Introduction
Læring er baseret på dannelsen af hukommelse spor og deres vedligeholdelse. Det er almindeligt accepteret, at en underliggende mekanisme kan repræsentere en aktivitet-afhængig dannelse af nye og / eller omlægning af eksisterende synaptiske kontakter mellem neuroner. På det molekylære niveau har forskellige protein modifikationer, subcellulære relocalizations og ændringer i omsætningen af synaptiske proteiner blevet beskrevet 1-4 (Lamprecht, 2004 # 8). Men de fleste undersøgelser hidtil fokuseret på udvalgte proteiner i stedet for på det globale, men komplekse synaptisk proteom sammensætning. Den nuværende fremgangsmåde giver en fordomsfri screening for synaptiske proteom ændringer i mus områder af hjernen efter en lærende eksperiment. Den er velegnet til at gøre tid-point afhængige molekylære snapshots af læring-induceret reorganisering af den synaptiske arkitektur. Den beskrevne arbejdsgang kræver en særlig teamwork af forskellige specialister i dyreadfærd, protein biokemi, massespektrometri og Biolnformatics.
Den valgte læring paradigme, dvs. frekvens-moduleret tone forskelsbehandling (FMTD), er et godt karakteriseret auditive opgave diskrimination i gnavere 5. Læring og langtidshukommelse dannelse i denne shuttle box Go / No-Go-opgave involverer mekanismer afhængigt øget kortikal dopamin signalering og proteinsyntese. Derfor seneste proteomiske undersøgelser af ørkenrotter og mus afslørede dopamin- og læring-induceret plast omrokeringer af synaptiske komponenter i cortical, men også i mere basale områder af hjernen, der angiveligt interagerer under FMTD indlæring og hukommelse 6-8. Dette illustrerer, at hukommelsesdannelse involverer et komplekst samspil af forskellige hjerneregioner, og således kan være differentielt reguleret inden for disse områder på proteom niveau. Derfor er dissektion af udvalgte kortikale og subkortikale mus hjerneområder indgår i arbejdsgangen.
Endvidere pålidelig characterizatipå selv af svage ændringer i synaptisk proteinsammensætning kræver en berigelse af præ- og postsynaptiske rum snarere end analysen af homogenater eller rå membranfraktioner 9. Derfor er fremstillingen af synaptosomer udnytte etablerede protokoller inden proteomanalyse er beskrevet for at øge påvisningen niveau og det dynamiske område for synapse-specifikke proteiner 10,11.
En væsentlig forudsætning for at bruge mærket-fri høj opløsning massespektrometri til kvantitative formål er en høj grad af lighed af protein prøver. Som forventes at forekomme efter at lære, vil en etiket-fri tilgang være hensigtsmæssigt at sammenligne tilsvarende protein prøver fra uddannet og naive mus snarere mindre ændringer i synaptisk protein sammensætning. Alternativt tilstand-specifikke strategier proteiner / peptider under anvendelse af stabile isotoper (f.eks TMT, iTRAQ, ICPL og SILAC) samt MS2-baserede label fri qua labelntification (SKÅRSKÆRME) er anvendelige, men de er dyrere end den valgte label-free tilgang eller behov for særlig massespektrometrisk hardware.
Da proteomiske screeninger ofte give komplekse datasæt, anbefales bioinformatik behandling for passende data fortolkning. Yderligere metaanalyser kan understøtte en bedre forståelse af potentielle molekylære mekanismer bag paradigme-relaterede ændringer og identifikation af involverede vigtige cellulære processer og signalveje. Passende metoder er også beskrevet nedenfor.
Protocol
Alle procedurer, herunder forsøgsdyr blev udført i overensstemmelse med reglerne i den tyske føderale lov, de respektive EU-regler og NIH retningslinjer, og er godkendt af den etiske komité for Landesverwaltungsamt Sachsen / Anhalt (42502-2-1102 IFN).
1. Auditiv læring
- Auditiv læring diskrimination i shuttle boks (FMTD paradigme) Bemærk: Brug altid handsker ved håndtering af mus.
- Hus C57BL6 / J mus i grupper på tre eller fire med gratis adgang til fødevarer pellets og postevand i klare polycarbonat bure. Oprethold en 12 h lys: mørke-cyklus i dyret anlægget. Hvis dyrene er modtaget fra en anden lab eller fra et selskab tillade mindst en uges akklimatisering og afvikling i.
- Udfør en shuttle box træningssession per dag.
- Tag musen fra sit hjem bur i dyret anlægget og placere den i et svagt belyst shuttle boks i et lydtæt kammer.
- Brug en fuldt computerstyret læring tidsplan for auditiv læring diskrimination. Begynd med en tilvænningsperiode på 3 min stilhed, og derefter starte træningen.
- Brug sekvenser af stigende tone (4 - 8 kHz, CS +) som Go-stimulus under Go-forsøg: Dyret skal krydse hurdle inden 6 sekunder af tone præsentation (korrekt svar, hit). Straffe en miss med en mild mund-chok på 50 - 300 uA, leveret via nettet gulvet i rumfærgen kassen.
- Brug sekvenser af den faldende tone (8-4 kHz, CS) som No-Go-stimulus under no-go-forsøg: Dyret skal forblive i den aktuelle rum i shuttle boksen under 6 sekunder af tone præsentation. Straffe en falsk alarm fra en mild mund-chok på 50 - 300 uA, leveret via nettet gulvet i rumfærgen kassen.
- Brug interforsøgsinterval intervaller på 20 5 sek.
- Udfør 30 Go-forsøg og 30 no-go-forsøg pr session i en pseudo-randomiseret rækkefølge, så man session består af 60 forsøg, og varer omkring 25 min.
- Sæt uddannet dyr tilbage i sit hjem bur i dyret facilitet.
- Brain dissektion
- Aflive dyret på det ønskede tidspunkt efter et ønsket antal træningspas ved hjælp af cervikal dislokation (f.eks 24 timer efter afslutningen af den første session). Halshugge dyret.
- Hurtigt dissekere hjernen via følgende trin: Skær først huden og derefter kraniet med lige saks langs Sutura sagittalis. Helt at fjerne de dele af knoglen, som dækker hjernevævet anvendelse af stærke pincet. Tag hjernen med en spattle.
- For dissektion, placere hjerne på en petriskål fyldt med is. Dissekere den auditive cortex, den frontale cortex, striatum og hippocampus under et stereomikroskop ved anvendelse af en skalpel og en nål.
- Lokalisere auditive cortex hjælp visuelle landmærker på hjernen sverflade såsom blodkar og formen af overfladen (Bregma -2,06 til -3,4, størrelse rostrocaudal 2 mm, dorsoventral 1,3 mm) og bilateralt dissekere som en rektangulær vævsblok med tykkelsen af cortex.
- Skær den frontale cortex som en hjerne skive mellem Bregma 3,56 og 1,54 ved hjælp af chiasma oplicum som en milepæl og eksklusive væv fra bulbus olfactorius.
- Dissekere striatum som en hjerne skive mellem Bregma 1,54 og 0,5 og fjern forsigtigt kortikale væv.
- Dissekere hippocampus ved fastsættelse hjernen med nålen gennem lillehjernen og udrulning cortex starter ved occipital lap.
- Shock-frost dissekeret hjerne prøver i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
2. Udarbejdelse af synaptosomer eller alternativt en Postsynaptisk-density (PSD) beriget Fraktion
BEMÆRK: Under alle procedurer, holde prøver og buffere 0 - 4 ° C.Buffere indeholder frisk fortyndede proteasehæmmere cocktails for at forhindre proteolytisk nedbrydning af proteiner. Hvis proteinphosphorylering også studeres, phosphataseinhibitor cocktails skal tilføjes. Alle g-værdier angives, er anført som g (gennemsnit) i hele protokollen.
- Fremstilling af en rå membranfraktion (figur 3A)
- Overførsel dissekeret hjernevæv i en homogenisering beholder indeholdende 1 ml iskold puffer A (5 mM HEPES, 320 mM saccharose, pH 7,4) og homogeniseres vævet ved 900 rpm med 12 slag.
- Centrifuger prøverne ved 1000 xg i 10 min. Hold supernatanterne.
- Re-homogenisere pellets på samme vilkår i samme volumen af homogenisering buffer som før og centrifuger prøver igen ved 1000 xg i 10 min. Kombiner tilsvarende supernatanter. Kassér pellets P1, som primært indeholder kerner og cellerester.
- Spin de kombinerede supernatanter i 20 min ved 12.000 x g. Kassér supernavere eller brug for yderligere fraktionering 11.
- Resuspender pellets i samme volumen af homogenisering buffer som før du bruger homogenisatoren med 6 slag på 900 omdrejninger i minuttet og centrifugering ved 12.000 xg i 20 min. Kassér supernatanter. Pelleterne p2 repræsenterer de rå membranfraktioner.
- Oprensning af synaptosomer fra rå hjerne membranfraktioner (figur 3A)
BEMÆRK: Rå brain membranfraktioner kan adskilles i myelin, lette membraner, synaptosomer og mitochondria anvendelse af sucrose densitet trinvis gradient ultracentrifugering. Til dette 5 mM Tris / HCl pH 8,1 puffere indeholdende saccharose ved enten 0,32 M, 1,0 M eller 1,2 M koncentration er påkrævet.- Under udførelsen af centrifugering for at producere de P2-fraktioner, forberede saccharose trinvise gradienter i ultracentrifugerør. Start med 2,5 ml 1,0 M sucrose buffer og underlag med 1,5 ml 1,2 M saccharose puffer under anvendelse af en glas Pasteur-pipette.
- Re-homogeniseres P2-fraktioneri 0,5 ml 0,32 M saccharose buffer manuelt med 6 slag og belastning på toppen af gradienten.
- Spin på 85.000 xg i 2 timer i en ultracentrifuge under anvendelse af en svingende spand-rotor.
- Kassér top 0,32 M saccharose lag herunder materiale ved grænsefladen til saccharose buffer 1,0 M (myelin, lette membraner). Indsamle synaptosomer ved 1,0 / 1,2 M sucrose buffer interface. Pelleten ved bunden af røret indeholder mitokondrier.
- Tilføj 0,32 M saccharose buffer til synaptosomale fraktion ved forholdet 1: 1, blandes omhyggeligt og centrifugering ved 150.000 x g i 1 time. Synaptosomer er i pelleten og kan nu resuspenderes i en buffer, der kræves til yderligere forarbejdning.
- Fremstilling af en PSD-beriget fraktion (figur 3B)
- Homogenisere hver specifik hjerneområde fra et enkelt dyr i 100 pi ekstraktionsbuffer (5 mM Tris / HCI pH 8,1, 0,5% Triton X-100) i et 200 pi ultracentrifugerør med en PTFE (polytetrafluorethylen) pistilved 2.000 rpm med 12 slag.
- Tilsæt 100 pi ekstraktionsbuffer, blandes og inkuberes i 1 time ved 4 ° C. Spin ned ved 100.000 x g i 1 time og indsamle supernatanten S1 forsigtigt med en 200 pi pipette.
- Re-homogeniseres pellet P1 i det samme rør med 100 pi ekstraktionspuffer igen med en PTFE støder ved 2.000 rpm med 12 slag.
- Tilsæt 100 pi ekstraktionspuffer og bland godt med en pipette og centrifugering ved 100.000 x g i 1 time.
- Kombiner supernatanten S2 med S1 til den opløselige proteinfraktion. Denne fraktion indeholder cytosoliske proteiner, 0,5% Triton X-100 opløselige membranproteiner og ekstracellulære matrixmolekyler.
- Resuspender den resterende pellet i 50 pi 5 mM Tris / HCl pH 8,1. Denne fraktion indeholder PSDs, detergent-resistente membraner, uopløselige cytoskeletelementer mitokondrier og cellerester herunder kerner. Den er beriget med PSDs som udgør kernen i postsynaptiske strukturer, men også vigtige dele af præsynaptiskecytomatrix på den aktive zone. Faktoren for berigelse af PSDs er omkring 4 og berigelse af PSD komponenter er påvist tidligere. 12
3. Prøve Forberedelse til massespektrometri
- Lysis og prøve normalisering
BEMÆRK: Sample normalisering vedrørende koncentrationen protein er et meget afgørende skridt for endelig at opnå pålidelige kvantitative data, selv for svage synaptiske protein udtryk ændringer.- Opløs synaptosomer eller PSD-berigede præparater af hver hjerne område af et dyr i 20 - 50 gl (afhængig samlede materiale: for auditiv cortex til punkt 5 - 15 mg væv anvendelse 20 pi) af 8 M urinstof og inkuber på is i 1 time i et ultralydsbad.
- For i-gel fordøje, opløse synaptosomer direkte i SDS-prøvebuffer. beregne omhyggeligt lastet mængde for at undgå overbelastning af gelen. Tænk at i dette tilfælde, den høje rigelige stillads Proteins vil blive tabt under gelelektroforese og in-gel digest.
- Fortynd med 1% af et aftageligt detergent for at sikre en slutkoncentration på 2 M urea. Undgå enhver temperatur højere end 30 ° C for at forhindre protein carbamylering.
- Udfør SDS-PAGE med en portion (fx 10 ul) af prøven ifølge standardprocedurer 13,14.
- Farv gelen med Coomassie Blue ifølge producentens protokol. Proceduren kombinerer fastsættelse og farvning trin med methanol og eddikesyre.
- Bestem optisk densitet af hver prøve for hele lane med en kalibreret gel scanner i transmissionstilstand og beregne den relative proteinmængde.
- Normalisere prøver i henhold til disse beregninger.
- Split hver prøve i to forskellige dele. Brug en tredjedel til i-gel fordøje og to tredjedele til in-løsningen fordøje.
- Opløs synaptosomer eller PSD-berigede præparater af hver hjerne område af et dyr i 20 - 50 gl (afhængig samlede materiale: for auditiv cortex til punkt 5 - 15 mg væv anvendelse 20 pi) af 8 M urinstof og inkuber på is i 1 time i et ultralydsbad.
- In-gel fordøje
- Udfør en anden SDS-PAGE under anvendelse af de koncentrationsjusterede prøver. Farv og kvantificere gelerne for anden gang for at undersøge normalisering kvalitet.
- Skåret ud hver bane af en prøve i gelen i forskellige områder (8 / lane), men udelukker molekylvægtområdet over 170 kDa. Overfør gelstykkerne i separate rør.
- Skær de områder i mindre stykker (ca.. 1 x 1 mm) med en skarp skalpel til at lette i-gel fordøjelse effekt.
- Digest 15
- Vask gelstykkerne flere gange (afhængigt af farvningsintensitet) i 10 minutter med 50 - 150 pi af en buffer bestående af 50% acetonitril (ACN) og 50 mM ammoniumhydrogencarbonat (NH4 HCO 3).
- Fjern supernatanter. Dæk gelstykkerne med ACN og inkuberes ved 20 ° C, indtil gelstykker bliver hvidt og skrumpe.
- Fjern ACN og rehydrere gelstykkerne for 5min med 50 pi 0,1 M NH4 HCO 3. Tilsæt samme mængde ACN og inkuberes i yderligere 15 minutter ved 37 ° C.
- Fjern og kassér væske fuldstændigt. Tør gel stykker i en vakuum centrifuge.
- Rehydrér gelstykker i 50 pi NH4 HCO 3 indeholdende 10 mM dithiothreitol (DTT) og opvarmes prøver i 45 minutter ved 56 ° C for at reducere cysteinrester.
- Fjern supernatanter og tilsæt 50 pi NH4 HCO 3 indeholder 55 mM iodacetamid (IAA) i 30 minutter i mørke at carbamidomethylate reducerede cysteiner.
- Fjern og kassér al væske over gel stykker og vaske dem to gange med 50 pi NH 4 HCO 3 og ACN (1: 1) i 10 min for at fjerne enhver resterende IAA. Tørre prøver i et vakuum centrifuge.
- For begrænset fordøjelse af proteiner tilsættes 25 mM NH4 HCO 3 indeholdende 12,5 ng / pl trypsin. Den nødvendige mængde afhænger af størrelsen og mængden af gelen pieces. Der inkuberes i et par minutter, og kontroller, om bufferen er absorberet. Tilføj flere buffer om nødvendigt gel stykker bør være helt dækket. Der inkuberes ved 37 ° C natten over (min. 12 timer).
- peptid udvinding
- Overlay gel stykker med 10 - 20 pi 25 mM NH4 HCO 3 og tilsæt samme mængde ACN. Der inkuberes i 10 minutter på is ved hjælp af ultralyd bad. Bagefter fjerne og opsamle supernatanter, der indeholder de fleste af de genererede peptider.
- Tilsæt 100 pi ekstraktionspuffer indeholdende 30% ACN / 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) til gelstykkerne. Gentag inkubation i ultralydsbad og omhyggeligt indsamle disse supernatant.
- Gentag de sidste ekstraktionstrin ved at øge ACN-koncentration til 50%. Efter 10 min af ultralydsbad spin ned og indsamle supernatanter.
- Kombiner alle tre tilsvarende supernatanter af ekstraktionstrin og tør dem i et vakuum centrifuge. Noter detsom følge af gelen separation de 8 områder per bane / prøve kombineres til en prøve igen i dette trin.
- Fordøje
- Brug den beregnede mængde (fx 100 pi af en 150 pi lysat, afhænger af mængden af materiale og den volumen, der kræves til resuspension af en prøve fra et bestemt hjerneområde) af normaliserede prøver at opnå tilstrækkeligt udgangsmateriale i mindst tre tekniske replikater til udføre label-fri massespektrometri.
- Tilsæt 2 mM DTT i 25 mM NH4 HCO 3 og forsigtigt vortex prøven. Reducer prøverne i 45 min ved 20 ° C.
- Tilsæt 10 mM IAA at carbamidomethylate cysteinresterne. Blandes og inkuberes i 30 minutter i mørke ved 20 ° C.
- Endelig tilsættes 1 ml af en trypsin stamopløsning (1 pg / pl trypsin i 25 mM eddikesyre) og inkuberes ved 20 ° C i 12 timer.
- Fastfaseekstraktion (SPE) -Purification
- At fjerne syren spaltelige detergent, justere prøver til en endelig koncentration på 1% TFA og inkuberes i 1 time ved 20 ° C.
- Centrifuger prøverne ved 16.000 xg i 10 minutter og omhyggeligt indsamle supernatanter.
- Placer SPE kolonne i et rack og ligevægt matricen med 2 ml methanol. Vask to gange med 2 ml 0,1% TFA i vand (puffer B).
- Tilsæt 2 ml buffer B og indlæse prøven. Vask endnu tre gange.
- Eluer peptiderne ved tilsætning af 200 pi 70% ACN / 0,1% TFA. Gentag dette trin.
- Pool både Eluaterne og tør dem ned i et vakuum centrifuge.
- Opløs peptider produceret ved in-gel eller i opløsning fordøje i 150 pi 80% ACN / 2,5% TFA (puffer C) og tempereres ~ 2 mg af de TiO 2 perler i 50pi puffer C.
- Tilføj perler til prøven og inkuber i en roterende indretning i 1 time ved 20 ° C. Bagefter spin-perler ned (16.000 xg, 1 min) og indsamle supernatanter.
- Vask perlerne tre gange med 100 pi buffer C ved forsigtigt at blande og centrifugering ned efter 5 min. Saml supernatanter. Gentag dette trin tre gange med 100 pi af 80% ACN / 0,1% TFA efterfulgt af tre vaske med 100 pi 0,1% TFA (uden ACN), hhv.
- Kombiner alle ti supernatanter, tør dem i en vakuum centrifuge og håndtere dem som phosphopeptidet-udtømte fraktion til yderligere oprensning ifølge trin 3.5.
- Elueres bundne phospho-peptider med 20 pi 400 mM NH4OH / 30% ACN fra perlerne. Gentag dette trin tre gange, og indsamle alle supernatanter efter spinning ned perlerne.
- Kombiner de eluater af in-gel fordøje og i-opløsning fordøjelse af en prøve og håndtere dem som phospho-peptide fraktion. Tør dem i et vakuum centrifuge til et endeligt volumen på 4 - 8 pi.
- Opløs de tørrede peptider i 20 pi 0,1% TFA.
- Ækvilibrere den faste C 18 -matrix ved at trække 20 pi ACN i spidsen. Vask matrixen ved at trække 0,1% TFA i vand ind i spidsen. Gentag processen tre gange.
- indlæse langsomt syrnet prøve i spidsen (gentage dette trin tre gange).
- Vask de C 18 -matrix tre gange med 20 pi 0,1% TFA i vand og kassér vaskeopløsningen.
- Eluer peptider fra pipettespidsen ved gentagne gange (3 gange) tegning 20 pi 70% ACN / 0,1% TFA og indsamle disse elueringsopløsning i et separat rør.
- Kombiner eluaterne af en prøve og tør dem i en vakuum centrifuge.
4. ProteomAnalyse
<p> BEMÆRK: Proteomanalyse udføres på en hybrid dual-tryk lineær ion trap / orbitrap massespektrometer udstyret med en ultra HPLC. HPLC består af en afkølet autosampler med en 20 pi injektion loop, en binær loading pumpe (pi flow range), en binær nano flow separation pumpe, en kolonne varmelegeme med to micro skifter ventiler og en afgasser. Prøver først underkastes en klemning søjle (fx 100 um x 2 cm) ved en strømningshastighed på 7 pl / min efterfulgt af separation på en søjle (fx 75 um x 25 cm) ved 250 nl / min. Udløbet separationskolonnen er direkte koblet til en coatet Pico emitterspidsen beliggenhed i et nano-spray interfacet på massespektrometer ionisering kilde.- Nano-væskekromatografi og tandem-massespektrometri
- Opløs peptid prøver i 12 pi 2% ACN / 0,1% TFA i mindst 30 min. Spin ned i 15 sek og overføre 11 pi supernatant til autosampler hætteglas (konisk, reduceret diameter).
- Oprette en automatiseret ordning for prøve ansøgning, kromatografisk separation og tandem massespektrometri på at kontrollere software (f.eks Xcalibur) som følger.
- Brug følgende for temperatur: Autosampler: 5 ° C; Kolonneovnen: 45 ° C.
- Brug følgende til injektion: Volumen: 10 pi; Strømningshastighed: 7 pl / min (2% ACN, 0,1% TFA); Tid: 8 min; Ventil indstilling: trap kolonne - affald; masse erhvervelse spec: off.
- Brug følgende til Adskillelse: Flow rate: 250 nl / min Ventil indstilling: trap søjle-separation søjle; masse spec erhvervelse: på.
0 min - 100 min: 2% ACN, 0,1% myresyre - 40% ACN, 0,1% myresyre
100 min - 105 min: 40% ACN, 0,1% myresyre - 95% ACN, 0,1% myresyre
105 min - 109 min: 95% ACN, 0,1% myresyre
109 min - 120 min: 2% ACN, 0,1% myresyre - Brug følgende for massespektrometri indstillinger: Full MS: FTMS; resolution 60.000; m / z området 400 - 2.000; FRK/MS: Lineær iontrap; mindstebeløb signal 500; isolation bredde 2 Da; dynamisk udelukkelse tidsindstilling 30 sek; enkeltvis ladede ioner er udelukket fra valg; normaliseret kollisionsenergi er sat til 35%, og aktiveringstiden til 10 msek.
BEMÆRK: En fuld MS scanning efterfølges af op til 15 LTQ MS / MS kører ved hjælp kollision-induceret-dissociation (CID) af de mest rigeligt fundne peptidioner.
- Kør tre tekniske replikater for alle prøver.
- Protein identifikation og label gratis kvantificering
- Proces massespektrometriske rådata retning protein identifikation og etiket-fri kvantificering udnytte en kommerciel software suite (f.eks PEAKS Studio). I modsætning til de fleste andre proteom softwarepakker anvender denne særlige software en de novo -sequencing algoritme før protein database alignments. Imidlertid kan dette trin nemt erstattes af andre populære softwarepakker.
- Brug essrentielle indstillinger, der er anført i tabel 2.
- Phospho-proteomics
BEMÆRK: Effektiv og pålidelig phosphopeptid erhvervelse kræver et par væsentlige ændringer af proteomisk workflow setup.- Efter phosphopeptid berigelse, aldrig tørre prøver helt. Hold altid prøver opløst.
BEMÆRK: phospho-esterbindingen af fosforylerede threoniner eller serinerne er meget skrøbelig. Under kollision-induceret fragmentering i ionfælde resulterer dette i en neutral tab af phosphat. Dette forhindrer enhver yderligere opsplitning af peptidet, som igen er nødvendig for identifikation. Tilladt bredbånds-aktivering i massespektrometri opsætning tillader fragmentering af phospho-peptider, selv efter en neutral tab af phosphatgruppen. Det udfører en tidsbesparende "pseudo-MS 3". Phospho-site bestemmelse i MS / MS-data kræver en særlig kontrol og evaluering, og kan udføres af fosfor 3.0.
- Efter phosphopeptid berigelse, aldrig tørre prøver helt. Hold altid prøver opløst.
5. Bioinformatik - Meta-analyse
BEMÆRK: Inden du udfører funktionel annotation og netværk analyse, protein lister skal forbehandlet. Først fusionere listerne over regulerede proteiner og phospho-peptider til hver hjerne region separat. Så fjerne alle duplikere UniProt-id'er til hver fraktion for at forhindre fejlfortolkninger.
- Singular berigelse analyse med GeneCodis 17
- Åbn webbaseret værktøj af GeneCodis (http://genecodis.cnb.csic.es)
- Vælg "Mus musculus" som organisme og "GO biologisk proces" som anmærkning.
- Indsæt en liste over UniProt-id'er af en vis fraktion. Indsend og vente, indtil analysen udføres. Klik på "Singular Berigelse Analyse af GO biologisk proces" og se resultater.
- Gentag trin 5.1.3 for de andre tre fraktioner.
- For at se nogen overlapninger og kryds mellem resultatet listerbruge et scriptsprog som Perl eller Python til at filtrere de nødvendige data. Lignende værktøjer til en ental berigelse analyse er DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) og Cytoscape (http://www.cytoscape.org/) med plugins BINGO (http://apps.cytoscape.org/ apps / bingo) og ClueGO (http://apps.cytoscape.org/apps/cluego).
- Generering af en kraft baseret graf ud af GeneCodis data med Gephi (https://gephi.org/)
BEMÆRK: Data for graferne skal leveres af brugeren, enten i en graf format (.gexf, .graphml, .dot, .gv, .gml) eller indtastes manuelt.- Generering grafen noder
- I hånden: Åbn Gephi og klik på "Data Laboratory". Opret noder. Klik på "Nodes" til venstre for at skifte til "Nodes" bord. Klik på "Tilføj node". Indtast navnet på den Term. Klik på "OK" / Tryk på Enter.
- Alternative: Gem GeneCodis føre til PC. Åbn .txt med et regnearksprogram. Slet alle rækker except fra "Item_Details" (sigt navne). Skift header "Item_Details" til "Label". Gem regneark som ".csv". Nu i Gephi, klik på "Importer regneark". Vælg regneark fra filen browser Gephi. Klik på "Næste". Klik på "Finish".
- Tilslutning af knuder via kanterne.
- Klik på "Edges" til venstre for at skifte til "Edges" bord. For hver knude (Term): se op gen navne i andre vilkår. Hvis en eller flere gener deles -> skabe kant.
- Klik på "Tilføj kant". Vælg "ikke-orienteret". Vælg kilde og mål node ud af drop down lister. Klik på "OK" / Tryk på Enter. Hvis mere end ét gen er delt, indtaste overflod i "Weight" (tabel).
- Kraft baseret grafisk layout.
- Open Graph datafil, indstille graftypen til "ikke-orienteret", eller bruge dataene som indtastet i hånden, skal du klikke på "Oversigt", hvis det ikke allerede selected.
- Resize noder afhængigt af overflod af sammenkoblinger. Klik på Statistik, køre enten "Average Degree" (uvægtet kanter) eller "Gns. Vægtet Degree" (vægtede kanter) under "Netværk Oversigt". I "Udseende", klik på "Nodes", derefter på Size knappen, næste vælg "Egenskaber", og indstil attributter parameter til "Gns. Vægtet Degree" eller "Average Degree". Klik på Anvend.
- Endelig: Vælg "force Atlas" i "Layout" og køre; ændre "Repulsion styrke", hvis knudepunkter er kolliderer.
- Eksporter til billede.
- Skærmbillede funktion: Klik på "Oversigt", ændre grafen layout, kant tykkelse, label størrelse og skalering med menuen i bunden af "Graph" vinduet. Klik kameraet venstre knap, og gemme billedet.
- Eksport funktion af "Preview": Klik på "Preview". Skift Presets til "Standard lige". Skift indstillings efter de valgte præferencer og klik på "SVG / PDF / PNG" for at eksportere.
- Generering grafen noder
Representative Results
Figur 1 opsummerer komplet workflow af kvantitativ synaptisk proteomanalyse profilering af mus hjerneregioner efter auditiv læring diskrimination. Det starter med dyret uddannelse i en shuttle kassen. I det i figur 2 viste eksempel mus begyndte at vise betydelig diskrimination FM tone i 4. træning, hvilket indikerer effektiv indlæring. Dyrene aflives på udvalgte tidspunkter for hjerneområde dissektion. Den krævede berigelse af synapser kan enten opnås ved fremstilling af synaptosomer eller alternativt ved fremstilling af en PSD-beriget fraktion, begge beskrevet detaljeret i figur 3. Der er udviklet PSD-berigelse fremgangsmåde til lave væv beløb, eksempelvis 1 - 2 hippocampale skiver fra rottehjerne 12, 18. Det kræver små rør, PTFE pestles montering til disse rør, og et laboratorium boring drev til kraftoverførsel støder.
På grund af den særlige protein sammensætning synaptosomer, er det stærkt anbefales at udføre prøveforberedelse i to forskellige, men komplementære måder. Stilladser af PSDs er ofte meget proteiner med høj molekylvægt, der forekommer i høj støkiometri. In-opløsning digest er den bedste måde at udtrække dem effektivt, men kan føre til en oversampling af det genererede peptidblanding. I-gel fordøje udføres af den samme prøve i parallel kan udelukke disse proteiner med høj molekylvægt og fremme analyse af proteiner af mellem- og lavere molekylvægt. For en omfattende analyse anbefales begge typer af proteolytiske fordøjer.
De forskellige mængder af væv i hjerneområder undersøgte kræver en justering af det påførte materiale til bedre sammenligning. Inden for de fire undersøgte hjerneområder den auditive cortex er generelt den begrænsende omstændighedeller. Materialet i alle andre hjerneområder bør omhyggeligt justeres til størrelsen af den auditive cortex efter fremstilling af synaptosomer eller PSD-berigede fraktioner (se 3.1.1.). Typiske vægte af frisklavet hjerneområder fra mus er som følgende: auditive cortex (AC): ~ 50 mg; hippocampus (HIP): ~ 90 mg; striatum (STR): ~ 120 mg og frontale cortex (FC): ~ 100 mg.
PSD-berigelse beskrevet i afsnit 2.3 tillod identifikation af omkring 1500 forskellige proteiner og ca. 250 forskellige phospho-peptider per hjerne region på niveauet af et enkelt dyr (tabel 1). Proteomanalyse 24 timer efter den første træningssession viste, at 7,3% af de identificerede proteiner og 5,8% af phospho-peptider udviste signifikant (p <0,05) kvantitative ændringer i deres synaptisk ekspression sammenlignet med naive kontroller (tabel 1). Et iøjnefaldende tendens til ned regulation af synaptiske stilladser kan pege på en udtalt omlægning af den synaptiske arkitektur under tidlige stadier af FMTD læring. Langt størstedelen af de regulerede proteiner blev ændret i en hjerne region-specifik måde, hvorimod der ikke blev fundet kun 22%, der skal reguleres i to eller flere områder i hjernen. Seks udvalgte eksempler er vist i figur 4.
Meta-analyse af de komplekse resultater ved IPA giver evidens for særlige deltagelse / manipulation af følgende kanoniske veje: "clathrin endocytose Signaling", "axonal Guidance Signaling", "Calcium Signaling", "RhoA Signaling", "Notch Signaling "," Remodeling af Epithelial adherensovergange "," glutamat receptor Signaling "," GABA receptor Signaling "," Dopamin Receptor Signaling "og" Synaptic langtidspotensering ".
(figur 5). I de auditive cortex biologiske processer, herunder ion transport, oversættelse, mRNA transport, protein transport og læring var mærkbar. Analysen af proteinfraktionen af hippocampus detekterer betydeligt beriget processer relateret til iontransport, cellecyklus, oversættelse, phosphorylering og nervesystem udvikling. I striatum, overrepræsenteret blev fundet biologiske processer, herunder mRNA transport, vesikel-medieret transport, axonogenesis, proteolyse, protein transport og endocytose.
Figur 1: Systematisk Workflow af den metodiske tilgang. Dette tal opsummerer skematisk arbejdsgangen for høj opløsning kvantitativ profilering af hjernens område specifik synaptisk protein sammensætning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempel på resultater af mus i FM Tone Diskrimination Task. Dyr viser en stigende rente af hits (blå kurve) og en faldende sats for falske alarmer (sort kurve) i løbet af træningssessioner. Signifikant diskrimination sker fra den fjerde session. Fejlsøjler er tilvejebragt som SEM. Klik her for at se et larger version af dette tal.
Figur 3: Fremstilling af synaptosom og PS-fraktion. A: synaptosom præparat. B: PSD-beriget præparat fraktion. Begge tal forklare detaljeret workflow til fremstilling af synaptosomer eller alternativt PSD-berigede fraktioner fra hjernevæv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Udvalgte Kvantitativ proteomisk Resultater. De relative synaptiske mængderne af udvalgte proteiner sammenlignes mellem mus trained på FMTD opgave (AV, n = 6) og naive kontrolmus (NV, n = 6) 24 timer efter den første træningssession. Bestandsberegningerne værdier blev beregnet som medianen af toparealer for de tre mest intense peptider af et protein. Proteiner med signifikante overflod ændringer (AV / NV, t-test) er markeret inden for de parceller: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,005. Fejllinjer leveres som SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Visualisering af biologiske veje for Frontal Cortex af GeneCodis / Gephi. Kun væsentlige vilkår af databasen Gene Ontology (GO) (http://geneontology.org) relateret til "Biologisk proces" med et protein antal på mindst tre Her vises. Knudepunkter repræsenterer GO termer, størrelsen af knuden, liniebredden og antallet af forbindelser af en vis node afbilder antallet af proteiner, som deler dette GO term med andre knudepunkter. På grund af den "force Atlas" metode til Gephi, er relaterede noder klyngedannelse tæt sammen. Klik her for at se en større version af dette tal.
| hjerneregion | AC | FC | HOFTE | 000 "face =" Calibri "size =" 3 "> STR | Σ |
| identificerede proteiner | 1435 | 1758 | 1572 | 1507 | 6272 |
| regulerede proteiner (p <0,05) | 59 | 130 | 162 | 108 | face = "Calibri" size = "3"> 459 |
| ↑ AV / NV | 8 | 4 | 76 | 35 | 123 |
| ↓ AV / NV | 51 | 126 | 86 | 73 | 336 |
| identificeret phosphomoti fs | 197 | 361 | 273 | 278 | 1109 |
| regulerede phosphomotifs (p <0,05) | 8 | 22 | 21 | 14 | 65 |
| ↑ AV / NV | 4 | 00000 "face =" Calibri "size =" 3 "> 17 | 5 | 9 | 35 |
| ↓ AV / NV | 4 | 5 | 16 | 5 | 30 |
Tabel 1: Oversigt over en proteomiske Result. Tabellen er udarbejdet et repræsentativt proteomisk eksperiment af uddannede mus (AV, n = 6) 24 timer efter den første træning i forhold til deres naive kontroller (NV, n = 6). Detsum af 459 regulerede proteiner indbefatter overlappende regler. 283 forskellige regler blev bestemt som hjerne specifik. I detaljer, er 57 proteiner reguleret i to områder af hjernen, blev påvist 18 protein regler på tre områder af hjernen og kun 2 proteiner reguleres i alle fire undersøgte områder i hjernen.
| Fejl tolerancer | |
| precursor masse (Fourier Transformation massespektrometri) | 10 ppm |
| fragment ion mass (lineær ion trap) | 0.6 Da |
| Maksimalt mistede spaltninger pr peptid | 3 |
| Faste modifikationer | |
| for i-gel-fordøjet prøver | Carbamidomethylation af cystein |
| i-opløsning-fordøjet prøver | Methylthiolation af cystein |
| Variable modifikationer | Oxidation af methionin |
| Deamideringer af Asparagin og / eller Glutamin | |
| Database | UniProt / Sprot |
| Taksonomi | mus |
| Statistiske indstillinger identifikation-accept | |
| de novo gennemsnitlig lokal tillid (ALC) | > 50% |
| Peptid-falsk opdagelse sats (FDR, baseret på est. Lokke-fusion) | <1% |
| Protein signifikans (-10logP, baseret på modificeret T-test) | > 20 |
| unikke peptider / proteiner | ≥ 1 |
| Indstillinger Kvantificering: | |
| Peptider anvendt til kvantificering, hvis: | |
| Peptid signifikans (-10logP) | > 30 |
| Peptid identifikation i | ≥ 50% af prøverne |
| Peptid signalkvaliteten | > 1 |
| Peptid gennemsnitlige areal | > 1E5 |
| Peptid tolerance retentionstid | <5 min |
| normalisering | ved total ionstrøm (TIC) |
Tabel 2: Indstillinger for Protein Identification (trin 4.2.2).
Discussion
Undersøgelsen præsenterer en metodisk arbejdsgang optimeret til en nøjagtig kvantitativ profilering af synaptiske protein udtryk forandringer under indlæring og hukommelse konsolidering i forskellige dele af hjernen hos mus. Opsætningen giver mulighed for at studere det protein udtryk på niveauet af et enkelt dyr på trods af det ønskede program af mindst tre tekniske replikater per prøve til massespektrometrisk analyse.
Metodikken tager hensyn til den særlige protein sammensætningen af præ- og postsynapse bestående af højmolekylære scaffold proteiner, men også af vigtig mediator proteiner bærende medium eller lavere molekylvægte. De i-løsning spaltningsprodukter af synaptosomale præparater resultere i en effektiv produktion og dermed en overrepræsentation af stillads-afledte peptider. Dette vil igen, kan undertrykke analyse af mindre eller lavere rigelige proteiner. Den foreslåede fremstilling af SDS-PAGE-fraktioner fra enaliquot af hver prøve kombineres med en i-gel fordøjelse procedure parallelt hermed letter analysen af mellem- og lav hyppighed proteiner og udgør en stærkt anbefales supplerende metode. Efter separat massespektrometrisk anvendelse af alle fraktioner afledt fra en prøve (fx i-opløsning fordøje, i-gel fordøje, kombinerede phospho-berigede fraktioner) de tilsvarende MS / MS datasæt kan kombineres og yderligere beregnet for proteinidentifikation og kvantificering med PEAKS software eller alternative populære softwarepakker.
Alternativt individuelle anvendelse af i-gel-fordøjelse-afledte fraktioner af en prøve (separat bearbejdede gel-områder af en prøve lane) og fraktioner genereret af den i opløsning fordøjet prøve (fx ved ionbytningskromatografi) til massespektrometri kan øge den analytiske dybde. Men dette udvidede arbejdsgang dramatisk øger den krævede tid for LS-MS / MS datafangst. For generation af en detaljeret molekylær sekvens af synaptiske protein omlejringer under indlæring og hukommelsesdannelse en specificeret tidsforløbet for proteomik profilering er påkrævet. Dette tidsforløb kan begynde umiddelbart efter eller selv under den første træning og dækker et tætmasket tidsramme indtil dyrenes præstationer nåede asymptotiske niveau indlæringskurve efter ca. 8 - 10 dages træning (se figur 2 for detaljer).
Analysen af phosphorylering ændringer i synaptiske proteiner kræver særlig fokus på de udvalgte tidsrammer under FMTD læring. På den ene side signalering kaskader initierende synaptiske protein omlejringer kendt for at være udløst af protein fosforyleringer og dephosphoryleringerne forventes på meget tidlige stadier af dyr uddannelse. På den anden side er der langvarige modifikationer af multiple phosphorylerede synaptiske proteiner kendt som regulerer konnektivitet og montage inden for synaptic arkitektur 19, 20. Disse posttranslationelle modifikationer forventes selv på senere tidspunkter hukommelse konsolidering.
De komplekse datasæt genereret af denne proteomisk arbejdsgang kræver bioinformatik behandling for at identificere de deltagende molekylære veje og centrale molekyler. Meta-analyse viser signifikante overrepræsenteret pathways, der spiller en rolle i indlæring og hukommelse processer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M Empore Solid Phase Extraction- Filter | 3M Bioanalytical Technologies | 4245SD | 7 mm/3 ml |
| Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164564 | 100 µm x 2 cm, C18 |
| Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164569 | 75 µm x 25 cm, C18 |
| Acetic acid | Carl Roth GmbH | 3738.1 | |
| Acetonitrile (ACN) | Carl Roth GmbH | AE70.2 | |
| Acrylamide (30%) | AppliChem | A0951 | |
| Ammonium hydrogen carbonate | Fluka | 9830 | |
| Ammonium hydroxide | Fluka | 44273 | |
| Ammonium persulfate (APS) | AppliChem | A2941 | |
| Biofuge pico | Heraeus GmbH | 75003280 | |
| Blue R-250 | SERVA Electrophoresis GmbH | 17525 | |
| Bromophenol Blue | Pharmacia Biotech | 17132901 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Cantharidin | Carl Roth GmbH | 3322.1 | |
| Centrifuge tubes for MLS-50 | Beckman Coulter | 344057 | |
| Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343776 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
| Eppendorf 5417R centrifuge | VWR | 22636138 | |
| Eppendorf A-8-11 rotor | VWR | 5407000317 | |
| Formic acid | Fluka | 14265 | |
| GeneCodis | http://genecodis.cnb.csic.es/ | ||
| Gephi | https://gephi.org/ | ||
| Glycerol | AppliChem | A1123 | |
| Glycine | AppliChem | A1067 | |
| HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Pierce /Thermo Scientific | 78420 | |
| HEPES Buffer solution | PAA Laboratories GmbH | S11-001 | |
| Homogenization vessel 2 ml | Sartorius AG | 854 2252 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Laboratory drilling drive K-ControlTLC 4957 | Kaltenbach & Vogt GmbH | 182997 | |
| LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2 | Thermo Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Scientific | ||
| Macs-mix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | |
| Magic Scan 4.71 | UMAX | ||
| Methanol | Carl Roth GmbH | AE71.2 | |
| MLS-50 rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| Optima MAX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PEAKS 7.5 | Bioinformatic Solutions | ||
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| PhosphoRS 3.1 | IMP/IMBA/GMI | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| Plunger/pestle made of PTFE | Sartorius AG | 854 2651 | |
| PotterS homogenizer | Sartorius AG | 853 3024 | |
| Protease Inhibitor complete mini | Roche | 4693159001 | |
| Quantity One 4.5.1 | BioRad | ||
| RapiGest | Waters | 186002122 | |
| Shuttle box | Coulbourne Instruments | ||
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | AppliChem | A1112 | |
| Sodium molybdate | Carl Roth GmbH | 274.2 | |
| Sodium tartrate dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | 305 | |
| Soundproof chamber | Industrial Acoustics Company | ||
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | |
| Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Thermomixer basic | CallMedia | 111000 | |
| Titansphere TiO 5µm | GL Sciences Inc. Japan | 502075000 | |
| TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Trifluoro acetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) | AppliChem | A1086 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Ultimate 3000 Ultra HPLC | Dionex/Thermo Scientific | ||
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 343776 | |
| Unijet II Refrigerated Aspirator | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
| UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
| Urea | AppliChem | A1049 | |
| Water (high quality purifed) | Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C Pyrogens: < 0.02 EU/ml TOC: < 10 ppb | ||
| Xcalibur 3.0.63 | Thermo Scientific | ||
| ZipTipC18 Pipette Tips | MILLIPORE | ZTC18S960 |
References
- Lamprecht, R., LeDoux, J.
- Bingol, B., Schuman, E. M. Synaptic protein degradation by the ubiquitin proteasome system. Curr Opin Neurobiol. 15 (5), 536-541 (2005).
- Richter, J. D., Klann, E. Making synaptic plasticity and memory last: mechanisms of translational regulation. Genes Dev. 23 (1), 1-11 (2009).
- Rosenberg, T., et al. The roles of protein expression in synaptic plasticity and memory consolidation. Front Mol Neurosci. 7, 86 (2014).
- Scheich, H., et al. Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept. Hear Res. 271 (1-2), 3-15 (2011).
- Kähne, T., et al. Synaptic proteome changes in mouse brain regions upon auditory discrimination learning. Proteomics. 12 (15-16), 2433-2444 (2012).
- Reichenbach, N., et al. Differential effects of dopamine signalling on long-term memory formation and consolidation in rodent brain. Proteome Sci. 13, 13 (2015).
- Kähne, T., et al. Proteome rearrangements after auditory learning: high-resolution profiling of synapse-enriched protein fractions from mouse brain. J Neurochem. , (2016).
- Li, K., et al. Organelle proteomics of rat synaptic proteins: correlation-profiling by isotope-coded affinity tagging in conjunction with liquid chromatography-tandem mass spectrometry to reveal post-synaptic density specific proteins. J Proteome Res. 4 (3), 725-733 (2005).
- Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. J Cell Biol. 86 (3), 831-845 (1980).
- Smalla, K. H., Klemmer, P., Wyneken, U. The Cytoskeleton - Imaging, Isolation, and Interaction. Dermietzel, R. , Humana Press. 265-282 (2012).
- Smalla, K. H., et al. The synaptic glycoprotein neuroplastin is involved in long-term potentiation at hippocampal CA1 synapses. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (8), 4327-4332 (2000).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).
- Thingholm, T. E., Larsen, M. R., Ingrell, C. R., Kassem, M., Jensen, O. N. TiO(2)-based phosphoproteomic analysis of the plasma membrane and the effects of phosphatase inhibitor treatment. J Proteome Res. 7 (8), 3304-3313 (2008).
- Carmona-Saez, P., Chagoyen, M., Tirado, F., Carazo, J. M., Pascual-Montano, A. GENECODIS: a web-based tool for finding significant concurrent annotations in gene lists. Genome Biol. 8 (1), 3 (2007).
- Bonn, S., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Combinatorial expression of alpha- and gamma-protocadherins alters their presenilin-dependent processing. Mol Cell Biol. 27 (11), 4121-4132 (2007).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J Proteome Res. 8 (11), 4966-4982 (2009).
- Li, L., et al. The differential hippocampal phosphoproteome of Apodemus sylvaticus paralleling spatial memory retrieval in the Barnes maze. Behav Brain Res. 264, 126-134 (2014).
