento seco e dissolve-se em 20 ul de tampão de injecção.
    8. Medir a concentração de ARNcd utilizando um espectrofotómetro a A260. A concentração ideal é 3-5 mg / mL. Para verificar a qualidade de execução 5 ul de uma diluição 1:25 de ARNcd num gel de agarose a 1%, a 90 V durante 30 min. Uma única banda de tamanho esperado será facilmente visível.
    9. Armazenar o ARNcd a -20 ° C ou mais frio.
      NOTA: Para cada experimento knockdown RNAi, inclui um controlo do ARNcd, o qual não seria de esperar que o processo de impacto a ser estudada. GFP dsRNA é um excelente controle para a maioria dos experimentos. Preparar e injectar os ARNcd de controlo de lado-a-lado com o experimental dsRNA.

4. Montagem de microinjetor e Micromanipulator

NOTA: Ver Figura 3.

  1. Conectar azoto ou outro fornecimento de ar para a entrada de pressão de um instrumento de bomba pneumática. Se uma bomba pneumática não é possível, aplicar a pressão, utilizando uma seringa de 50 ml ligado a tubos finos.
  2. Ligar um interruptor de pé para o conector remota da bomba para controlar o fluxo da pressão de ejecção.
  3. Anexar um suporte capilar de vidro à porta de pressão de ejeção da bomba com tubo.
  4. Fixar o suporte do capilar em um micromanipulador perto de um microscópio de dissecação.

5. Embryonic RNAi

NOTA: A Figura 4 mostra um fluxograma de D. maculatus embrionário RNAi.

  1. eRNAi Preparação
    1. Prepara-se uma recolha de embriões tampa placa de Petri (90 mm de diâmetro). Coloque um pedaço de papel de filtro de C pretosobre o interior da tampa. Coloque uma lâmina de microscópio padrão no papel preto.
    2. Dilui-se a concentração adequada de ARNcd com tampão de injecção. Use 2-3 mg / mL para as experiências iniciais. Manter sempre ARNcd em gelo antes da injecção.
    3. Adicionar corante alimentar à diluição 1:40 para o ARNcd e pipeta suavemente várias vezes para misturar bem.
  2. Coleta de embriões para Injection
    NOTA: A 25 ° C, os núcleos em embriões de 6 - 8 horas após a postura de ovos (AEL) migram para o ovo periferia 53. A blastoderm celular é estabelecido 8-10 hr AEL 53. Para garantir embriões antes da fase blastoderm celulares são usados para injeção, 0 - embriões AEL 3 hr são recomendados para uso 53. de colheita de embriões, preparação e injeção geralmente levam menos de 2 horas, se os capilares de vidro estão em boa forma. Portanto, todo o processo pode ser concluído no prazo de 5 horas AEL.
    1. Recolhe embriões como descrito nos passos 2.2-2.5.
    2. Toque no papel de construção preto para transferir embriões em recolher tampa placa de Petri.
    3. Cole fita dupla face ao longo da borda do slide.
    4. Usando um pincel, alinhar os embriões na fita perpendicularmente à aresta de corrediça com o anterior ou extremidade posterior na extremidade. Note-se que as extremidades anterior e posterior de embriões precoces não são facilmente distinguíveis, assim, em média metade vai ser injectado na extremidade posterior, que é o ideal.
  3. Carregando o dsRNA no capilar de vidro
    1. Tome-se 2 - 4 ul de dsRNA em um 20 l ponta microloader pipeta.
    2. Insira a ponta de um capilar de vidro pré-puxado (referido como agulha) e gentilmente pipeta a solução de ARNdc para o capilar. Prepare agulhas de capilares de vidro comerciais, utilizando um extrator micropipeta. Um exemplo de uma agulha puxada ideal é mostrada na Figura 5. O comprimento e conicidade de agulhas pode precisar de ser optimizada afensaios de injecção ter.
    3. Fixar o capilar de vidro no suporte do capilar de vidro.
    4. Montar o suporte do capilar para o micromanipulador.
  4. Injetando dsRNA em embriões
    1. Transferir cuidadosamente a lâmina com embriões na fase de microscópio de dissecação.
    2. Mover a corrediça para trazer um embrião para o centro do campo e foco microscópio.
    3. Posicionar a ponta do capilar com o micromanipulador ao olhar para o microscópio de dissecação. Coloque a extremidade perto do final do primeiro embrião na linha.
    4. Ligue o azoto ou outro abastecimento de ar.
    5. Colocar o seletor de entrada do solenóide de vácuo.
    6. Ajuste o regulador de pressão de ejeção para 10 - 15 psi. Ajuste da pressão em função do aparelho.
    7. Abra o capilar se necessário. Uma vez que a ponta é aberta, a solução ARNcd colorida irá encher a ponta.
    8. Mova a ponta capilar para a frente para perfurar o embryo. Se o ajuste de pressão é ideal, nenhum fluido embrionário fluirá no capilar.
    9. Passo sobre o interruptor de pé para ejectar solução de ARNdc para o embrião até que uma quantidade adequada de solução é ejectado. A Figura 5 mostra exemplos de morfologia do embrião após montantes adequados e inadequados de solução foram injetados.
    10. Mantenha a ponta capilar no interior do embrião para ~ 2 segundos e, em seguida, removê-lo.
    11. Mova o capilar para a próxima embrião e repita os passos 5.4.8 - 5.4.10 até que todos os embriões são injetados. Alterar capilar de vidro se ele fica obstruído ou quebras.
  5. A recuperação pós-injeção e Incubação
    1. Após a injeção, coloque o slide em uma placa de Petri.
    2. Adicionar uma bola de algodão molhado para a placa de Petri. Não deixe a bola de algodão tocar o slide.
    3. Cubra o prato Petri e envolvê-la com vedação filme. Rotular o prato com o nome do ARNcd, concentração, data, hora e número de injectadoembriões.
    4. Colocar a placa de Petri numa incubadora a 30 ° C até que a escotilha embriões.

6. RNAi Parental

  1. Isolando Pupae para pRNAi
    1. Recolha pupas da colônia.
    2. Ordenar masculino e pupas fêmeas sob o microscópio (veja a Figura 6). Mantê-los em duas placas de Petri separadas em uma incubadora a 30 ° C para assegurar que não ocorre acoplamento antes da injecção.
    3. Verifique todos os dias para adultos eclosed. Pupation normalmente leva 5 - 7 dias a 30 ° C.
    4. Transferência eclosed machos e fêmeas (veja Figura 6) para duas placas de Petri separadas e alimentá-los comida de gato a cada dois dias até que estejam prontos para injecção.
    5. Avance para injecção uma vez que há suficientes mulheres e homens em idade apropriada. As fêmeas 4 a 8 dias pós-eclosão são as melhores. Para uma análise típica, 8 - 12 fêmeas são usados. Um número igual de homens são necessários para acasalamento 54.
    2. Injetando dsRNA em Feminino Abdome
    1. Prepare dsRNA no gelo (5.1.2 e 5.1.3).
    2. Coloque uma agulha 32-gauge a uma seringa de 10 mL.
    3. Anestesiar fêmeas sobre o CO 2 palco.
    4. Coloque solução dsRNA para a seringa sem ocupar qualquer ar.
    5. Segure um lado ventral do sexo feminino com uma mão e segure a seringa com a outra.
    6. Suavemente penetrar no segmacoria (membrana) entre esternitos 2 e 3 com a ponta da agulha. A Figura 7 mostra uma fêmea durante a injecção. Se a agulha não penetra no tecido com facilidade, aponte a seringa para cima e pressione lentamente para baixo. Inserção de aproximadamente 2 mm de comprimento da agulha no corpo.
    7. Verifique a escala da seringa, enquanto lentamente empurrando o êmbolo, injectando ~ 2 l por fêmea.
    8. Depois de injectar, segure a agulha ainda por pelo menos 5 segundos antes de a retirar do abdômen da fêmea.
    9. Transferir as fêmeas injectados para uma placa de Petri (diâmetro 90 mm) e se alimentam com comida de gato.
    10. Rotular a placa de Petri com o nome de dsRNA, quantidade injectada, a data eo número de fêmeas.
  2. A recuperação pós-injeção e Acasalamento
    1. Incubar a placa de Petri numa incubadora a 30 ° C.
    2. Após 24 horas, a transferência injetado fêmeas para um mini gaiola.
    3. Adicionar à gaiola igual número de uninjected jovens do sexo masculino, e rotular a gaiola.
    4. Adicionar um barco de pesagem, com comida de gato na gaiola.
    5. Deixar a gaiola em uma incubadora a 30 ° C para permitir que o acasalamento. Após 24 horas, as fêmeas devem começar a pôr ovos e embriões podem ser coletadas diariamente ou em intervalos de tempo necessários.

7. Análise fenotípica após ARNi

NOTA: A 30 ° C, leva ~ 55 horas para os ovos para chocar 50.

  1. Análise de Viabilidade eRNAi
    1. Calcule a taxa de eclosão, comparando o número de larvas eclodidas ao nu total dember dos embriões injectados. Certifique-se de incluir uma injecção de controlo negativo como embriões podem ser prejudicados ou mortos pelo procedimento de injeção. taxas de escotilha típicos variam de 30% - 60%. Cuidado com larvas eclodidas comer ovos não eclodidos.
  2. Análise de Viabilidade pRNAi
    NOTA: Se a viabilidade do sexo feminino é impactado pelo gene alvo de RNAi, as fêmeas injetados com dsRNA específica, mas não controle negativo dsRNA vai começar a morrer. Se a produção de ovos ou a colocação de ovo é afetado, as fêmeas vão expor esterilidade parcial ou completa. Pontuação sobrevivência do sexo feminino em comparação com controles negativos ou comparar número total de ovos postos pelas fêmeas experimentais e de controlo (7.2.3).
    1. Configure de colheita de embriões passo seguinte 2.2.
    2. Após 24 horas, recolher embriões seguintes passos 2.4 - 2.5.
    3. Contar o número total de embriões.
    4. Transferir os embriões para uma placa de Petri de 90 milímetros. Rotular o prato de Petri com o gene alvo, a data de recolha, e o número de embriões.
      5. Incubar os embriões em um C incubadora de 30 ° até que choquem. Desde larvas alimentam-se chocado com embriões não eclodidos, verifique a placa de Petri com frequência e separada larvas eclodiram a partir de embriões não eclodidos usando uma pinça (ver discussão).
  3. Contar o número de embriões eclodidos e calcular a taxa de eclosão.
  • Examinando Defeitos cutícula larvas eclodidas
    1. Recolhe larvas eclodidas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Em um exaustor, adicionar 1 ml de Fixation Solution.
    3. Deixar o tubo de microcentrífuga a 4 ° C, pelo menos durante a noite para permitir que a solução penetrar no tecido das larvas.
    4. Para visualizar, remover tanto fixador do tubo quanto possível.
    5. larvas de enxaguamento, pelo menos, três vezes com PBST.
    6. Transferência das larvas para uma placa de vidro multi-poços com PBST utilizando uma ponta de pipeta P-1000 com a extremidade cortada a alargá-la.
    7. Sob um microscópio de dissecação, esticar larvas usando uma pinça para examinar defeitos. Eut é fundamental para esticar as larvas para examinar defeitos como seu contrato corpos em fixador.
  • Examinando Defeitos cutícula Unhatched Larvas
    Nota: Este procedimento é útil para análise de fenótipos embrionárias precoces, especialmente para embriões que não sobrevivem até a eclosão.
    1. Para pRNAi, adicionar PBST para a placa de Petri (7.2.4) e transferência de embriões não eclodidos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando uma ponta de pipeta P-1000 com a extremidade cortada. Para eRNAi, adicione PBST na placa de Petri (5.5.4), escova embriões não eclodidos fora da lâmina de microscópio e transferi-los para um tubo de microcentrífuga.
    2. Fixar os embriões com Fixation Solution e lavá-los com PBST para visualização seguindo os passos 7.3.2 - 7.3.6.
    3. Utilizando uma pinça, dissecar embriões para fora da casca do ovo sob um microscópio de dissecação em PBST.
    4. Transferir os embriões de volta ao tubo de 1,5 ml de microcentrífuga (~ 200 ul de embriões em cada tubo).
    5. Remover o máximo de solution possível.
    6. Adicionar 1 ml de 90% ácido láctico / EtOH a 10%. Deixar o tubo de centrifugação numa incubadora a 60 ° C, pelo menos durante a noite.
      NOTA: Os embriões podem ser deixados a 60 ° C durante vários dias.
    7. Para montar os embriões, Pipeta-los para uma lâmina de microscópio utilizando uma ponta de pipeta P-1000 com o fim cortado.
    8. posicionar manualmente os embriões com uma pinça para uma orientação ideal.
    9. Cobrir os embriões com uma tampa-derrapante e visualizar ao microscópio utilizando DIC.
  • Examinando Defeitos Celular e Molecular
    NOTA: Este procedimento é útil para investigar as causas subjacentes da fenótipos cutícula ou letalidade que não é acompanhado por defeitos cutícula.
    1. Para pRNAi, embriões separados de bolas de algodão em fase de desenvolvimento apropriado e transferi-los para uma cesta de embrião de coleta. O cesto de recolha pode ser o mesmo ou semelhante ao utilizado para conjuntos de embriões de Drosophila.
      1. Façoo cesto de ovo a partir de um frasco de cintilação de 25 ml de plástico com o fundo do frasco removido, e um corte de círculo para fora da tampa (cerca de 1 cm de diâmetro). Coloque um círculo de super fino de malha de cerca de 2,5 cm de diâmetro no interior da tampa, e aperte o frasco de cintilação e usar de cabeça para baixo.
      2. À medida que a malha pode ser facilmente removida uma vez que os embriões são lavados, imergir a malha num tubo de microcentrífuga com água para se recuperar quaisquer embriões que furam para a malha.
    2. Para eRNAi, na fase adequada, adicionar PBST para a placa de Petri. Escovar os embriões fora da lâmina de microscópio e transferi-los para uma cesta de embrião de coleta.
      NOTA: Fixação, hibridação in situ, de coloração de anticorpos, e protocolos de coloração nuclear pode ser encontrado em Xiang et al. 2015 53.

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    Resultados

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Laboratório dos autores tem utilizado tecnologia de RNAi para estudar a evolução funcional dos genes que regulam a segmentação em insetos 53,55. Enquanto todos os insetos são segmentadas, os genes que regulam este processo parecem ter divergido durante radiações insetos 26,38,56-63. Telas genéticos em Drosophila identificou um conjunto de nove genes de segmentação par de regras que são responsáveis por promover a formação de segmentos corporais 64-70.<...

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    Discussão

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Enquanto um pequeno número de sistemas de modelos sofisticados (ratos, moscas, vermes) foram desenvolvidos durante o século 20, o século 21 tem visto uma onda de novos sistemas animais sendo desenvolvidos em laboratórios de todo o mundo. Estes novos sistemas permitem aos cientistas para abordar questões comparativas, evolutivos que não podem ser sondados utilizando apenas os sistemas de modelo 'padrão'. Essa implantação de novos modelos requer o rápido desenvolvimento de métodos para a cult...

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    Divulgações

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Os autores não têm nada a divulgar.

    Agradecimentos

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Agradecemos aos Drs. Alison Heffer e Yong Lu por configurar o aparelho de microinjeção e compartilhar seu inestimável conhecimento e experiência com o RNAi do inseto. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01GM113230 a L.P.).

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Dermestes maculatus besouros vivosNosso laboratório ou Carolina Biological Supply#144168Nossa cepa de laboratório foi verificada por código de barras COI; a variação da cepa da Carolina não pode ser descartada
    Comida de gato úmidaFancy FeastPedaços de carne com molho. Pode comprar na maioria dos alimentos para animais de estimação e mercearias
    Ração seca para cãesPurina Puppy ChowPode comprar na maioria dos alimentos para animais de estimação e mercearias
    Gaiola de insetos (tamanho médio, 30,5 x 19 x 20,3 cm)Exo TerraPT2260Para manutenção de colônias. Pode usar gaiola maior, se necessário
    Gaiola de insetos (tamanho mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)Exo TerraPT2250Para coleta de embriões
    Placa de PetriVWR89038-968
    Bola de algodãoFisher22-456-883
    Megascript T7 kit de transcriçãoFisherAM1334Para 40 reações
    Bomba pneumáticaWPIPV830
    Suporte capilarWPI
    MicromanipuladorNARISHIGEMN-151
    Papel de filtro preto (90  mm)VWR28342-010
    Corante alimentar (verde)McCormick
    Capilar de vidro borossilicatoHilgenberg1406119
    Extrator de agulhas (extrator de micropipetas)Sutter Instrument Co.P-97
    WorldWide Life Sciences Division41351157
    Sealing film (Parafilm M)Seringa Fisher13-374-12
    Modelo 801 (10  µ l)Agulha Hamilton7642-01
    (calibre 32) Solução de fixação Hamilton7762-05
    (Pampel's)BioQuip Products, Inc.1184CTóxico, precisa ser manuseado em fórceps de capela
    de exaustão (DUMONT #5)Ferramentas de Ciências Finas11252-30
    Lamínula (24 x 50 mm, nº 1.5)Scientific1415-15
    Eppendorf Femtotips Microcarregador Microscopia
    para injeção de embriõesLeicaM420
    Microscopia de dissecação para visualização fenotípica larvalZeissSteREO Discover. V12
    DIC microscopiaZeissAXIO Imager. M1
    Lâmina de vidro para microscópio Ponta de pipeta Globe de dissecação Fisher E5242956003

    Referências

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