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Artigo de método

In Vivo Investigation of Antimicrobial Therapy luz azul para-multirresistente Acinetobacter baumannii queimadura Infecções Usando bioluminescência Imagiologia

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DOI:

10.3791/54997

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28 de abril de 2017

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1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Medical Oncology, Beijing Institute of Translational Medicine, Chinese Academy of Sciences, 3Cancer Center, Aviation General Hospital, Beijing, 4Infectious Disease Service, Brooke Army Medical Center

Neste artigo

Resumo

As infecções causadas por cepas bacterianas multirresistentes (MDR) surgiram como uma séria ameaça à saúde pública, necessitando do desenvolvimento de terapias alternativas. Apresentamos um protocolo para avaliar a eficácia da terapia antimicrobiana com luz azul (aBL) para infecções por Acinetobacter baumannii MDR em queimaduras de camundongos usando imagens de bioluminescência.

Resumo

Queime infecções continuam a ser uma importante causa de morbidade e mortalidade. O aparecimento crescente de bactérias resistentes a múltiplas drogas (MDR) levou à falha frequente de tratamentos com antibióticos tradicionais. alternativas terapêuticas são urgentemente necessários para combater bactérias MDR.

Uma abordagem não-antibiótico inovador, luz azul antimicrobiana (ABL), demonstrou eficácia promissora contra infecções MDR. O mecanismo de acção de Abl não é ainda bem compreendido. É geralmente formulada a hipótese de que ocorre naturalmente cromóforos endógenos fotossensibilizantes em bactérias (por exemplo, porfirinas de ferro livre, as flavinas, etc.) são excitados por Abl, que por sua vez produz citotóxicos espécies reactivas de oxigénio (ROS) através de um processo fotoquímico.

Ao contrário de uma outra abordagem antimicrobiana à base de luz, antimicrobiana terapia fotodinâmica (APDT), terapia Abl não requer o envolvimento de um photosensitiz exógenoer. Tudo que precisa para entrar em vigor é a irradiação de luz azul; por conseguinte, é simples e barata. Os receptores ABL são os fotossensibilizadores celulares endógenos em bactérias, em vez do ADN. Assim, Abl acredita-se ser muito menos genotóxico para as células do que a irradiação ultravioleta C (UVC), o que provoca danos no DNA directamente nas células hospedeiras hospedeiras.

Neste artigo, apresentamos um protocolo para avaliar a eficácia da terapia de ABL para MDR Acinetobacter baumannii infecções em um mouse modelo de queimaduras. Usando uma cepa bioluminescente engenharia, fomos capazes de monitorar de forma não invasiva a extensão da infecção em tempo real em animais vivos. Esta técnica é também uma ferramenta eficaz para o controlo da distribuição espacial de infecções em animais.

Introdução

Queimam infecções, que são frequentemente referidas por causa de lesões térmicas cutâneas, continuam a ser uma causa importante de morbidade e mortalidade 1. O tratamento de infecções da queimadura foi ainda mais comprometida pelo aumento da emergência de (MDR) 2 estirpes bacterianas resistentes a múltiplas drogas, devido ao uso de antibióticos. Uma bactéria Gram-negativas MDR importantes é Acinetobacter baumannii, que é conhecida por estar associada com feridas de batalha recentes e é resistente a quase todos os antibióticos disponíveis 3. A presença de biofilmes na focos ferida foi avaliado 4, 5 e acredita-se que exacerbam a tolerância a antibióticos e a defesa do hospedeiro 6, 7, causando infecções persistentes 8, 9. Portanto, há uma pressing preciso para o desenvolvimento de tratamentos alternativos. Na Estratégia Nacional recentemente anunciado de Combate às bactérias resistentes aos antibióticos, o desenvolvimento de terapias alternativas aos antibióticos tem sido observado como uma ação por parte do governo dos Estados Unidos 10.

abordagens antimicrobianas à base de luz, como indicado pelo seu nome, requerem irradiação de luz com ou sem outros agentes. Estas abordagens incluem a terapia antimicrobiana fotodinâmica (APDT), ultravioleta C (UVC) irradiação, e luz azul antimicrobiana (Abl). Em estudos anteriores, que demonstraram eficácia em matar promissor MDR estirpes bacterianas 11, 12, 13. Entre as três abordagens à base de luz, a ABL tem atraído cada vez mais atenção nos últimos anos devido às suas propriedades antibacterianas intrínsecas sem o uso de fotossensibilizantes 14. em comparIson para APDT, Abl envolve apenas o uso de luz, enquanto APDT requer uma combinação de luz e um fotossensibilizador. Portanto, Abl é simples e de baixo custo 14. Em comparação com UVC, Abl acredita-se ser muito menos citotóxico e genotóxico para células 15 hospedeiras.

O objetivo deste protocolo é investigar a eficácia da ABL para o tratamento de infecções de queimaduras causadas por MDR A. baumannii em um modelo de mouse. Nós usamos bactérias patogênicas bioluminescentes para desenvolver novos modelos de ratos de infecções de queimaduras que permitem o monitoramento não-invasivo da carga bacteriana em tempo real. Em comparação com o método tradicional de recolha de amostras de fluido corporal / tecido e plaqueamento subsequente e colónia de contagem 16, esta técnica fornece resultados precisos. O processo de amostragem de tecidos pode apresentar uma outra fonte de erro experimental. Desde a intensidade da luminescência bacteriana é linearmente proporcional à corresponding bacteriana CFU 17, podemos medir directamente a sobrevivência de bactérias depois de uma certa dose de irradiação de luz. Ao monitorizar a carga bacteriana em animais vivos receber o tratamento com luz, em tempo real, a cinética da morte bacteriana pode ser caracterizado utilizando um número significativamente reduzido de ratinhos.

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Protocolo

1. Preparação de Cultura Bacteriana

  1. Adicionar 7,5 mL de Brain Heart Infusion (BHI) meio para um tubo de centrífuga de 50 mL. Semente células A. baumannii no meio BHI e então incubar a cultura de A. baumannii numa incubadora orbital (37 ° C) durante 18 h.
  2. Centrifugar a cultura de células a 3500 x g durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e lavar os sedimentos em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
  3. Re-suspender as pelotas de bactérias em PBS fresco e pipetar cuidadosamente a suspensão.
  4. Recolher 100 uL de suspensão bacteriana e fazer uma diluição de 1:10 utilizando PBS fresco.
  5. Transferir a diluição de 1,5 ml de uma semi-micro cuvete e medir a densidade óptica (DO) a um comprimento de onda de 600 nm (OD 600 nm).
  6. Calcular a OD 600 nm da suspensão original (não diluída) em PBS de acordo com o valor de OD 600 nm medido da diluição e o factor de diluição (10).
  7. Ajuste the suspensão inicial em PBS até DO600 nm = 0,6 (correspondendo a uma densidade celular de 10 8 CFU / mL).

2. Rato Modelo de Infecção queimadura causada por Bioluminescent A. baumannii

  1. Uso de adultos do sexo feminino BALB / c com idades entre 7-8 semanas e pesando 17-19 g. Permitir que os ratinhos para aclimatizar às condições laboratoriais durante pelo menos 3 dias antes do inicio da experiência. Manter os ratinhos em uma 12 h ciclo de luz / escuridão sob uma temperatura ambiente de 21 ℃ e dar-lhes comida e água ad libitum.
  2. Anestesiar os ratos com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de cetamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). Tocar levemente a pálpebra de cada rato com um cotonete; uma ausência do reflexo palpebral sugere uma profundidade de anestesia adequada. Cobrir os olhos do rato com pomada veterinário para impedir que os olhos de secura durante a anestesia.
  3. Raspar os ratinhos na parte de trás para expor a pele tanto quanto possível, utilizando um 5máquina de cortar cabelo 0-lâmina.
  4. Colocar a tampa de uma placa de Petri de 35 milímetros por baixo dos abdómens dos ratos a manter as costas em posição relativamente horizontal.
  5. água ferver em um copo de 250 ml (80% total), utilizando um x 10" , 220 VAC placa de aquecimento 10" . Imergir um bloco de latão (secção transversal de 1 cm x 1 centímetro) no tubo de ensaio até que o equilíbrio térmico com a água é alcançada. equilibração térmica geralmente leva <5 min e é indicado por a re-ebulição da água no copo.
  6. Antes de criar a lesão por queimadura, administrar analgésico preventivo (uma injecção subcutânea de 0,1 mg / kg de buprenorfina) para alívio da dor.
  7. Dez minutos depois de os analgésicos de preferência, pressionar suavemente o bloco de latão aquecida à área rapada no dorso dos ratos durante 7 s para induzir feridas de queimaduras.
    NOTA: Para evitar lesão térmica para o pessoal que trabalha, usar luvas térmicas resistentes ao realizar o procedimento de queima.
  8. Administrar 0,5 ml de solução salina estéril através subcutaneous injecção para evitar a desidratação.
  9. Cinco minutos após a indução da lesão térmica, inocular 50 mL de suspensão bacteriana contendo 5 x 10 6 CFU em PBS para as queimaduras de rato utilizando uma pipeta. Ao mover uma mecha de algodão estéril em um movimento em zigue-zague na pele, manchar as aliquotas sobre as queimaduras para distribuir as células bacterianas na área queimada tão uniformemente quanto possível.
  10. Imediatamente após a inoculação bacteriana, realizar imagem de bioluminescência para as queimaduras infectadas, tal como descrito na Secção 4.
  11. Colocar os ratos sobre uma cama cirúrgico aquecido em água (37 ° C, a área de recuperação) até que os ratinhos ter recuperado completamente da anestesia. Casa a ratos com um número máximo de 5 por gaiola numa sala de animais Segurança Biológica Nível-2.
  12. Administrar analgésicos (injecção subcutânea de 0,1 mg / kg de buprenorfina) duas vezes por dia durante os três primeiros dias após o ferimento de queimadura.

3. Antimicrobial Therapy Light Blue para A. & #160; baumannii Infecção em Ratos

  1. Iniciar a terapia Abl às 24 h após a inoculação bacteriana.
  2. Utilizar um díodo emissor de luz (LED), com um pico de emissão a 415 nm para a irradiação Abl. Montar o LED em um dissipador de calor para evitar efeitos térmicos na área irradiada em ratos 18. Corrigir o levou a uma haste de suporte óptico com conectores de clipe para permitir que o LED para mover para cima e para baixo.
  3. Ligue o medidor de potência / energia e pressione o botão de comprimento de onda para selecionar 415 nm. Redefinir o medidor de potência / energia para subtrair o fundo (luz ambiente).
  4. Coloque o medidor de potência / energia direita sob o LED. Usar óculos azul-claro-proteção. Ligar a luz de LED e ajustar a distância entre a abertura de diodo emissor de luz (uma lente que converge a luz do diodo emissor de luz) e o sensor de luz (2 cm de diâmetro) do medidor de potência / energia, de modo que o ponto de luz abrange toda a área de o sensor de luz.
  5. Cuidadosamente sintonizar o driver de LED e gravar a leitura do power metro / energia. Calcular a irradiação de acordo com a leitura: irradiância = Leitura (W) / área (cm2). Ajuste a irradiância do LED para 100 mW / cm2 por meio do ajuste do driver de LED.
  6. Desligue o LED. Medir a distância entre a abertura de diodo emissor de luz e o sensor de luz do medidor de potência / energia.
  7. Anestesiar os ratos com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de cetamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). Uma ausência do reflexo palpebral sugere uma profundidade de anestesia adequada.
  8. Aleatoriamente dividir os ratinhos num grupo tratado com Abl (n = 10) e um grupo não tratado de controlo (n = 10).
  9. Para o grupo tratado com Abl, cobrir os olhos de ratinhos com folha de alumínio para evitar a exposição excessiva à luz. Coloque as queimaduras do mouse diretamente sob o LED, com a tampa de uma placa de Petri de 35 mm por baixo do abdómen mouse para manter suas costas em uma posição horizontal.
  10. Substituir o medidor de potência / energia mencionado no passo 3.5 com um rato sobre um petri di quadradosh. Ajustar a altura do rato de volta para uma posição onde a distância entre a abertura de diodo emissor de luz e a superfície da queimadura rato é igual ao que entre a abertura de diodo emissor de luz e o nível do sensor de luz do medidor de potência / energia (como discutido na etapa 3.5).
  11. Irradiar as queimaduras infectadas com uma irradiação de 100 mW / cm 2. Entregar Abl em doses de 72 J / cm 2 até uma dose total de 360 J / cm 2 é atingido (por exemplo, 0, 72, 144, 216, 288 e 360 J / cm 2). Após cada dose de luz, realizar imagem de bioluminescência para os ratos, tal como discutido na Secção 4.
  12. Para o grupo de controlo não tratado, realizar imagem de bioluminescência das queimaduras do rato, tal como discutido na Secção 4, usando os mesmos intervalos de tempo como utilizados para o grupo tratado com Abl.
  13. Antes da recuperação dos ratinhos, colocar os murganhos na mesa operatória aquecida em água para evitar a perda de calor e hipotermia. Observar a actividade e o reflexo palpebral dos murganhos até à recuperação. Depois dee recuperação dos ratinhos, os alojar 2-3 por gaiola.
  14. Depois da terapia Abl, realizar imagem de bioluminescência, tal como discutido na Secção 4, diariamente durante os primeiros 3 dias e em seguida em dias alternados para monitorar a bio-carga temporal das infecções em ratinhos.

4. A bioluminescência imagem das infecções em ratos

  1. Imagem dos murganhos utilizando um sistema de imagem de baixa luz que inclui uma câmara intensificada dispositivo de carga acoplada, um controlador de câmara, uma câmara de amostra, e um processador de imagem 19.
  2. Anestesiar os ratos com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de cetamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). Toquem levemente na palpebral dos ratos com um cotonete; uma ausência do reflexo palpebral sugere uma profundidade de anestesia adequada.
  3. Inicie o software de imagem ao vivo. No painel de controle que aparece, clique em Inicializar. Aguardar até que a cor da caixa de temperatura torna-se verde, indicando que a temperatura da fasena câmara de amostra atingiu 37 ° C.
  4. Colocar os murganhos na fase (37 ° C) na câmara de amostra do sistema de imagem, com as queimaduras infectadas directamente sob a câmara.
    NOTA: A bioluminescência da bactéria poderia diminuir quando as queimaduras tornar-se seca. Portanto, recomenda-se hidratar as queimaduras do mouse com PBS antes de imagem.
  5. No painel de controle, coloque uma marca de verificação ao lado de "luminescência". Selecione "exposição Auto" para que o tempo de exposição para a imagem latente será otimizado pelo software de imagens ao vivo com base na intensidade de bioluminescência.
  6. Selecione "C" da lista drop-down "Field of View". Selecione a opção "Scan mid range" para deixar o software determinar a distância focal. Coloque uma marca de seleção ao lado de Overlay.
  7. Clique em "Adquirir" para capturar a imagem. Na caixa "Editar etiqueta Imagem", clique em "OK"; uma "Janela de imagem" e "Toll Palette" aparecerá.
  8. Definir parâmetros Auto ROI para auto-seleção.
  9. Quantificar a intensidade de bioluminescência como unidades de luminescência relativa (RLU) e exibir a bioluminescência em uma escala de cores falsas que varia de rosa (mais intensa) para azul (menos intensa) 19, 20.
  10. Calcular a fracção de sobrevivência das bactérias em queimaduras de rato em diferentes pontos de tempo com base na análise da intensidade de bioluminescência. A fracção de sobrevivência das bactérias a um dado ponto de tempo = a intensidade bioluminescência medido em que ponto de tempo / intensidade da bioluminescência medido direita antes da exposição Abl 17.

5. Eutanásia dos Ratos

  1. Os pontos finais da experiência são da seguinte forma: (a) a resolução da infecção tal como evidenciado pela perda de bioluminescência como determinado por imagiologia; (B) ocorrência de infecções sistemáticos como indicado pela propagação de bioluminescência fora do queimados sãouma; (C) A perda de peso corporal ≥15% em comparação com ratinhos normais de idade, ou o sofrimento de dor e desconforto, como indicado pela falta de capacidade de resposta à estimulação manual, imobilidade, uma incapacidade de comer ou beber. Durante o estudo, se nos deparamos com uma situação em que não tem certeza se um rato atingiu plenamente o estatuto de moribundo, conforme descrito pela nossa definição, e / ou que não tem certeza se precisamos sacrificar-lo, entraremos em contato com uma equipe veterinária CCM para um plano de ação; (D) caso contrário, os ratos serão sacrificados 30 dias após o início do estudo.
  2. Realocar os ratos em gaiolas fechadas especificamente para a eutanásia e a eutanásia ratos através da apresentação de dióxido de carbono (CO 2) de gás comprimido para as gaiolas.
    1. Abrir o tanque ou válvula reguladora de CO 2 para iniciar o fluxo de gás. Verifique se o regulador lê a psi correto (libras por polegada quadrada) com base em instruções publicadas pela unidade, e ajustar a regulator ao psi correcto, conforme necessário, tipicamente, não superior a 5 psi.
    2. Encha lentamente. O caudal deve deslocar não mais do que 30% do volume da câmara / gaiola por min (para uma gaiola típico rato, ~ 2 L / min; para uma gaiola de rato, ~ 7,5 L / min).
    3. Esperar cerca de 3-5 minutos para o animal para parar de se mover ou a respiração; os olhos devem ser fixas e dilatadas. Desligue CO 2 do tanque ou da válvula reguladora para parar o fluxo de CO 2.
    4. Certifique-se de que o coração não está batendo, sentindo o peito entre o polegar eo indicador. Certifique-se de que não há reflexo de piscar tocando no globo ocular.
      1. Se houver um batimento cardíaco ou o reflexo de piscar, repetir o processo de eutanásia ou utilize uma tesoura para abrir a cavidade torácica para criar um pneumotórax (o animal deve ser não responsivas a um aperto do dedo do pé antes de realizar este procedimento).

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Resultados

A estirpe de A. baumannii que é usado um isolado clínico MDR, como relatado previamente 12, 17. A estirpe bacteriana foi feita bioluminescente pela transfecção de luxCDABE ópera 11. A Figura 1A mostra as sucessivas imagens de luminescência bacteriana de um rato representativo queimar infectado com 5 x 10 6 A. baumannii e exposto a uma única exposição A...

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Discussão

Abl é um novo método para o tratamento de infecções. Desde o seu mecanismo de ação é completamente diferente da de quimioterapia, é mais de uma fisioterapia. O agente que medeia o efeito antimicrobiano é a irradiação de luz azul (400-470 nm). Com o desenvolvimento de LEDs azuis, ganhamos acesso a uma abordagem antimicrobiano à base de luz simples e eficaz para infecções MDR.

Neste protocolo, descrevemos o desenvolvimento de um modelo de rato de infecções de queimaduras causadas por uma estir...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte pelo Centro de Integração de Medicina e Tecnologia Inovadora (CIMIT) sob o Acordo de Cooperação de Atividade de Aquisição de Pesquisa Médica do Exército dos EUA (CIMIT No. 14-1894 para TD) e os Institutos Nacionais de Saúde (1R21AI109172 para TD). YW foi apoiado por uma Bolsa de Pesquisa para Estudantes da ASLMS (BS. S02.15). Somos gratos a Tayyaba Hasan, PhD no Wellman Center por sua co-orientação para YW.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IVIS PerkinElmer Inc, Waltham, MAIVIS Lumina Série IIIImagem pré-clínica in vivo
Diodo emissor de luz LEDVieLight Inc, Toronto, Canadá 415 nmFonte de luz para iluminação
Medidor de energia/energiaThorlabs, Inc., Newton, NJPM100DDetector de irradiância de luz
Mouse Charles River Laboratories, Wilmington, MABALB/c7-8 semanas de idade, 17-19 g peso
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TXIsolado clínicoCepa luminescente projetada
Seringas de insulinaFisher Scientific14-826-79BD Lo-Dose U-100 Seringas de insulina para injeção
Cloreto de sódioFisher Scientific7210160,9% Cloreto de sódio
fosfato tamponado salino, 1x SoluçãoFisher ScientificBP24384 Um tampão fosfato padrão usado em muitos procedimentos biomoleculares
Infusão de Cérebroe Coração Fisher ScientificB11059Meio de cultura bacteriana
Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga CônicosFisher Scientific14-959-70CPara centrífuga de suspensão bacteriana
Agitadores Orbitais Incubados de BancadaRede de Suprimentos de Laboratório, Inc, Atkinson, NH Incu-Shaker MiniPara cultura de bactérias
Inoculando LoopsFisher Scientific22-363-605   Para espalhar inoclo bacteriano na superfície de queimadura de camundongos
Pontas de Pipeta Redi-Tip da Fisher Scientific, 1-200 µ LFisher Scientific02-707-502Pontas de Pipeta
Thermo Scientific  Centrífuga Sorvall Legend X1Fisher Scientific75-004-220Para separação de suspensão bacteriana
Bloco de LatãoSmall Parts, Inc., Miami, FL10 mm por 10 mm Para criação de queimaduras em camundongos
Luvas de Alta Temperatura Extreme Dragon PBI/KevlarSuperior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NYPBI83514 Luvas resistentes ao calor
Pratos GreinerSigma-Aldrich Co. LLCP5112-740EA35 mm &vezes; Placa
Quente Digital CorningCole-Parmer Instrument Company, LLCUX-84301-6510" x 10", 220 VAC, para água fervente 
Cama Cirúrgica Aquecida a Água de Linha Fina para Ratos/RatoE-Z SystemsEZ-211Previne perda de calor e hipotermia durante a cirurgia
Pomada veterináriaS& K Pharma, GmbHKerato Biciron 5%,pomada oftálmica Augensalbe para prevenir o ressecamento dos olhos
de 10 mm

Referências

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