Summary
इस तकनीक प्रतिकृति - दोषपूर्ण रेट्रोवायरल एक मानव ओंकोजीन एन्कोडिंग शेयरों को तैयार करने के लिए एक कुशल तरीका दर्शाता है, और बाद में myeloproliferative रोग के माउस मॉडल में शामिल होने के लिए इस्तेमाल किया.
Abstract
हमारी प्रयोगशाला अध्ययन मानव myeloproliferative BCR-ABL या वृद्धि कारक रिसेप्टर व्युत्पन्न ओंकोजीन (ZNF198 FGFR1, BCR-PDGFRα, आदि) जैसे ओंकोजीन द्वारा प्रेरित रोगों. हम मॉडल और हमारे माउस मॉडल में मानव की तरह एक रोग का अध्ययन अस्थि मज्जा पहले ब्याज की ओंकोजीन व्यक्त retrovirus से संक्रमित कोशिकाओं की रोपाई कर रहे हैं. प्रतिकृति - दोषपूर्ण retrovirus एक मानव ओंकोजीन एन्कोडिंग और एक मार्कर (GFP, आरएफपी, एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन, आदि) एक क्षणिक अभिकर्मक 293T कोशिकाओं, एक मानव गुर्दे की उपकला कोशिका adenovirus E1A जीन उत्पाद से बदल लाइन का उपयोग प्रोटोकॉल द्वारा निर्मित है. 293 कोशिकाओं को अत्यधिक कैल्शियम फॉस्फेट (4 Capo) द्वारा transfectable किया जा रहा असामान्य संपत्ति है, 50-80% अभिकर्मक आसानी से प्राप्य दक्षता के साथ. यहाँ, हम एक रेट्रोवायरल वेक्टर ब्याज की ओंकोजीन और एक प्लाज्मिड कि ढकोसला नीति वातावरण पैकेजिंग काम करता है, जैसे जीनोम एकल पैकेजिंग इस मामले में कैट या PCL, constructs EcoPak प्लाज्मिड व्यक्त व्यक्त के साथ 293 कोशिकाओं transfect सह. प्रारंभिक अभिकर्मक आगे क्लोरोक्वीन के उपयोग द्वारा सुधार हुआ है. Ecotropic वायरस का स्टॉक, संस्कृति सतह पर तैरनेवाला 48 बजे के रूप में एकत्र. बाद अभिकर्मक -80 पर संग्रहीत किया जा सकता है ° C और परिवर्तन के दृश्य में और इन विट्रो अध्ययन में सेल लाइनों, या माउस अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के रूप में प्राथमिक कोशिकाओं, कि तब हमारे माउस मॉडल में प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया .
Protocol
- परिवर्तन, 3-5x10 कोशिकाओं 6 / 6 सेमी ऊतक cultureplate पर थाली 293T कोशिकाओं से पहले शाम.
नोट: हम अभिकर्मक और efficacyas वायरस कोशिकाओं के उत्पादन के अपने आसानी के लिए 293T कोशिकाओं का उपयोग करें . इन कोशिकाओं को वायरस पैकेजिंग में कमी कर रहे हैं जब तक एक प्लाज्मिड सहायक शुरू की है .
- पहली सुबह, धीरे मध्यम हटाने और 4 मिलीलीटर 293T सेल मेड 25 मिमी क्लोरोक्विन युक्त के साथ प्रतिस्थापित. इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए रखो.
नोट: थाली के बारे में 80% मिला हुआ होना चाहिए.
- इस बीच, 5 मिलीलीटर ट्यूबों में 2 प्लेटों के लिए एक समय में वायरस बनाने के मिश्रण तैयार करते हैं,
- 2 x 10 मिलीग्राम रेट्रोवायरल प्लाज्मिड का निर्माण
- 2 x 5 मिलीग्राम पैकेजिंग निर्माण (EcoPak)
- 2 एक्स 62 मिलीलीटर CaCl
- बाँझ DDH 2 हे के साथ 1 मिलीलीटर के लिए पूरा
नोट: हालांकि रेट्रोवायरल प्लाज्मिड ब्याज और एक मार्कर के ओंकोजीन encodes, EcoPak ढकोसला नीति वातावरण encodes. 293T कोशिकाओं के साथ साथ, वे एक ecotropic retrovirus (आर.वी.) माउस कोशिकाओं के लिए विशिष्ट मानव कोशिकाओं के लिए संक्रामक नहीं है, लेकिन उत्पादन होगा . दोनों क्लोरोक्विन और CaCl 2 अभिकर्मक दक्षता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है.
- 2x sterileHBS 1ml मिश्रण करने के लिए ड्रॉप - बुद्धिमान, जबकि धीरे ट्यूब vortexing में जोड़ें.
- तत्काल 2 प्लेटें, 1 मिलीलीटर प्रत्येक, धीरे इस समाधान जोड़ने के लिए, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप.
- इनक्यूबेटर में 7 से 11 बजे के लिए रखो.
- शाम (7 से 11 बजे के बाद.) में, धीरे मध्यम निकालने के लिए, और बहुत धीरे से 5 मिलीलीटर ताजा 293T मध्यम के साथ की जगह. दोपहर अगले दिन जब तक मशीन में रखो.
नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है, के रूप में आप के लिए रवाना कोशिकाओं से क्लोरोक्वीन लेने की जरूरत है . यदि समय की विस्तारित अवधि के लिए रखा, क्लोरोक्वीन विषैला होता है . प्लेटों में समाधान फजी लग रहा है, एक बहुत ही सुन्दर, अभिकर्मक मिश्रण की धूल की तरह तेज़ी की वजह से है .
नोट: यह महत्वपूर्ण है चरम नम्रता के साथ सभी मीडिया परिवर्तन करते हैं, कोशिकाओं के रूप में क्लोरोक्वीन द्वारा अवगत किया गया है, और आसानी से थाली से अलग कर सकते हैं.
- अगले दिन, 18 से 24 बजे. वायरस (दोपहर के आसपास) पुन: प्राप्त करने करने से पहले, धीरे मध्यम निकालने के लिए, और बहुत धीरे से 3 मिलीलीटर ताजा 293T मध्यम के साथ की जगह. इनक्यूबेटर ओ / एन में बदलें
- तीसरे सुबह (18 से 24 घंटे बाद.), धीरे से ऊपर एक 10 मिलीलीटर सिरिंज एक 18 जी सुई के साथ सज्जित के साथ मध्यम फार्म प्लेटें चूसना. इस सतह पर तैरनेवाला retrovirus है.
- एक 45 मिमी सिरिंज फिल्टर करने के लिए सुई बदलें, सिरिंज कई बार पलटना समाधान मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए, फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला गुजारें, और cryotubes में विभाज्य
नोट: वैकल्पिक रूप से, अगर आप एक 5 0 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 3 + वायरस, पूल एक ही वायरस के सभी supernatants की प्लेटें कर रहे हैं. अच्छी तरह मिक्स, तब विभाज्य फ़िल्टरिंग द्वारा cryotubes में retrovirus युक्त supernatants.
- वायरस भरा supernatants युक्त ट्यूबों -80 में रखा जाता है डिग्री सेल्सियस जब तक इस्तेमाल किया.
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Discussion
चार महत्वपूर्ण बिंदुओं एक अच्छा वायरल शेयर की सफलता को आश्वस्त करेगा:
- 293T उत्पादन कोशिकाओं के लिए बहुत ही स्वस्थ हो सकता है, जिसका अर्थ है वे एक बहुत ही नियमित रूप से समय पर विभाजित किया गया है, ऊंचा हो गया कभी नहीं थे, और 6 सेमी टिशू कल्चर प्लेट प्रति 3.5-5 लाख के अनुकूलित घनत्व पर चढ़ाया, ताकि वे एक घनत्व तक पहुँचने अभिकर्मक की सुबह पर थाली के 80% की.
- सेल lysozomes स्थिर और नाभिक तक पहुँचता है कि डीएनए के अंश में वृद्धि से 5 गुना, क्लोरोक्वीन के अलावा अभिकर्मक दक्षता और बाद में वायरस टिटर के बारे में 3 में सुधार. सोडियम butyrate (दूसरे lysosome स्टेबलाइजर) भी इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया गया है है. क्लोरोक्विन जो मामले मध्यम 7-11 बजे बदलने में लोप कर सकते हैं. इस बिंदु पर पोस्ट - अभिकर्मक की आवश्यकता नहीं है.
- डीएनए की गुणवत्ता बहुत महत्वपूर्ण है. दोनों वेक्टर और पैकेजिंग प्लाज्मिड DNAs की शुद्धि के पसंदीदा विधि CSCL ethidium ब्रोमाइड प्रसन्नचित्त घनत्व centrifugation द्वारा दो बार शुद्ध होता है. हम डीएनए की एकाग्रता के लिए कम से कम 1 मिलीग्राम / एमएल की तरह, और आयुध डिपो 260/280 अनुपात 1.75-1.90 के बीच होना चाहिए. Qiagen - शुद्ध डीएनए भी काम करते हैं, हालांकि, लेखकों के हाथों में, परिणाम के रूप में अच्छा नहीं कर रहे हैं. यह महत्वपूर्ण है कि डीएनए के समाधान के संयुक्त मात्रा छोटा (<50 अंतिम मिलीलीटर प्रति उल कुल) कैल्शियम फॉस्फेट वेग पर Tris और EDTA (ते) के प्रतिकूल प्रभाव से बचने के.
- पैकेजिंग निर्माण के रेट्रोवायरल वेक्टर और मेजबान रेंज के चुनाव महत्वपूर्ण हैं. Murine hematopoietic स्टेम सेल में स्थिर अभिव्यक्ति के लिए, एक myeloproliferative सार्कोमा वायरस पर आधारित सदिश पसंद है. एक आम वेक्टर रीढ़ मिग आरआई है, जिसमें एक लंबे टर्मिनल MPSV दोहराने अनुक्रम, एक ओंकोजीन की शुरूआत के लिए कई क्लोनिंग साइट, और एक बहाव के आंतरिक ribosome प्रविष्टि बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के लिए जीन से जुड़े साइट है. माउस HSC, वायरस के साथ पारगमन के लिए एक ecotropic मेजबान रेंज इष्टतम है, लेकिन इस तरह के स्टॉक शारीरिक तापमान पर अस्थिर कर रहे हैं और centrifugation द्वारा ध्यान केंद्रित नहीं कर सकते हैं.
कुछ बिंदुओं की जाँच करें: अगर वांछित है, एक बार काटा, 293 कोशिकाओं रेट्रोवायरल वेक्टर (जैसे, टी) द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जाँच करने immunoblotting के लिए प्रोटीन lysates बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम भी अलग थाली में अभिकर्मक (कोई पैकेजिंग वेक्टर जरूरत) के समय में एक LacZ एन्कोडिंग प्लाज्मिड नियंत्रण बीटा लड़की परख द्वारा अभिकर्मक efficinecy की जांच करने के लिए जब हम अन्य प्लेटों की सतह पर तैरनेवाला एकत्र का उपयोग करें. नोट: यह कोशिकाओं और अभिकर्मकों परीक्षण, लेकिन नहीं वायरस बनाने के लिए इस्तेमाल किया plasmids के गुणवत्ता.
किसी भी वायरस का उपयोग करने से पहले, टिटर तक निर्धारित किया है की जरूरत है. यह महत्वपूर्ण है अलग वायरस शेयरों की titers क्रम में ही प्रयोग में मैच के लिए, और hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के कुशल पारगमन सुनिश्चित है.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
||||
References
- DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).
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