É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

9K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/54981

⸱

10 de fevereiro de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

Neste artigo

Resumo

Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.

Resumo

Na doença de Parkinson (DP) não há perda neuronal generalizada em todo o cérebro com a degeneração dos neurónios dopaminérgicos pronunciada no Snc, levando a bradicinesia, rigidez e tremores. A identificação dos que vivem neurônios dopaminérgicos em culturas primárias Ventral mesencefálico (VM) usando um marcador fluorescente fornece uma forma alternativa para estudar a vulnerabilidade seletiva desses neurônios sem depender da imunocoloração das células fixas. Aqui, isolamos, dissociar e cultura rato neurônios VM para 3 semanas. Em seguida, identificar os neurónios dopaminérgicos em culturas usando eGFP fluorescência (conduzido por um promotor Tirosina Hidroxilase (TH)). neurónios individuais são colhidas em tubos de microcentrífuga utilizando micropipetas de vidro. A seguir, lisar as células colhidas, e realizar a síntese de cDNA e "tagmentation" mediada por transposão para produzir bibliotecas de ARN-Seq monocelulares 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Depois de passar uma verificação de controlo de qualidade, as bibliotecas de uma única célula são sequenciados e subsequente análise é realizada para medir a expressão do gene. Nós relatamos resultados transcriptoma para dopaminérgico individual e neurônios GABAérgicos isolados a partir de culturas do mesencéfalo. Relata-se que 100% das células vivas TH-eGFP que foram colhidas e foram sequenciados os neurónios dopaminérgicos. Essas técnicas terão vastas aplicações em neurociência e biologia molecular.

Introdução

Doença de Parkinson (DP) é, uma doença neurodegenerativa incurável relacionada com a idade. A causa desta doença relativamente comum permanece mal compreendido. Há uma perda generalizada neuronal em todo o cérebro, com a degeneração neuronal acentuada de neurónios dopaminérgicos da substância negra (SNC), levando a características clínicas de diagnóstico de bradicinesia, rigidez e tremor.

culturas mistas primárias contendo neurônios dopaminérgicos SNc são especialmente relevantes para a doença de Parkinson. Ventral tegmental Área (VTA) neurônios dopaminérgicos têm sido implicados na recompensa e vício. Ventral mesencefálico (VM) culturas embrionárias mistos primários contêm ambos os neurônios SNC ou a VTA dopaminérgico (DA) e neurônios GABAérgicos. VM culturas primárias podem ser úteis para ensaios de neuroproteção e para elucidar a vulnerabilidade selectiva dos neurónios dopaminérgicos. Não há nenhuma maneira confiável para identificar células dopaminérgicas na cultura com base na morfologia. Elere desenvolvemos técnicas para identificar e colher neurónios dopaminérgicos individuais e construir uma única célula, de alto rendimento bibliotecas RNA sequenciamento.

Relatamos dados RNA transcriptoma representativos para única dopaminérgica e neurônios GABAérgicos isolados a partir de culturas do mesencéfalo. Este protocolo pode ser utilizado para a neuroprotecção, a neurodegeneração, e os ensaios farmacológicos para estudar os efeitos de vários tratamentos no transcriptoma DA / GABA. Porque neurônios dopaminérgicos representam uma pequena minoria dos neurônios expressas em culturas primárias de VM, a capacidade de identificar com segurança esses neurônios em culturas que vivem permitirá uma gama avançada de estudos de uma única célula. Essas técnicas inovadoras facilitar avanços na compreensão dos mecanismos que ocorrem no nível celular e pode ter aplicações em outros lugares nos campos da biologia molecular e neuroscience.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

NOTA: Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações para o cuidado e uso de animais fornecidos pelos Institutos Nacionais de Saúde e protocolos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal no Instituto de Tecnologia da Califórnia.

1. Derivação da Primária dopaminérgicos culturas celulares embrionárias mouse Cérebro

  1. Soluções e Meio de Cultura
    1. Preparação de Ácido Ascórbico da Solução
      1. Pesar 352 mg de ácido ascórbico. Adicionar estéril H 2 O para um volume total final de 20 mL. Lugar no 37 ° C banho de água para dissolver. Filtrar com ponta de seringa de 0,2 mm e armazenar em 500 mL alíquotas a -20 ° C.
    2. Preparação da solução de papaína
      1. Dilui-se papaína de 15 unidades / mL em 1x solução de sal Hanks'-equilibrada (HBSS). Pipeta cima e para baixo 5 vezes para misturar bem. Prepare no dia da dissecção.
    3. Preparação de Solução Stock de ADNase
      1. Pesar 20 mg de DNase. Adicionar estéril H 2 O para um volume final total de 20 mL. Filtrar em condições estéreis com 0,2 um filtro de seringa de ponta. Armazenar a -20 ° C em alíquotas de 1 mL.
    4. Preparação de solução de paragem
      1. Dilui-se 5 ml de soro de cavalo dador equino a 10% em 45 mL de HBSS 1x. Filtrar em condições estéreis com um filtro de ponta de seringa de 0,2 | im. Armazenar a 4 ° C.
    5. Preparação de albumina de soro bovino (BSA) a solução stock de 4%
      1. Pesar 2 g de BSA e adicionar 1x com fosfato salino tamponado (PBS) para um volume final total de 45 mL. Filtrar esterilizar com 0,2 um filtro de seringa de ponta. Armazenar a 4 ° C.
    6. Preparação de chapeamento Médio
      1. Em 494 ml de meio, adicionar 1,25 mL de meios de cultura que contém L-alanil-L-glutamina (uma fonte estabilizada de L-glutamina) e 5 mL de soro de dador dos equídeos. Filtrar esterilizar com 0,2 um fil seringatip ter. Armazenar a 4 ° C.
    7. Preparação do meio de cultura celular
      1. Em 196 mL meio de plaqueamento, adicione 4 mL B27 e 200 mL de ácido ascórbico. Filtrar esterilizar com filtro de 0,2 um. Guardar a solução a 4 ° C e utilizar no prazo de uma semana.
    8. Preparação de paraformaldeído solução a 4% (PFA)
      Cuidado: precauções gerais para usando paraformaldeído são as seguintes: Use um exaustor, evite pele e dos olhos contato, evitar a inalação do vapor, manter afastado do calor ou chamas. Usar vestuário de protecção individual adequado. PFA pode causar sensibilização e dermatite, portanto, lave bem as mãos após o manuseio.
      1. Adicionam-se 10 ml de 16% de PFA a 30 mL de 1x PBS, pH 7,4.
    9. Preparação de 0,1% de Triton X-100
      1. Pipete 1 mL de Triton X-100 em 9 mL de 1x PBS para fazer uma solução a 10%. Pipeta lentamente para permitir solução viscosa para preencher ponta da pipeta. Quente no 37 ° C banho de água a disresolver. Armazenar estoque 10% a 4 ° C.
      2. Diluir estoque de 10% para 0,01% (por exemplo, através da realização de 2 diluições em série 1:10: diluir 1 mL de solução a 10% em 9 mL de 1x PBS para fazer uma solução%; 1 mL de uma solução 1%, a 9 ml de PBS 1x fazer solução a 0,1%).
    10. Preparação de 10% e 1% de soro de burro
      1. Adicionar 1 ml de soro de burro a 9 mL de 1x PBS para uma solução a 10%. Adicionar 0,5 ml de soro de burro a 49,5 mL de 1x PBS, pH 7,4 para uma solução a 1%.
    11. Preparação de 1x PBS
      1. Dilui-se PBS 10X para 1x pela adição de 50 mL em 450 mL de H 2 O. Ajustar o pH da solução a pH 7,4 usando um medidor de pH.
  2. O revestimento das placas de cultura
    1. A poli-L-ornitina Revestimento
      1. Revestimento apenas o fundo de vidro 10 mm de diâmetro no centro de todos os pratos de 35 mm com 120 mL de poli-L-ornitina utilizando uma técnica estéril. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Use um aspirador a vácuo para aspirar o poli-Lornithine. Lavar os pratos duas vezes com H 2 O. estéril
    2. Laminina revestimento (concentração estoque de 1 mg / ml)
      1. Diluir 20 uL com laminina 2 ml de H 2 O esterilizada (concentração final de 0,01 mg / mL).
      2. Revestimento somente a 10 milímetros com fundo de vidro de diâmetro no centro de todos os pratos com 120 mL de laminina diluída para 0,01 mg / ml utilizando uma técnica estéril, e incubar durante 1 h ou O / N a 37 ° C antes da utilização.
  3. rato Dissection
    NOTA: Os métodos desta dissecção são concebidos para uma exposição mínima de células, à medida que são transferidas a partir de sacos embrionárias para a incubadora de cultura. A viabilidade das células é preservada através da remoção de apenas uma parte do cérebro para dissecação do mesencéfalo. O isolamento do produto do mesencéfalo mais rapidamente sem a necessidade de dissecar todo o cérebro para aceder à região. Ver tabela de materiais para a estirpe de ratinho utilizada neste estudo.
    1. Euthanize um rato grávida cronometrado em gestacional dia 14 utilizando CO 2.
    2. Pulverizar o abdómen do rato sacrificados com 70% de etanol. Segure a pele do abdome inferior usando uma pinça com 2 x 3 dentes e abrir a cavidade abdominal através de lâmina sem corte tesoura cirúrgica. Faça dois cortes em movimento lateral e proximal de cada lado. Fold através da parede abdominal usando fórceps para expor a cavidade abdominal.
      NOTA: O útero está agora exposta. Expondo a cavidade pleural e criação de pneumotórax também garante que o animal não se recuperar.
    3. Cortar ambas as extremidades da trompa uterina para separar o útero. Coloque em um prato de Petri em uma capa estéril.
    4. Utilizando uma pinça reta de ponta em cada mão abrir o saco embrionário e remover o embrião. decapitar rapidamente por beliscar cabeça no pescoço com a pinça. Estabilizar a cabeça com a pinça firmemente colocado no focinho de modo que a superfície dorsal é acessível.
    5. Usando a pinça realizados no outro hand, aperte a camada de pele eo crânio, pouco antes do cume do mesencéfalo. Retire a pele eo crânio caudalmente ao longo da linha média. Coloque uma pinça em torno do cume com uma ponta entre o córtex e mesencéfalo eo outro sobre o cerebelo.
    6. Comprima e remover todo o mesencéfalo, deixando para trás o prosencéfalo no lado rostral e cerebelo no lado caudal. Colocar num prato de Petri com HBSS frio sob um microscópio de dissecação.
    7. Repita o procedimento para os embriões restantes.
    8. Sob o microscópio de dissecação, virar o segmento cérebro de modo que o lado ventral está agora acessível. Existem agora 4 quadrantes visível. Remover todas as meninges e vasculatura agarrando suavemente as meninges e puxando para cima para longe do cérebro.
    9. Utilize uma pinça para estabilizar o segmento de cérebro enquanto separa o mesencéfalo. Coloque um Tong de fórceps para o ventrículo aproximadamente no centro do segmento. Faça a primeira dorsal pitada, apontando inpara o prato, em seguida, medialmente em cada lado. Tome os dois quadrantes inferiores, fazendo cortes laterais em ambos os lados.
      NOTA: O tecido de interesse está na seção inferior ventral, que aparece densa. Esta região contém tanto o VTA e SNc.
    10. Apare e descartar o tecido que é menos denso: isso inclui o colículos superior e inferior. Colocar o tecido dissecado contendo tanto o VTA e SNc em HBSS fresca sobre uma área separada da placa de Petri.
      NOTA: Nesta fase do desenvolvimento do cérebro do rato (E14), a região de interesse no mesencéfalo ventral é separado por um ventrículo do zona incerta e outros grupos célula hipotalâmica. A estrutura mais alongada do cérebro do rato em desenvolvimento embrionário permite a distinção entre estas zonas, que estão localizados mais perto em conjunto no cérebro do rato adulto.
    11. Repita o procedimento para todos os segmentos do cérebro restantes.
    12. Depois de todos os segmentos cerebrais foram dissecados, utilize uma pinça e um bisturi No. 11 a EA trimestreseção mesencéfalo ch em pedaços de tamanho aproximadamente igual.
  4. Dissociar as células
    1. O tratamento de células enzimática
      1. Use uma ampla calibre ponta P1000 pipeta para ocupar todos os segmentos do mesencéfalo esquartejado no HBSS e colocá-los em um tubo cônico de 15 mL. Deixe os segmentos depositar-se no fundo do tubo e remover a HBSS que foi retomado com as peças esquartejado.
      2. Adicionar 500 uL de solução de papaína para o tubo e colocar num banho de água a 37 ° C durante 15 min. Ressuspender as células por dedo sacudindo o tubo após 7,5 min.
      3. Usando uma ponta P1000 wide-bore, pipetas apenas os segmentos do mesencéfalo em uma alíquota de 1 mL de desoxirribonuclease I solução (DNase). Permitir que os segmentos para assentar no fundo do tubo.
      4. Utilizando uma ponta de P1000 grande calibre, transferir apenas os segmentos do mesencéfalo para um tubo de 15 ml contendo 1 ml de solução de paragem frio para enxaguar. Deixe os segmentos depositar-se no fundo do tubo e repetir o enxaguamento sobrece mais.
    2. A trituração mecânica da suspensão de células
      1. Substituir a última lavagem com 1 mL de solução de paragem fresco e pipeta cima e para baixo 7x com uma ponta P1000 pipeta para triturar as células. Evitar trituração excessiva para minimizar a lise celular.
      2. Subjacente à suspensão de células pipetando lentamente 200 ul de solução de BSA a 4% para o fundo do tubo. Cuidadosamente retire a ponta da pipeta para evitar prejudicar a camada de suspensão de células. Após centrifugação a 280 xg durante 6 minutos, aspirar o sobrenadante com P1000 e ressuspender as células em 1 ml de meio de plaqueamento.
  5. A contagem e plaqueamento das células
    1. Efectuar a contagem de células utilizando um hemocitómetro. Dilui-se a suspensão de células a 1000 células / mL, com meio de plaqueamento.
    2. Usando um aspirador a vácuo, a laminina de aspirar as placas revestidas, em lotes de, no máximo, três pratos. Placa 120 mL (1,2 x 10 5 células / prato (78,5 mm2 )) Da suspensão de células sobre a superfície revestida dos pratos imediatamente após a aspiração de cada lote. Isto impede que os pratos de secar e formar uma superfície irregular.
    3. Após 1 h, adicionar cuidadosamente 3 mL de meio de cultura para uma área não semeada da placa de cultura para minimizar a ruptura das células.
    4. Executar uma metade de mudança de meio completo em placas de cultura de células em intervalos de 3 semanas, durante 3 d.

Neurônios 2. A colheita cultivado-dopaminérgicos para Sequencing RNA

NOTA: Uma visão geral do protocolo de células-colheita e de uma única célula RNA-Sequencing é dado na Figura 1.

  1. Etapas a realizar antes do dia do Experimento
    1. Limpa tubos capilares de vidro de borosilicato submetendo a ultrassons em 100% de etanol durante 15 minutos e, em seguida, de novo em H2O destilada durante 15 min. Drenar o tubo e cozer durante a noite num forno a 200 ° C para inactivar a RNase.
    2. Use recém-inauguradopontas de pipeta isentas de RNase para preparar uma solução de reserva de 10x tampão de reacção por mistura de 19 ul de 10 x tampão de lise a partir do kit de sequenciação com 1 uL da solução de inibidor de RNase (20 mL de volume total) num tubo de microcentrífuga. Spin down a mistura usando brevemente um micro-centrífuga e manter em gelo.
    3. Adicionar 2 mL de tampão 10x a reacção para cada um dos tubos de 0,2 mL de PCR individuais (utilizados para recolher os neurónios colhidas). Rotular os tubos com etiquetas apropriadas para identificar os neurónios a ser colhida e armazenar congelada a 4 ° C.
  2. Passos a executar no dia do experimento
    1. Fabricação das pipetas colheita.
      1. Puxe micropipetas de grande diâmetro de ponta (2-8 um) do tubo capilar cozido usando um extrator de microeletrodos eo filamento de aquecimento revestido de vidro de um microforge. Defina o extrator para formar micropipetas com um longo cone. Use um microforge equipado com uma retícula ocular calibrado e um ob de alta potênciajectivo para quebrar a ponta da micropipeta para o tamanho desejado ponta (10 - 20 um).
      2. Aperte micropipeta no suporte da pipeta a microforge e montar titular para o microforge. Traga a ponta da micropipeta em foco acima do filamento de aquecimento de vidro revestido utilizando o manipulador mecânico do interruptor microforge e em que a corrente do filamento para aquecê-lo. Toque a ponta da pipeta para o filamento aquecido. Desligue a corrente quando a ponta da pipeta derreteu com o diâmetro adequado.
        NOTA. Desligando a corrente fará com que o filamento para mover-se repentinamente para baixo e separar da ponta da pipeta, produzindo uma grande pipeta, aberta de ponta com o diâmetro desejado.
      3. Armazenar as micropipetas concluídos em uma caixa fechada até ser necessário.
    2. Colhendo os neurônios.
      NOTA. Neurónios em cultura foram colhidas depois de uma versão modificada de um protocolo previamente publicado a 6.
      1. completamente clean todas as superfícies da sala de-colheita de células que entram em contacto com os pratos culturas e tubos de coleta usando desinfetante líquido e água, seguida por uma lavagem com água. Limpe as superfícies desinfectados com 80% de etanol e, em seguida, uma RNase inibidor infundido limpe.
      2. Encha dois recipientes isolados com gelo, um com (água) regular de gelo e outro com gelo seco. Coloque os tubos de 0,2 mL de coleta de PCR preenchidos previamente com 2 mL de 10x tampão de reação sobre o gelo regular.
      3. Remova a placa de cultura contendo os neurónios da incubadora, drenar o meio de cultura a partir do prato, lavar com 2 ml de PBS livre de RNase de Dulbecco (DPBS) e substitua com 1 ml de DPBS para a colheita.
      4. Identificar, neurônios TH-positivos fluorescentes nas culturas do mesencéfalo primárias utilizando um invertido, microscópio de epifluorescência equipado com uma objetiva de 40X fase, uma lâmpada de Hg, e um conjunto de filtro GFP.
      5. Posicionar a pipeta através da soma de células usando a mi motorizado ou manualcromanipulator. Aspirar o neurônio na micropipeta de vidro usando sucção suave aplicado por via oral, através do tubo de plástico ligado à porta lateral do suporte da micropipeta. Imediatamente remover a micropipeta, contendo a célula a partir da solução do banho.
      6. Colocar a ponta da pipeta no interior de um tampão de reacção contendo 0,2 mL de PCR tubo de recolha, e quebrar a ponta contra o lado do tubo, perto da parte inferior. Expelir o fluido restante (0,5-1,5 mL) a partir da ponta da micropipeta quebrado pela colocação de uma agulha 21 G seringa estéril no fundo da micropipeta e aplicando pressão para fora.
      7. Centrifugar o tubo de recolha durante 5 s usando um desktop micro-centrífuga e congelá-lo em gelo seco. Armazenar os tubos de colheita contendo as células individuais a -80 ° C. Tipicamente, 5 as células são colhidas por prato ao longo de um período de 1 h à temperatura ambiente.

3. célula única de RNA-Seq Biblioteca Generation

  1. Geração do cDNA da primeira cadeia
    NOTA: Para os passos seguintes utilizam reagentes do kit de sequenciação comercial.
    1. Trazer os reagentes abaixo no gelo para o gabinete PCR. Prepara-se uma primeira mistura principal cadeia mais de 10% por combinação dos seguintes reagentes à temperatura ambiente num armário de PCR: 2 ul de 5x tampão de primeira cadeia, 0,25 ul de DTT (100 mM), 1 uL de mistura de dNTP (10 mM), 1 ul de oligonucleótido ( 12 uM), 0,25 uL de RNase Inhibitor, e 1 uL de transcriptase (100 unidades) inverter. Isto é o inverso de transcriptase master mix (5,5 mL de volume total por reacção).
    2. Leve as amostras do -80 C em gelo seco e trazer para o gabinete de PCR. Adicione o seguinte para a amostra de célula única: 1 mL iniciador 3 '1 e 1 mL quantificados picos de ARN. Traga amostras em um bloco refrigerador para um termociclador predefinido de tampa quente a 72 ° C.
    3. Incubar os tubos no termociclador durante 3 min a 72 ° C, e, em seguida, colocar as amostras sobre uma cremalheira de PCR mais frio.Adicionar 5,5 mL da mistura principal (a partir do passo 3.1.1) a cada tubo de reacção e agitar suavemente por pipetagem. Girar os tubos de 0,2 uL durante 5 s e incubar num termociclador como se segue: 42 ° C durante 90 min, 70 ° C durante 10 min. Manter a 4 ° C.
  2. A purificação da primeira cadeia de ADNc amplificado.
    NOTA: O cDNA amplificado por PCR foi purificado por imobilização com contas magnéticas. Usar um dispositivo de separação magnética para tubos de 0,2 mL.
    1. Alíquota as esferas magnéticas em tubos de 1,5 mL. Antes de cada utilização, trazer alíquotas grânulo até à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min e misturar para dispersar bem. Vortex esferas magnéticas até uniformemente misturado.
    2. Adicionar 25 ul de contas magnéticas para cada amostra. Misture pipetando todo o volume para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar bem. Incubar à temperatura ambiente durante 8 min para permitir a ligação de ADNc para os grânulos.
  3. Preparação de PCR Master Mix
    1. Preparar a mistura de mestre ds-cDNA amplificação por PCR para todas as reações com um additional 10% por mistura de tampão 5 uL de PCR a 10X, 2 ul de mistura de dNTP (10 mM), 2 uL de PCR o iniciador 2 (12 mM), 2 uL de 50x 2 polimerase mix, e 39 uL de nuclease isenta de água (50 mL volume total / reação).
  4. A amplificação de First Strand
    1. Coloque as amostras e as esferas magnéticas sobre o dispositivo de separação magnética ≥5 min, até o líquido ter um aspecto completamente clara, e não existem pérolas deixadas no sobrenadante.
    2. Manter as amostras no aparelho de separação, pipeta-se o sobrenadante e descartar. Rodar as amostras durante 5 segundos para recolher o líquido a partir do lado do tubo. Coloque as amostras no aparelho de separação magnética, durante 30 s, em seguida, remover todo o sobrenadante remanescente com um pipetador de P10.
    3. Adicionam-se 50 ul da mistura principal de PCR a cada tubo contendo ADN ligada às pérolas da etapa anterior. Colocar o tubo em um termociclador pré-aquecido (95 ° C) com uma tampa aquecida. Iniciar a ciclos térmicos com a seguinte program: 95 ° C durante 1 min, 26 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 65 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 6 min. Em seguida, 72 ° C 10 min. Manter a 4 ° C.
      NOTA: Consulte o manual do usuário sequenciamento para mais detalhes e para otimizar as configurações de exemplo.
  5. Purificação de cDNA amplificado Dobro-Encalhada
    1. Adicionar 90 ul de contas para cada amostra. Misture pipetando todo o volume para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar bem. Incubar à temperatura ambiente durante 8 min para permitir a ligação de ADNc para os grânulos. Coloque as amostras mais esferas no dispositivo de separação magnética para ≥5 min, até o líquido ter um aspecto completamente clara, e não existem pérolas deixadas no sobrenadante.
    2. Enquanto as amostras no aparelho de separação magnética, remover o sobrenadante e descartar. Manter as amostras no aparelho de separação magnética. Adicionar 140 uL de acabado de fazer 85% de etanol para cada amostra sem perturbar as esferas. Aguarde 30 s. Pipeta fora o sobrenadante. cDNA permanecerá ligado ao beaDS durante o processo de lavagem.
    3. Repetir a lavagem de etanol mais uma vez.
    4. Resumidamente girar as amostras para recolher o líquido a partir do lado do tubo. Coloque as amostras no aparelho de separação magnética, durante 30 s, em seguida, remover todo o etanol remanescente com uma pipeta. Coloque as amostras à temperatura ambiente durante 2-2,5 min, até que o sedimento é seco e não mais brilhante (isto é, antes de uma fenda aparece).
      NOTA: Secar o pellet somente até que seja apenas seco. O pellet vai olhar fosco sem brilho. Se a pastilha não é seco, etanol permanecerá nos poços de amostra, o que reduzirá a taxa de recuperação de ADNc amplificado e o rendimento. Se o sedimento é sobre-seco, haverá fissuras no sedimento. Vai demorar mais do que 2 minutos para hidratar e pode reduzir a recuperação de cDNA amplificado e rendimento.
    5. Uma vez que os grânulos são secos, adicionar 22,5 mL de tampão de eluição para cobrir o sedimento grânulo. Retirar amostras a partir do dispositivo de separação magnética e misturar completamente para ressuspender as esferas. DentroCubate à TA durante 10 minutos para re-hidratar.
    6. Rodar as amostras durante 5 segundos para recolher o líquido a partir do lado do tubo. Coloque as amostras em volta do dispositivo de separação magnética para ≥1 min, até que a solução está completamente clara.
      NOTA: Uma pequena população de contas pode não agregar contra o íman durante a incubação. Pipetar estes grânulos unpelleted cima e para baixo para ressuspender as com o sobrenadante, e depois pipeta-los para o magneto, onde o resto dos grânulos já sedimentadas (sem perturbar o sedimento existente).
    7. Continuar a incubação até que não os grânulos permanecem no sobrenadante. Transferir o sobrenadante límpido contendo ADNc purificado a partir de cada tubo para um tubo livre de nuclease, de baixa aderência. Rotular cada tubo com informações da amostra e armazenar a -20 ° C. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C indefinidamente.
  6. Medição da concentração de DNA e o tamanho do fragmento
    1. Realizar uma verificação de controle de qualidade por meio da quantificação de 1 mL alIQUOT do ADNc num fluorómetro. Avaliar 1 ul (3 ng) de ADNc-cd, utilizando um sistema de electroforese (como descrito em 1).
  7. A fragmentação de ADN
    NOTA: Use um kit de preparação de ADN da amostra.
    1. Adicionar 20 ul de cDNA (35 ng total) para um tubo. Adicionar 25 uL de ADN Tagment (TD) de tampão ao tubo contendo o ADNc de.
    2. Adicionar 5 uL de TDE1 (Tagment ADN enzima) para o tubo. Pipeta cima e para baixo 10 vezes para misturar. Utilizar uma ponteira nova para cada amostra. Centrifuga-se a 280 xg a 20 ° C durante 1 min.
    3. Coloque as amostras num termociclador com uma tampa aquecida e executá-lo em: 55 ° C, 5,5 min. adicionar rapidamente 50 mL solução QG (kit de extracção de gel). Pipeta cima e para baixo 10 vezes para misturar. Continuar directamente para o passo seguinte.
  8. A purificação do ADN fragmentado
    1. Adicionar 170 mL de contas, pipeta cima e para baixo 10 vezes para misturar. Deixe-a descansar por 10 min. Coloque tubos sobre o ímã. Deixe os tubos de sentar-se no ímã para 10 min.Enquanto as amostras no aparelho de separação magnética, pipeta-se o sobrenadante e descartar.
    2. Deixar o tubo no ímã e adicionar 200 mL de 85% de etanol. Deixe descansar por 30 s, em seguida, remover o etanol. Repetir a lavagem de etanol. Gire a xg tubo de 1.000 em temperatura ambiente.
    3. Coloque o tubo de volta no ímã. Pipeta fora de todo o etanol residual. Deixe as amostras secas à temperatura ambiente durante 15 min.
    4. Adicionar 21 ul de tampão de eluição a partir do kit de extracção de gel. Deixe o tubo de se sentar fora do ímã, pipeta cima e para baixo 10 vezes para misturar. Deixe o tubo de sentar-se à TA durante 15 min.
    5. Retorno do tubo para o ímã para 5 min. Pipetar 20 ul de solução (ADN purificado) para um novo tubo.
  9. Tagging e PCR A amplificação do DNA fragmentado
    NOTA: Nesta etapa, o ADN purificado é amplificado através de um programa de PCR-ciclo limitada. A etapa de PCR também adiciona índice 1 (i7) e índice 2 (i5), bem como adaptadores comuns (P5 e P7) (necessário para a geração de cluster e sequenciamento). Referem-se ao ADN sum amplo guia de preparação para mais detalhes.
    1. Em um novo tubo de adicionar 5 mL de índice de 2 iniciadores (tampa branca). Utilizando uma nova ponta de pipeta adicionar 5 mL de índice 1 Primer (tampa cor de laranja). Adicionar 15 ul de PCR Master Mix para cada tubo.
    2. Adicionar 5 mL de coquetel de PCR de iniciadores a cada tubo. Adicionar 20 ul de ADN purificado para o tubo. Pipeta suavemente para cima e para baixo 3 - 5 vezes.
    3. Executar PCR utilizando o seguinte programa no termociclador: 72 ° C durante 3 min, 98 ° C durante 30 s, 5 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 63 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 3 min. Manter a 10 ° C. Prosseguir imediatamente para a PCR clean-up ou armazenar a amostra a 4 ° C durante até 2 d.
  10. Purificação de fragmentos de DNA amplificado
    1. Traga as contas a RT. Preparar uma solução fresca de etanol 85%. Colher amostras para fora da máquina PCR e girar rapidamente.
    2. Adicionar 30 ul de esferas para o tubo. Suavemente pipeta misturar cima e para baixo 10 vezes. Deixe que o tubo esteja à temperatura ambiente durante 5 min. lugar back on o íman durante 5 min. Com o tubo sobre o íman usar uma pipeta para desprezar o sobrenadante.
    3. Adicionar 200 ul de etanol a 85% a cada tubo. Pipeta de etanol após 30 s. Repetir a lavagem com etanol a 85%. Pipeta de etanol após 30 s.
    4. Com os tubos ainda no ímã e as tampas abertas, permitem que as contas para secar ao ar durante 15 min. Retirar os tubos do ímã.
    5. Adicionar 32.5 ul de tampão de eluição. Pipeta suavemente para cima e para baixo 10 vezes. Incubar fora do ímã para 10 - 15 min.
    6. Retornar os tubos para o ímã por 2 minutos ou até que o sobrenadante foi eliminada. transferir cuidadosamente 30 mL do sobrenadante para um novo tubo.
  11. Medição da concentração de DNA e o fragmento de tamanho
    1. Realizar uma verificação de controlo de qualidade pela quantificação da concentração de ADN de 1 uL do ADNc num fluorómetro. Determinar o tamanho do fragmento de DNA por electroforese. Avaliar 1 mL (3 ng) de ds-cDNA.
  12. Sequencing
    1. Traga as bibliotecas de RNA-Seq célula única a um serviço de sequenciação. Gerar 100 pb sequenciamento lê num sequenciador seguindo um protocolo publicado anteriormente 4.
      NOTA: Cada biblioteca sequenciação gera> 20 milhões exclusivamente mapeamento lê.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Aqui relatamos um protocolo para a cultura de neurónios do mesencéfalo ventral de um ratinho que expressam eGFP accionado por uma sequência de promotor de tirosina-hidroxilase, colhendo neurónios fluorescentes individuais a partir das culturas, e medindo a sua transcriptoma de ARN utilizando ARN-SEQ (Figura 1). Os dados mostraram que 100% das células TH-eGFP-positivos que foram colhidas e sequenciados eram neurónios dopaminérgicos, com base na presença dos três transcrit...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Aqui nós isolar células individuais de uma população heterogênea, utilizando uma etiqueta fluorescente, em seguida, estudar cada célula com uma única célula de RNA-seq. Relata-se que 100% das células vivas TH-eGFP que colhidas e foram sequenciados os neurónios dopaminérgicos, de facto, com base na presença dos três transcritos de genes relacionados com DA seguintes, TH, DDC e SLC6A3. Todas as células positivas TH-EGFP expressa estes três genes como avaliado pela RNA-Seq. Este foi concordante com os estudos eletrofisioló...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (DA017279, AG033954, DA037743), da Fundação Michael J. Fox e da Iniciativa de Inovação Caltech, financiando o Laboratório de Genética e Genômica Millard e Muriel Jacobs no Instituto de Tecnologia da Califórnia. Agradecemos a Brian Williams por otimizar o protocolo da biblioteca RNA-Seq e por fornecer assistência. Agradecemos a Henry Amrhein pelo treinamento computacional. Agradecemos a Barbara J. Wold pelo uso de seu equipamento e espaço de laboratório. Agradecemos a Igor Antoshechkin pelo sequenciamento da biblioteca e pelo gerenciamento das instalações.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Corporação Bioquímica PapainWorthington
Solução salina balanceada LS003126 Hanks (HBSS), 1xGibco 14175-095
Soro Equino de DoadorThermo Scientific SH30074.03
Albumina de Soro Bovino (BSA)Sigma A7030-50G
Medium: Meio neurobasalGibco 21103-049
Meios de cultura que contêm uma forma estabilizada de L-glutamina, L-alanil-L-glutamina: GlutaMAXGibco 35050-061Concentração final de 0,5 mM.
Ácido L-ascórbicoSigma A7506
B27Gibco 17504-04450x solução estoque, 1x concentração final.
Pratos com fundo de vidro de 35 mmMatTek   P35GC-1.5-10-C
Poli-L-OrnitinaSigma P4957
LamininSigma L2020Armazenado em -20 &graus; C em 20 e micro; L alíquotas
Desoxirribonuclease I (DNase)Sigma DN25
Ponteiras de pipeta azuis P1000Sorenson Bioscience Inc. 10130
Placa de Petri rasa de 10 mmVWR 25384-324
37 ° C Banho-maria
37 > C, incubadora
16% paraformaldeído (PFA) Ciências deMicroscopia Eletrônica 15710
Triton X-100Sigma  X100-500ML
Soro de burroEquitech SD-0100HISolução estoque 100%, concentração final a 1%.
Tesoura cirúrgica padrãoFine Science Tools14000-14
Fórceps - 2x3 dentesFine Science Tools11022-14
Fórceps - Dumont #55Fine Science Tools11295-51
Fórceps - Dumont #5Fine Science Tools11252-23
10x PBS, pH 7.4Gibco 70011-044
Solução tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) 1xGibco14190-144500 mL
21 GBD Agulha PrecisionGlide305167100 agulhas
Extrator de micropipetaInstrumento Suttermodelo P-87
Micromanipulador Instrumento Sutter Kit de sequenciamento MP-285
: Kit de RNA ultrabaixo SMARTer para sequenciamentoIllumina Clontech634936100 rnxs, incluindo Advantage2PCR Kit
oligonucleotídeo (12 µ M): Oligonucleotídeo SMARTer IIA (12 µ M)Do Kit SMARTer 
Transcriptase reversa (100 unidades)SMARTcribe transcriptaseDo kit SMARTer 
Primário 13' CDSIIa primer Do SMARTer Kit
Primer 2IS PCR primerDo SMARTer Kit
50x 2 mistura de polimerase50x Advantage 2 misturaDo SMARTer Kit
10x tampão PCR10x Advantage 2 tampãoPCR Do SMARTer Kit
RNA SpikesThermoFisher4456740
Rack de resfriamento de PCRIsoFreeze Rack de resfriamento de PCR
Kit de Preparação de Amostras de DNA(Illumina/Nextera) NexterFC-121-103024 Amostras
de PCR master mixNextera PCR master mix (NPM)Do Kit Nextera 
Coquetel de primer PCR (PPC) Coquetel de primer PCR Nextera (PPC) Do Kit Fluorômetro Nextera
O kit Qubit ThermoFisherQ33216
HS DNA BioAnalyzer SistemaAgilent5067-4626110 rxns
 Bioanalisador Agilent 2100.G2938C
Contas magnéticas: Agencourt AMPure Beckman CoulterA638805 mL
de limpeza de RNAse: Limpeza de RNAse Zap AmbionAM9786Tamanho 100 Folhas
Qubit ds HS Kit de EnsaioSondas moleculares Q32854500 ensaios
Kit de extração de gel: Kit de extração de gel QiaquickQiagen 28704
Tubo capilar de vidro(Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm o.d.)
MicroforgeNarishige (ou equivalente) 
SequenciadorIllumina HiSeq instrumento
GENSAT tirosina hidroxilase-eGFP cepa de camundongo Número de estoque MMRRC: 000292-UNCStock Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat / Mutant Mouse Regional Research Center
de 5% de umidade Agulha de reversa de polimerase de eletroforese

Referências

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Coleta de Células ÚnicasCulturas do Mesencéfalo VentralIsolamento CelularMicroscopia de FluorescênciaSíntese de cDNAAnálise de Expressão Gênica
A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.