Estudar mitocondrial estrutura e função em Drosophila ovários

Resumo

A análise da relação estrutura-função mitocondrial é necessária para uma compreensão completa dos mecanismos regulatórios da funcionalidade mitocondrial. Métodos específicos para estudar a estrutura e função mitocondrial em ovários vivos e fixos de Drosophila são descritos e demonstrados neste artigo.

Resumo

A análise da relação estrutura-função mitocondrial é necessária para uma compreensão completa dos mecanismos regulatórios da funcionalidade mitocondrial. A microscopia de fluorescência é uma ferramenta indispensável para a avaliação direta da estrutura e função mitocondrial em células vivas e para o estudo da relação estrutura-função mitocondrial, que é modulada principalmente pelas moléculas que governam os eventos de fissão e fusão entre as mitocôndrias. Este artigo descreve e demonstra métodos específicos para estudar a estrutura e função mitocondrial em tecido vivo e fixo no organismo modelo Drosophila melanogaster. O tecido de escolha aqui é o ovário de Drosophila, que pode ser isolado e tornado passível de microscopia confocal ao vivo ex vivo. Além disso, o artigo descreve como manipular geneticamente a proteína de fissão mitocondrial, Drp1, em ovários de Drosophila para estudar o envolvimento da fissão mitocondrial impulsionada por Drp1 na modulação da relação estrutura-função mitocondrial. O amplo uso de tais métodos é demonstrado em dados já publicados, bem como em dados novos. Os métodos descritos podem ser estendidos para entender o impacto direto dos nutrientes e / ou fatores de crescimento nas propriedades mitocondriais ex vivo. Dado que a desregulação mitocondrial está subjacente à etiologia de várias doenças, espera-se que os métodos inovadores descritos desenvolvidos em um organismo modelo geneticamente tratável, Drosophila, contribuam significativamente para a compreensão dos detalhes mecanicistas da relação estrutura-função mitocondrial e para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas às mitocôndrias.

Introdução

As mitocôndrias são classicamente descritos como a potência celular, uma vez que eles são os principais lugares de produção de energia em células diferenciadas. Além disso, as mitocôndrias desempenham um papel crítico no metabolismo, a geração de calor, a modificação lipídica, o cálcio e homeostase redox, a orquestração de processos de sinalização de células, etc ^1. As mitocôndrias desempenham também um papel activo na indução de morte celular ^2, bem como na regulação do ciclo celular ^3. Essa multifuncionalidade levanta as seguintes questões fundamentais: a) como mitocôndrias desempenhar todas estas funções em simultâneo e b) existem piscinas mitocondriais específicos ou subzonas que são especializados para funções distintas? Neste contexto, é importante notar que as mitocôndrias são multifuncionais dinâmica na sua forma, tamanho e estrutura dentro das células individuais e que a forma de estado estacionário de mitocôndrias pode variar entre os tipos de células. Décadas de pesquisa de vários laboratóriooratórios sugerem que a alteração da forma mitocondrial, tamanho e estrutura, chamados coletivamente de dinâmica mitocondrial, é crucial para a manutenção de várias funções mitocondriais _^4,5,6. Estes resultados levantam a possibilidade de que mitocôndrias podem cumprir a sua multi-funcionalidade em virtude do seu dinamismo estrutural.

grandes esforços estão em curso para entender a relação estrutura-função mitocondrial. A dinâmica da estrutura mitocondrial é mantida principalmente pela sua capacidade de sofrer eventos de fissão e de fusão com o outro. Fissão de grandes mitocôndrias converte-os em elementos mitocondriais menores, enquanto a fusão entre duas mitocôndrias menores funde-os em um elemento mitocondrial maior ^7. Além disso, a fusão de duas mitocôndrias transiente pode ocorrer para permitir a mistura do seu conteúdo. Os eventos de fissão e de fusão das membranas mitocondriais interior e exterior são cuidadosamente regulada pela especificaçãoific conjuntos de proteínas. A maquinaria do núcleo fissão é composto de proteína relacionada com dinamina 1 (Drp1), que é recrutados a partir do citosol para a mitocôndria pela sua interacção com certos bona proteínas mitocondriais fide (por exemplo, Fis1 ou Mff1), enquanto função Drp1 também pode ser regulado por outras proteínas na superfície mitocondrial ^4. Embora Drp1 opera na membrana externa, as suas capacidades de fissão impacto da membrana interior assim. A orquestração da cisão das membranas mitocondriais exteriores e interiores não é bem compreendido. Por outro lado, a fusão da membrana interna é regulada no núcleo pelas actividades de OPA1, enquanto mitofusins governar a fusão da membrana externa ^5. O saldo das contrariando fissão e fusão eventos de mitocôndrias ditar a forma mitocondrial steady-state em uma célula. Por exemplo, a repressão da fissão mitocondrial resultaria em fusão completa e sem oposição, enquanto que a sobre-actividade das mitocôndriasl fissão resultaria em fragmentação da mitocôndria ^3.

O estudo da relação estrutura-função mitocondrial envolve principalmente duas abordagens complementares: a) análise dos fenótipos celulares e organismais após a manipulação genética de proteínas fissão / fusão mitocondrial e b) as avaliações diretas de estrutura e função mitocondrial. É digno de nota que as análises genéticas podem nem sempre revelar a funcionalidade directa da molécula no lado (neste caso, as proteínas de fissão / fusão mitocondriais), como os fenótipos podem surgir devido a efeitos secundários. Portanto, é de extrema importância para desenvolver e usar ferramentas para estudar a estrutura e função mitocondrial diretamente. Qualquer avaliação da estrutura mitocondrial envolve várias ferramentas de microscopia. Uso de microscopia de fluorescência de células vivas tem avançado muito nos estudos de dinâmica mitocondrial, uma vez que o dinamismo mitocondrial pode ser monitorado de forma qualitativa e Quantitätvamente utilizando as ferramentas e técnicas apropriadas ⁸ de microscopia de fluorescência. Ferramentas com base em microscopia de fluorescência foram desenvolvidos para estudar a estrutura e a função mitocondrial em tecidos vivos e fixos de Drosophila melanogaster, elucidar a importância de dinamismo mitocondrial in vivo ^9. Estes e os métodos relacionados são descritos aqui, com o objectivo de estudar a estrutura e a função mitocondrial no ovário de Drosophila.

O ovário Drosophila consiste em germinativas e somáticas linhagens, que surgem a partir de suas respectivas células-tronco adultas que residem no germário ^10,11. Dezesseis células germinativas sincicial (GCs) se encapsulado por células do folículo somáticas (FCS) para formar câmaras de ovos individuais que emergem fora do germário (Figura 1). Um dos 16 GCs se comprometeu a tornar-se um oócito, e os restantes 15 GCs desenvolvem em células enfermeira que suportam o crescimento da câmara de oócito, Facilitando a maturação do ovo, antes de ser colocado. A maioria dos CFs submetidos a 9 ciclos de divisões mitóticas antes de sair do ciclo celular mitótico para diferenciar terminalmente em uma camada de células epiteliais modelado que consiste de células anterior dos folículos (AFCs), células foliculares posterior (PFC), e as células do corpo principal (CBMs) . As câmaras de ovo consecutivos são ligados por células haste, que são células que são também derivados das CFs no início do desenvolvimento diferenciadas. Forma mitocondrial regulado pelo Drp1 proteína fissão mitocondrial está ativamente envolvido no processo de diferenciação durante o desenvolvimento normal da camada FC ovário Drosophila ^9,12. Os métodos utilizados nestes estudos para identificar o envolvimento de Drp1 em Drosophila desenvolvimento da camada de células do folículo são descritos aqui.

Protocolo

1. Preparação de Drosophila (as ferramentas necessárias estão representados na Figura 2A)

1. Para qualquer uma das experiências descritas, recolher Drosophila (mantido à temperatura ambiente ou 25 ° C) dentro de 5 dias após a eclosão e colocá-los num frasco encheu-se com 5-7 mL de Drosophila alimentos (ver Materiais Tabela), com não mais do que 25 voa em cada frasco; manter uma relação feminino: masculino de 2: 1.
2. Polvilhe uma pequena quantidade de levedura granulada para estimular a produção de ovos de Drosophila. Executar a manipulação experimental dentro de 2 - 4 dias.

2. Dissecção de Drosophila ovários (as ferramentas necessárias estão representados na Figura 2A)

1. Quente inseto dissecando médio (ver Materiais Tabela) à temperatura ambiente, 25 ° C. Encha três poços de uma de oito poços prato de dissecação de vidro, com 200 uL de meio em cada poço.
2. Anestesiar Drosophila com CO _{2, colocando a agulha da pistola de ar por baixo do bujão do frasco. Coloque-os em uma almofada mosca. Usando um microscópio de dissecação, classificar 5 fêmeas e colocá-los no primeiro poço do prato de dissecação. Lidar com uma Drosophila num momento em que a realização de microscopia ao vivo.}
3. Ao olhar através da ocular do microscópio de dissecação, separar o tórax do abdômen usando dois pares de fórceps. Usando fórceps, transferir cuidadosamente os abdómens para o segundo poço do prato.
4. Utilizar um par de pinças para segurar o abdómen na extremidade posterior, e lentamente empurrar para fora os ovários (juntamente com os outros conteúdos abdominais) com o outro par de fórceps. Se essa tentativa falhar, remova cuidadosamente o exoesqueleto abdominal, inserindo as pinça na extremidade anterior para liberar os ovários.
5. Usando a pinça, segure um ovário indivíduo pela extremidade posterior opaca (ou seja, os ovos encheu-gema, em estágio final) e movê-lo com cuidado para o terceiro poço do pratopara provocando a processá-lo por microscopia vivo (passo 3) ou para a fixação de realizar imunocoloração (passo 7).
6. Cuidadosamente provocar a bainha protectora em torno dos ovários por varrer uma agulha provocação levemente a partir do posterior à extremidade anterior de cada ovário, mantendo-o pela extremidade posterior com um par de fórceps.
   NOTA: Para minimizar os danos durante a provocação, dobre a ponta da agulha e zoom em cada ovário, aumentando a ampliação do microscópio (Figura 2A). Traquina deve ser suficientemente eficaz para romper o invólucro, mas também deve ser feito com cuidado para preservar a integridade dos ovarioles.

3. Preparação para microscopia de tecido vivo

NOTA: As ferramentas necessárias são representadas na Figura 2A.

1. Antes de Drosophila dissecção, preparar câmaras revestidas polyl-lisina. Para este fim, colocar duas gotas de 20 ul de polyl-lisina (0,1 mg / mL) na coverglburro (14 mM, n ° 0) de uma placa de Petri com fundo de vidro (35 mm) a uma distância razoável entre si, a fim de evitar a fusão das gotas. Secar as placas durante 1 h a 37 ºC e marcar os bordos da película branca polyl-lisina sobre o lado inferior da placa com um marcador apagável.
   NOTA: O polyl-lisina-revestidas câmaras podem ser armazenadas a 4 ° C durante uma semana. Se estiver usando uma câmara previamente revestido, trazê-lo à temperatura ambiente antes de iniciar a dissecção Drosophila.
2. Definir os parâmetros de verificação no microscópio confocal para se certificar de que a amostra pode ser fotografada imediatamente após a conclusão da dissecção e montagem, como abaixo.
3. Coloque um dissecados e provocou ovário (passo 2 e coradas, se necessário, seguindo o passo 5) sobre uma região polyl-lisina-revestidas marcado e espalhar o ovário com a agulha para separar os os ovarioles. Colocar uma gota de 10 ul de meio de dissecação de insectos no topo do ovário, certificando-se de cobrir tele área inteira polyl-lisina-revestido. Cubra o prato de petri.
4. executar imediatamente microscopia confocal da amostra montada à temperatura ambiente.
   NOTA: Apenas um Drosophila deve ser dissecado, processado, e fotografada de cada vez. Além disso, a microscopia não deve ser realizada a 37 ° C, o que vai imitar um meio de choque de calor para o tecido de Drosophila.

4. Fluorescência perda de Fotodegradação (FLIP) Ensaio para avaliar Mitocondrial Matrix Continuidade

NOTA: a continuidade da matriz mitocondrial numa estrutura mitocondrial fundido é estabelecido após a fusão completa das membranas interna e externa mitocondriais seguintes uma progressão através dos passos intermediários. Cisão da mitocôndria podem seguir os mesmos passos, mas no sentido inverso (Figura 3A). FLIP é um método semi-quantitativo com base em microscopia de lapso de tempo que pode ser usado para avaliar a continuidade da matriz mitocondrial noestado fundido final do ex vivo mitocôndrias (as etapas 3 e 4 na Figura 3A) em vivo ovários Drosophila ^9. O ensaio FLIP é realizada como uma pequena região de interesse (ROI) da mitocôndria que expressam uma molécula fluorescente na matriz mitocondrial que está Foto-descoloração em intervalos regulares (ROI FLIP na Figura 3A). Como resultado, qualquer região mitocondrial circundante que é contínua com a ROI FLIP (ROI experimental na Figura 3A) vai perder o sinal devido à permuta de moléculas na matriz mitocondrial contínua. As experiências demonstraram FLIP aqui são realizados em Drosophila transgénico expressando mitoYFP, que contém a sequência de direccionamento mitocondrial do citocromo oxidase subunidade VIII humano marcado com YFP ao alvo para a matriz mitocondrial numa forma livremente difusíveis. Uma experiência semelhante também pode ser realizada com o transgene Mito UPAEP-MITO-GFP, conforme relatado anteriormente ^{9. Um protocolo semelhante FLIP pode ser usado com uma sonda de alvo para o espaço inter-membrana mitocondrial para ser capaz de detectar a continuidade resulta da fusão do exterior, mas não a membranas mitocondrial interna (passo 2 na Figura 3A).}

1. Abra o software de aquisição de imagem no microscópio confocal e definir os parâmetros de digitalização apropriadas na guia "Aquisição" (Tabela 1). Verifique a "série Time", "Branqueamento" e "Regiões" caixas para abrir as guias individuais. Colocar os valores dos parâmetros de aquisição adequadas em cada aba (Tabela 1).
   NOTA: O pinhole deve ser deixada em aberto, como esta experiência foi projetado para monitorar sinal geral de toda a população mitocondrial em células individuais.
2. Use a ocular para localizar rapidamente o campo de interesse no tecido vivo montado.
   NOTA: Selecione o ovarioles que estão bem espalhados no vidro-bottomed prato, uma vez que a microscopia confocal não pode ser executada em ovarioles flutuantes.
3. Clique em "ao vivo" para adquirir uma imagem ao vivo do campo selecionado de interesse. Clique em "stop" para parar a varredura ao vivo.
4. Se necessário, ajustar os parâmetros de aquisição de tal forma que o sinal fluorescente detectado é abaixo dos níveis de saturação (indicado pela ausência de pixels vermelhos quando a opção "indicador de faixa" está marcada), com o plano de fundo definida como definido ajustando os valores de deslocamento.
5. Desenhe um pequeno ROI utilizando a ferramenta de desenho Bezier na guia "Regiões" para demarcar a zona de fotodegradação na imagem adquiridos por varrimento ao vivo.
   NOTA: O tamanho da ROI deve ser cerca de 20 - 50% do sinal fluorescente mitocondrial total dentro da célula.
6. Realizar a aquisição de imagem clicando em "começar a experiência."
7. Quantificar a intensidade de fluorescência usando a propriedade ou o software de código aberto (ver MateriaisTabela). Gravar o sinal média do ROI em que o branqueamento repetitivo é direcionado (FLIP); ROIs branqueamento onde não foi realizada na mesma célula (experimental); o ROI de outra célula crus no mesmo campo de visão, para avaliar o branqueamento global durante o período experimental (branqueamento); eo ROI na área de fundo (background). Subtrair o sinal de fundo médio obtido a partir do sinal significativo na outra ROIs. Normalizar o sinal fluorescente com o sinal pré-lixívia inicial para a respectiva célula.
8. Plotar os dados normalizados usando qualquer software de plotagem padrão.

5. A coloração vivo com Fluorescente mitocondrial Corantes

NOTA: a estrutura mitocondrial em estado estável e potencial pode ser avaliada utilizando corantes que incorporam especificamente para dentro da mitocôndria em células vivas e tecidos. Ovários ao vivo de Drosophila pode ser manchado ex vivo com mitocondrial fluorescentecorantes para a visualização da mitocôndria, para avaliar as espécies de oxigénio reactivas mitocondriais (MITO-ROS) de produção, e para avaliar o potencial mitocondrial por unidade de massa. Isto pode ser conseguido por co-coloração com o corante éster mitocondrial potenciométrica tetrametilrodamina etilo (TMRE) e uma mancha mitocondrial vivo compatível representando a massa mitocondrial (ver Materiais Tabela para os corantes específicos).

1. Diluir o estoque das manchas em inseto quente dissecando meio para as concentrações de trabalho finais: mancha mitocondrial, 250 nM; TMRE, 50 nM; e MITO-ROS mancha, 5 uM.
2. Após a dissecção e provocando os ovários seguinte passo 2, colocar os ovários em 200 uL de qualquer de solução de coloração específica em um poço de um prato de dissecação. Incubar durante 10 min los com o prato coberto por uma caixa adequada embrulhado com folha de alumínio para proteger da luz. Lave os ovários manchadas, movendo-os cuidadosamente com uma pinça em 3 poços consecutivos contendg meio sem mancha.
3. Para co-coloração com TMRE ea mancha mitocondrial global compatível, siga o protocolo acima para manchar primeiro com TMRE e logo em seguida com a mancha mitocondrial geral (sem quaisquer passos de lavagem entre).
4. Monte os ovários em um prato com fundo de vidro polyl-lisina revestido seguinte passo 3 e se preparar para a microscopia confocal com os parâmetros de digitalização apropriadas (Tabela 1), seguindo os passos 4,2-4,4.
   NOTA: O sinal a partir dos corantes incorporados não durou quando tentando montar as amostras coradas em meio de montagem.
5. Marque a caixa-seccionamento Z para abrir a guia. Gire o anel de foco para a parte inferior da amostra enquanto ele está sendo live-digitalizada e clique em "definir em primeiro lugar" para definir o Z-seção da extremidade inferior. Faça o mesmo ao mover a roda de foco para outra direção para definir a seção superior.
6. Realizar a aquisição de imagem clicando em "começar a experiência."
7. Quantificar a intensidade de fluorescência corrigido-fundo das ROIs para o sinal de fundo e as células individuais (como no passo 4.7) e plotar os dados usando qualquer software de plotagem.

6. Geração de Drp1 Null Mosaicos

NOTA: A estratégia clonal usada aqui introduz proteína fluorescente (GFP) -negative clones nulos Drp1 verdes no fundo de um, fenotipicamente fundo de tipo selvagem GFP-positiva que é heterozigoto genotipicamente para o Drp1 mutação nula ^9. -Choque induzido calor alvo reconhecimento flipase-flipase (FLP-FRT) site-specific mediada mitótico recombinação cria clones homozigotos do alelo drpKG03815 funcionalmente nula. O genótipo de Drosophila carregando o mutante Drp1 é drpKG03815 FRT40A / CYO, enquanto o genótipo carregando o FLP induzida por choque térmico (hsFLP) e UbiGFP marcador clonal é hsflp; NLS-GFP ubiquitina (UbiGFP) FRT 40A / CYO. O genótipo da SEprole selecionada do cruzamento entre os genótipos acima é hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

1. Sincronizar a Drosophila para coleta virgem, movendo-os em novos frascos de comida fresca a cada 2 a 3 dias. Monitorar os frascos pupariating diária, a fim de recolher fêmeas virgens emergentes.
2. Recolha, encaracolado-asa fêmeas virgens Vermelho-eyed do genótipo mutante Drp1 a cada dia, uma de manhã e outra à noite, e colocá-los em um frasco separado. Em paralelo, colete masculino Drosophila com os olhos vermelhos escuros e asas retas que transportam hsflp e UbiGFP no prazo de 5 dias de eclosão.
3. Configurar uma cruz adicionando os machos às fêmeas virgens com uma relação feminino: masculino de 2: 1.
4. Polvilhe uma pequena quantidade de levedura granulada para estimular a produção de ovos.
   NOTA: mover cuidadosamente a Drosophila para um frasco fresco de meios de comunicação a cada 2 a 3 dias para aumentar a quantidade de descendentes e para reduzir a aglomeração frasco.
5. Aesthetize, classificar e recolher straight-alados, descendência feminina de olhos vermelhos no prazo de 5 dias de eclosão.
6. Para o choque térmico, colocar o Drosophila recolhido em frascos vazios com uma pequena quantidade de levedura granulada e um pequeno, macio limpar (para absorver a humidade durante o choque térmico). Colocar o frasco com a Drosophila num banho de água a 38 ºC durante 1 h, para gerar clones de células, principalmente dos folículos, e a 37 ºC durante 1 h, duas vezes por dia (que permite, pelo menos, 5 h entre os choques 2 de calor) durante 2 dias consecutivos , a fim de gerar clones de células do folículo linha germinal e.
   NOTA: Certifique-se de que o frasco é completamente submerso na água até o nível do plugue.
7. O choque térmico pode tornar o imóvel Drosophila. Permitir que a Drosophila calor chocado a recuperar durante 1 h à temperatura ambiente quando se tornam novamente móvel.
8. Adicione os homens de volta para as mulheres na mesma proporção que na cruz, e movê-los para frascos frescos com medium aspergido com uma pequena quantidade de levedura granulada. Manter a Drosophila durante pelo menos 5 dias.
9. Dissecar os ovários como necessário para uma experiência ao vivo ou fixo.
   NOTA: Os ovários isolados do parental de Drosophila que expressam UbiGFP devem ser utilizados como controlos negativos para confirmar a indução eficiente de clones GFP-negativo pelo choque térmico.

7. Co-imunocoloração para ciclina E e mitocôndrias

NOTA: Para detectar Drosophila ciclina E (dCyclinE), utilizou-se um anticorpo obtido comercialmente levantada especificamente contra dCyclinE ⁹ (ver Materiais Tabela). Como um marcador mitocondrial, utilizou-se um anticorpo contra o ATP-B (uma subunidade do complexo de ATP sintase mitocondrial) ^9.

1. Quente 4% de paraformaldeído (PFA) a temperatura ambiente, 25 ° C. Cuidado! O paraformaldeído é tóxico.
   NOTA: Após a aberturaa ampola, PFA deve ser armazenada a 4 ° C e usadas dentro de 7 dias. Isto é porque o armazenamento de PFA podem permitir a oxidação de metanol, o que iria alterar drasticamente membranas mitocondriais durante a fixação, mesmo que presente em quantidades vestigiais.
2. Imediatamente após a dissecação, corrigir os ovários dissecados, colocando-os em 200 mL de PFA fresco em um poço de um prato de dissecação de vidro (sem provocação). Manter o prato numa hote durante 15 min. Lavar os ovários fixa, movendo-as cuidadosamente com a pinça em 3 poços consecutivos, cada um contendo 200 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS).
   NOTA: O experimento pode ser interrompido aqui e as amostras podem ser deixadas a 4 ºC durante 1 dia.
3. Provocar os ovários mais completamente em PBS (semelhante ao passo 2.6) para remover cuidadosamente a bainha fibrosa protectora que pode dificultar o acesso antigénio pelo anticorpo.
4. Permeabilizar as ovários provocado por colocando-os num tubo de microcentrífuga com 500 ul de 0 recém-preparadas.5% de PBS-Triton-X100 (PBS-Tx) e incubar durante 30 min enquanto a sacudir a 25 rpm.
   NOTA: Durante o balanço, colocar os tubos em paralelo ao movimento de balanço; colocando-os perpendicularmente pode permitir que o tecido para furar a tampa dos tubos, resultando em perda de tecido.
5. Para remover o PBS-TX, colocar os tubos de microcentrífuga de uma cremalheira para permitir que o tecido se estabelecer na parte inferior dos tubos. Inspecioná-los visualmente e toque os tubos, se necessário, para trazer quaisquer tecidos flutuantes até o fundo. Aspirar cuidadosamente a solução a partir do topo, certificando-se de que o tecido na parte inferior dos tubos permanece sem perturbação.
6. Bloquear os ovários por adição de 200 ul de 2% de albumina de soro bovino (BSA) em 0,5% PBS-TX, e incubar em que o balancim à temperatura ambiente durante 1 h. Remova o agente de bloqueio seguindo o passo 7.5.
7. Adicionar anticorpos primários em 200 ul de agente de bloqueio fresco: anticorpo anti-coelho dCyclinE (1: 100) e anticorpo anti-rato de ATP-B(1: 100). Incubar os tecidos sobre o roqueiro durante 2 h à temperatura ambiente.
8. Lavar os ovários com PBS-TX 3 vezes durante 15 minutos cada, a seguir etapa 7.5.
9. Adicionar 200 uL de anticorpos secundários apropriados em PBS fresco-TX: anti-murganho CY3 (1: 1000) e anti-coelho-CY5 (1: 500). Incubar no agitador por 1 h à temperatura ambiente.
10. Lavar os ovários com PBS-TX 3 vezes durante 15 minutos cada, a seguir etapa 7.5.
11. Para manchar o DNA, adicionar Hoechst (diluição 1: 1.000) para a final de lavagem PBS-TX.
12. Finalmente, deixar o tecido em 500 ul de 1x PBS.
13. Usando uma micropipeta 1 ml, remover os ovários imunocoradas do tubo de microcentrífuga fresco em um poço de um prato de dissecação de vidro contendo 200 uL de PBS.
14. Adicionar uma gota de meio de montagem à base de glicerol a uma lâmina de vidro e adicionar o imunologicamente ovários um por um para o meio de montagem.
    NOTA: Certifique-se de que os ovários são, de facto transferidos para o meio de montagem. Caso não o faça so levará a perda de tecido.
15. Enquanto olha através do microscópio de dissecação, gentilmente arrancar as ovarioles transparentes (fases mais jovens) das câmaras de ovos maduros opacos, utilizando a agulha provocações, mantendo a parte opaca do ovário com a pinça. Retirar as câmaras óvulo maduro a partir do meio de montagem.
16. Coloque uma lamela (22 mm, N ° 1) na corrediça e pressione ligeiramente para assegurar que o meio de montagem é espalhado uniformemente por baixo.
    NOTA: Pressionar na lamela também garante o alinhamento adequado do tecido ao longo da lamela. Caso não o faça de forma otimizada pode permitir que as fases menores para flutuar no meio de montagem, evitando microscopia óptima desses tecidos.
17. Secar as amostras durante 15 min e selar as bordas da lamela cuidado com unha polonês.
18. Realizar microscopia confocal como por necessidade experimental (Tabela 1).

Resultados

Os métodos descritos podem ser utilizados para estudar a estrutura e a função mitocondrial em ovários de Drosophila vivas e fixadas (Figura 2B). São fornecidos alguns exemplos de resultados previstos obtidos com os métodos descritos.

A dissecção do ovário Drosophila: Quando dissecados ainda mais, o abdómen cortadas (Figura 3B) a partir do conjunto de Drosophila

Discussão

Passos críticos dentro do Protocolo

Fotodegradação: Prevenção de fotodegradação indevida de amostras fluorescentes é absolutamente necessário para a realização de microscopia confocal eficiente. Portanto, o tempo usado para localizar amostras através da ocular ou para definir os parâmetros de aquisição de imagem através do modo de varredura ao vivo deve ser minimizado para minimizar a fotodegradação.

O dano tecidual: Uma vez que as mitocôn...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Grace's Media (Meio de Dissecção de Insetos)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldeído AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (coloração mitocondrial geral)	Life Technologies	m7514	Reconstituir e Aliquot
Perclorato de éster etílico de tetrametilrodamina	Sigma Aldrich	87917-25MG	Reconstituir e alíquota
MitoSox (coloração Mito-Ros)	Life Technologies	m36008	Reconstituir e alíquota
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
frascos para moscas	Fisher Scientific	AS-515
Fly Conicals	Fisher Scientific	AS-355
Fly Vial Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E Anticorpo (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
Anticorpo ATPB [3D5] - Marcador mitocondrial	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select Lâminas	de MicroscópioFisher Scientific	22-026-252
Tampa de Vidro para Microscópio	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp  Prato Mircrowell com Fundo de Vidro	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Levedura Seca Ativa	Confocal ICN10140001		Fisher Scientific
	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 Fórceps	Fine Science Technologies	11251-20
Suporte de Pino Niquelado Moria Fine	Science	26016-12
Pins Minutien	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Agulha de zarabatana	Flystuff	54-119
Microscópio de dissecação	Carl Zeiss	Stemi 2000
Software de análise	Carl Zeiss	Zen
Software	de análise Microscópio de zoom macro de código aberto	Image J
Research Olympus		MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging