Projeto Experimental de Laser Microdissecção RNA-Seq: Lições de uma análise do desenvolvimento foliar do milho

Resumo

Muitos genes importantes para o desenvolvimento têm padrões de expressão específicos de células ou tecidos. Este artigo descreve experimentos de LM RNA-seq para identificar genes que são diferencialmente expressos no limite lâmina da folha do milho e em mutantes lg1-R em comparação com o tipo selvagem. As considerações experimentais discutidas aqui se aplicam a análises transcriptômicas de outros fenômenos de desenvolvimento.

Resumo

Genes com funções importantes no desenvolvimento têm frequentemente padrões de expressão espacial e / ou temporalmente limitados. Muitas vezes, estes transcritos do gene não são detectados ou não são identificados como diferencialmente expressos (DE) em análises transcriptomic de órgãos vegetais inteiros. Laser Microdissecção RNA-Seq (LM RNA-Seq) é uma ferramenta poderosa para identificar genes que são DE em domínios específicos de desenvolvimento. No entanto, a escolha de domínios celulares para microdissect e comparar, e a precisão dos microdissecações são cruciais para o sucesso dos experimentos. Aqui, dois exemplos ilustram as considerações de design para experiências transcriptômica; LM uma análise de RNA-Seq para identificar genes que são dé ao longo do eixo proximal-distal folha de milho, e uma segunda experiência para identificar genes que estão em liguleless1 DE-R (LG1-R) mutantes em comparação com o tipo selvagem. Os principais elementos que contribuíram para o sucesso desses experimentos foram detalhados histológica e em siTU hibridação análises da região a ser analisada, selecção de primórdios foliares nas fases de desenvolvimento equivalentes, a utilização de pontos de referência morfológicas para seleccionar regiões de microdissecação, e microdissecação de domínios precisamente medidos. Este documento proporciona um protocolo detalhado para a análise de domínios de desenvolvimento por LM RNA-Seq. Os dados aqui apresentados ilustram como a região selecionada para microdissection irá afetar os resultados obtidos.

Introdução

A folha de milho é um modelo ideal para estudar a formação de campos de desenvolvimento durante a morfogénese, uma vez que tem uma fronteira distinta entre a lâmina e a bainha que é passível de dissecção genética (Figura 1A). Durante as fases iniciais do desenvolvimento foliar, uma faixa linear de células menores, a banda preligule (PLB), subdivide o primórdio foliar em domínios pré-lâmina e pré-bainha. A ligule franja-like e aurículas triangulares desenvolver a partir da PLB (Figura 1A, C, D). telas genéticas identificaram mutações que perturbam o limite lâmina de bainha. Por exemplo, liguleless....

Protocolo

NOTA: Fix tecidos para análise histológica, ao mesmo tempo que o tecido é fixado por LM. Examinar secções coradas para características morfológicas que guiarão depois LM. Ao comparar mutante com o tipo selvagem, efectuar hibridização in situ ou imunolocalização de definir o domínio em que o gene de interesse é expresso (neste caso LG1).

1. fixação do tecido e Processamento

1. Crescer apartamentos de plântulas de milho com duas semanas de idade, sob condições padrão ^6.
2. Dissecar ápices vegetativos para as secções laterais (Figura 4).
   1. mudas Excise logo abai....

Resultados

Usando o esquema LM delineado na Figura 2, a cerca de 1,000,000-1,500,000 mm ² de tecido foi recolhida para cada replicar no todo-cell-camadas LM (Figura 5), e 200.000 mm ² por replicar para a epiderme adaxial LM. Aproximadamente ² uM 2.500.000 de tecido foi colhido para cada replicar no LM de LG1-R e primórdios foliares de tipo selvagem. Duas rondas de amplificação de ARN lineares produziram quantidades de micro.......

Discussão

O delineamento experimental é um fator crítico em experimentos de RNA-seq. As principais considerações são o domínio preciso (s) e o estágio de desenvolvimento (s) a ser analisado, e será feito o que comparações. É fundamental pensar em termos de comparações, uma vez que a saída é normalmente uma lista de genes que são De entre duas ou mais condições. Tal como acontece com todas as experiências, é importante para alterar apenas uma variável de cada vez. Por exemplo, quando se comparam diferentes domínios da folha, das f.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220	Usado para tratamento RNase de soluções Lâminas de
barbear	Electron Microscopy Sciences	72000
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020-250ML	Solução de descontaminação RNase
Etanol absoluto 200 prova	Fisher Scientific	BP28184
Ácido acético, glacial	Frascos de vidro Sigma-Aldrich	A6283
- 22 ml	VWR	470206-384
Xilenos, grau histológico	Sigma-Aldrich	534056-4L
Paraplast plus	Sigma-Aldrich	P3683-1KG
Moldes de base descartáveis, 15 mm x 15 mm x 5 mm	VWR	15154-072
Anéis de incorporação	VWR	15154-303
Pacotes de gel de sílica	Microscopia eletrônica Ciências	71206-01	Dessecante para armazenamento de blocos de parafina
Forno	Fisher Scientific	15-103-0503	O forno deve manter a temperatura de 60 &graus; C
Estação de embutir parafina	Leica	EG1160
Micrótomo	Leica	RM2235
Aquecedor de slides	Microscopia Eletrônica Sciences	71317-10
Coplin frascos	Microscopia Eletrônica Sciences	70316-02
Microdissector a laser	Zeiss
KIMWIPES™ Limpadores de tarefas delicadas	Kimberly-Clark Professional	34120	Toalhetes sem fiapos para absorver o excesso de soluções de lâminas de microscópio Lâmina de membrana
1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000	Lâminas para microdissecção a laser
Tampa adesiva 200 opaco	Zeiss	415190-9181-000	Tubos para microdissecção a laser
Kit de isolamento de RNA PicoPure	ThermoFisher Scientific	KIT0204