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Artigo de método

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

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DOI:

10.3791/55015

⸱

30 de dezembro de 2016

 ,  ,  , 
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a geração reprodutível e fenotipagem de células T reguladoras humanas induzida (iTregs) a partir de células naive T CD4 + in vitro. Diferentes protocolos de indução de FOXP3 permitem o estudo de fenótipos específicos iTreg obtidos com os respectivos protocolos.

Resumo

As células T reguladoras (Tregs) são parte integrante da tolerância periférica, suprimindo reações imunes contra autoestruturas e, assim, prevenindo doenças autoimunes. Abordagens clínicas para transferir Tregs adotivamente, ou para esgotar Tregs no câncer, estão em andamento com primeiros resultados promissores.

Como o número de Tregs de ocorrência natural (nTregs) é muito limitado, estudar certas características de Treg usando Tregs induzidas in vitro (iTregs) pode ser vantajoso. Até o momento, o melhor, embora não absolutamente específico, marcador de proteína para delinear Tregs é o fator de transcrição FOXP3. Apesar da importância das Tregs incluírem papéis não redundantes das Tregs induzidas perifericamente, os protocolos para gerar iTregs são atualmente controversos, particularmente para células humanas. Este protocolo, portanto, descreve a diferenciação in vitro de iTregs CD4 + FOXP3 + humanos de células T virgens humanas usando uma variedade de fatores indutores de Treg (TGF-β mais IL-2 apenas, ou sua combinação com ácido retinóico, rapamicina ou butirato) em paralelo. Também descreve a fenotipagem dessas células por citometria de fluxo e qRT-PCR.

Esses protocolos resultam na expressão reprodutível de FOXP3 e outros genes de assinatura de Treg e permitem o estudo de mecanismos regulatórios gerais de FOXP3, bem como efeitos específicos do protocolo para delinear o impacto de certos fatores. Os iTregs podem ser utilizados para estudar vários aspectos fenotípicos, bem como mecanismos moleculares de indução de Treg. Estudos moleculares detalhados são facilitados por números de células relativamente grandes que podem ser obtidos.

Uma limitação para a aplicação de iTregs é a relativa instabilidade da expressão de FOXP3 nessas células em comparação com nTregs. As iTregs geradas por esses protocolos também podem ser usadas para ensaios funcionais, como o estudo de sua função supressora, na qual as iTregs induzidas por TGF-β mais ácido retinóico e rapamicina exibem atividade supressora superior. No entanto, a capacidade supressiva dos iTregs pode diferir dos nTregs e o uso de controles apropriados é crucial.

Introdução

As células T reguladoras CD25 + CD4 + FOXP3 + (Tregs) suprimir outras células do sistema imune e são mediadores críticos de tolerância periférica, prevenção da auto-imunidade e inflamação excessiva 1. A importância de Tregs é exemplificado pela doença humana síndrome immunodysregulation poliendocrinopatia enteropatia ligada ao X (IPEX), em que a perda de Tregs devido a mutações no `master' Treg factor de transcrição caixa de forkhead P3 (FOXP3) leva à doença auto-imune sistémica grave, letal em idade precoce. No entanto, Tregs agir como uma espada de dois gumes no sistema imunológico como eles também podem prejudicar a imunidade anti-tumor em determinadas configurações 2. manipulação terapêutica de número e função Treg é, portanto, sujeitas a inúmeras investigações clínicas. No câncer, esgotamento de Tregs pode ser desejável e algum sucesso de abordagens clínicas incentiva novas pesquisas 3. Em doenças auto-imunes e inflamatórias, além de efeitos terapêuticos de Tregs em Sevemodelos de doenças de rato RAL, recentes primeiros ensaios em-man de transferência de Treg adotiva para evitar enxertia versus doença -host (GVHD) 4-7 e para avaliar a segurança no tratamento de diabetes tipo 1 8 mostraram resultados muito promissores.

Que ocorre naturalmente Tregs (nTregs) compreendem tTregs derivado de timo e pTregs induzidas perifericamente, com funções essenciais não redundantes na manutenção da saúde 9-11. No entanto, os números nTreg são limitados, estimulando a abordagem complementar de induzir Tregs (iTregs) in vitro a partir de precursores de células T naive 12. Ainda estabilidade de iTregs, presumivelmente devido à falta de desmetilação na chamada região específica desmetilado Treg-(TSDR) no locus do gene FOXP3 13, continua a ser uma preocupação e vários estudos indicam que in vivo induzida Tregs são mais estáveis 14.

Até à data, FOXP3 continua a ser a melhor proteína marker para Tregs mas não é absolutamente específico, porque as células T CD4 + CD25- humanas transientemente convencionais expressar níveis intermediários de FOXP3 após activação 15,16. Embora o progresso significativo foi feito para elucidar a regulação da expressão de FOXP3, ainda há muito a ser descoberto sobre a indução, a estabilidade ea função do FOXP3 particularmente em células humanas. Apesar das diferenças para nTregs, in vitro induzida FOXP3 + células T CD4 + pode ser usado como um sistema modelo para estudar os mecanismos moleculares da indução FOXP3 e como um ponto de partida para desenvolver protocolos no futuro, que permitem a geração de iTregs que são mais semelhantes às de vivo gerado Tregs, que pode ser aplicável para as estratégias de transferência adoptivos no futuro.

Não há `protocolo standard' ouro para induzir iTregs humanos, e Current Protocols foram desenvolvidos com base em condições simulando Treg indutores in vivo: interleucina 2 (IL-2) E sinalização transformando β do factor de crescimento (TGF-β) são cruciais para a indução FOXP3 in vivo 17, e o ácido trans-retinóico (ATRA) - que é produzido in vivo por células dendríticas associados ao intestino - é frequentemente usado para melhorar a indução FOXP3 in vitro 18-21. Nós desenvolvemos protocolos Treg indutores humanos adicionais utilizando butirato de 22, um ácido gordo de cadeia curta da flora intestinal derivado que foi recentemente mostrado para aumentar murino Treg indução 23,24. Nós também estabeleceu recentemente um novo protocolo para a geração de iTregs com função supressora superior em vitro, usando uma combinação de TGF-β, ATRA e rapamicina 22, sendo este último um alvo de mamífero clinicamente aprovado de rapamicina (mTOR) inibidor que é conhecido por promover manutenção FOXP3 durante humana Treg expansão 25,26.

Este método descreve o reprodutível emgeração in vitro de células T CD4 + humanas FOXP3 + iTregs utilizando um conjunto de condições diferentes, e a sua fenotipagem subsequente por citometria de fluxo e a reacção inversa em cadeia da polimerase de transcrição quantitativo (qRT-PCR) para revelar os padrões específicos do protocolo de expressão de FOXP3 e outros assinatura moléculas Treg tais como CD25, CTLA-4, EOS, bem como a repressão do IFN-γ e expressão SATB1 22. As populações celulares geradas podem ser utilizadas para ensaios funcionais quanto à actividade supressora ou para estudos moleculares, quer se trate de reguladores gerais FOXP3 ou para estudar os efeitos específicos para determinados compostos, tais como o butirato ou rapamicina. Uma maior compreensão dos mecanismos moleculares de condução diferenciação Treg é altamente relevante para abordagens terapêuticas futuras em auto-imunidade ou câncer visarem especificamente moléculas envolvidas na geração e função Treg.

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Protocolo

As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram isoladas de fresco a partir de doadores saudáveis ​​anónimos de crostas inflamatórias comprados a partir do University Hospital Karolinska, Suécia. autorização de ética para os experimentos foi obtido a partir do Conselho Regional ética revisão em Estocolmo (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Suécia (número de aprovação: 2013 / 1458-1431 / 1).

1. t isolamento de células a partir de sangue periférico

  1. PBMC Isolamento
    1. Pré-lay 15 ml de meio de centrifugação de densidade de solução (tais como Ficoll) em tubos de 50 ml (5 tubos por buffy coat). Pré-aquecer à temperatura ambiente.
    2. Encha-se buffy coat com tampão fosfato salino (PBS) (temperatura ambiente) para 180 ml. Se o sangue fresco é usado, diluir o sangue com um volume igual de PBS.
    3. tubo de inclinação para o lado e meio de centrifugação de densidade lentamente sobreposição com ~ 35 ml diluídos no sangue por tubo. Adicionar o sangue com muito cuidado, sem qualquer mistura da centrifugação de densidade medfase ium e camada de sangue.
    4. Centrifugar 20 min a 1150 xg à temperatura ambiente sem travão. Operar a centrífuga sem travão e, se possível com baixa a aceleração forma a evitar a mistura das camadas.
    5. Retire o anel branco contendo PBMC entre o meio de centrifugação de densidade e a fase de plasma. Transferir para um novo tubo de 50 ml (1 vez com 5 ml de pipeta e 2 vezes com 2 ml em plástico-pipeta de Pasteur). Leve o mínimo possível de plasma e meio de centrifugação de densidade. Não toque no sedimento de eritrócitos vermelho.
    6. Wash PBMC. Dividir as PBMC em tubos de 50 ml (4 tubos por buffy coat). Encher cada para 50 ml com PBS.
    7. Centrifugar 450 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    8. Remover e descartar o sobrenadante, reunir as células em um tubo com 10 ml de meio / 10% de soro de vitelo fetal RPMI (FCS) e ressuspender bem. Se aglomerados de células estão presentes, as células de tensão através de um filtro de células 40 ^ m.
    9. Transferir as células em frascos de cultura de células T175 para o anúnciocélulas Herent. Lavar os tubos com 40 ml de meio e combinam com células (50 ml total). Se necessário, retire uma alíquota de citometria de fluxo (ver passo 1.4). Normalmente, células T CD4 + compreendem cerca de 30-40% das células na barreira linfocitária, e células T naive compreendem cerca de 30 a 60% de células T CD4 +, dependendo do dador.
    10. Incubar as células em que coloca balão durante 45 a 90 min a 37 ° C / 5% de CO 2. Esta etapa irá esgotar monócitos por aderência ao plástico. Não é obrigatório, mas irá aumentar o rendimento percentual de células T por quantidade de PBMC nos seguintes passos.
    11. Ressuspender as células (em 50 ml de meio contido no balão) e lavar a camada de células no fundo do frasco bem. Distribuir células igualmente em dois tubos de 50 ml (os tubos anteriores podem ser re-utilizados para o mesmo doador). Enxaguar o balão com 50 ml de meio fresco RPMI / FCS a 10%, e transferir os mesmos igualmente em 2 tubos.
      NOTA: As PBMC pode ser armazenado durante a noite a 4 ° C com os tubos, que nao lado, ou de preferência, utilizado directamente para o isolamento de células T.
  2. nTreg Isolamento classificando celular Magnetic-activado
    1. Preparar tampão de isolamento: 0,5% (w / v) de albumina de soro humano e EDTA 2 mM em PBS. Manter sempre tampão a 4 ° C. Como alternativa à albumina humana, albumina bovina usar.
    2. Ressuspender e contar PBMC com um contador de células automático ou manual na presença de azul de tripano (não contam pequenas plaquetas). Se aglomerados de células são observados, as células de tensão através de um filtro de células 40 ^ m.
    3. PBMC centrifugar a 450 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    4. Ressuspender as células (com uma pipeta ml) em tampão de isolamento de 90 ul por 10 7 PBMC para se obter uma suspensão de célula única. Manter as células no original tubos de 50 ml (2 tubos por buffy coat).
    5. Adicionar 2 mL CD25 grânulos por 10 7 células, mistura, e incubar durante 15 min a 4 ° C.
    6. Encha com PBS a 30 ml. Centrifugar a 450 xg durante 10 min a 46; C.
    7. Prepare colunas LS (2 por buffy coat): equilibrar com 3 ml de tampão de isolamento, e descartar fluir. Os tubos podem ser re-utilizados para enxaguar mais colunas.
    8. Ressuspender as células em 3 ml de tampão de isolamento (por tubo com uma pipeta ml). Transferência de células para LS coluna e recolher fluxo através de frescos tubos de 15 ml.
    9. Lavar os tubos de 50 ml com 2 ml de tampão de isolamento cada. Transferência de tampão de lavagem para as colunas.
    10. Lavar 2x coluna com 3 ml de tampão de isolamento cada. Sempre espere até que a coluna parou de pingar, antes de adicionar qualquer novo líquido. Loja fluir através a 4 ° C durante as etapas posteriores.
    11. Remover coluna de ímã. Eluir com 2 x 3 ml de tampão de isolamento por coluna em tubo de 15 ml.
      NOTA: O eluato a partir de 2 colunas por doador podem ser combinados. Não mergulhar a coluna para dentro do líquido.
    12. Preparar e equilibrar novas colunas LS (1 coluna por buffy coat). Transferir o eluato de 1.2.11 à coluna. O fluxo através podem ser descartados. Depois de fluido tem passed através da coluna, enxaguar e lavar 3x tubo coluna com 3 ml de tampão de isolamento.
      NOTA: A segunda coluna é crucialmente necessário para aumentar a pureza.
    13. Remover coluna de ímã. Eluir CD25 ++ "nTregs" 2x com 3 ml de tampão de isolamento.
    14. Centrifuga-se a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante completamente.
    15. Lavar as células com meio de cultura de células T de 15 ml, centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante completamente.
    16. Ressuspender as células em meio de cultura de células T 0,5 ml, suplementado com 100 UI / ml de IL-2, cada um. Transferência de células para placa de 24 poços. tubo de enxaguamento com 0,5 mL de meio (+ 100 UI / ml de IL-2) e combinar em placa de 24 poços.
    17. Contagem nTregs (como no passo 1.2.2). O rendimento é geralmente cerca de 1-4 x 10 6 Tregs por buffy coat. Ajustar a densidade de Tregs a 1-2 x 10 6 culas / ml com meio de cultura de células T + 100 UI / ml de IL-2.
    18. Incubar Tregs a 37 ° C / 5% de CO 2 até à sua utilização.
  3. Naïve CD4 + T isolamento de células, classificando celular Magnetic-activado
    NOTA: Tome fluir através do passo 1.2.8-1.2.10 para prosseguir com o isolamento de células. Em alternativa, se não nTregs foram isolados, proceder diretamente de PBMCs.
    1. Combinar 2 tubos por doador de PBMC Treg-empobrecido em 50 ml tubo. Encha com PBS a 50 ml à temperatura ambiente.
    2. PBMC centrifugar a 200 xg durante 5-10 min à temperatura ambiente. Retire e elimine o sobrenadante. Ressuspender as células em 50 ml de PBS.
    3. Repita o passo 1.3.2 duas vezes.
      NOTA: As lavagens de PBS são cruciais para remoção das plaquetas, o que não será removida com o kit de isolamento de sequência negativa. As plaquetas permanecem no sobrenadante desta centrifugação a baixa velocidade. depleção de plaquetas pode ser monitorada nas etapas individuais sobre uma lâmina de microscópio. Os passos têm de ser realizados com PBS e centrifugação à temperatura ambiente.
    4. Ressuspender as CMSPs em 50 ml de PBS. Contagem de células como no passo 1.2.2.
    5. PBMC centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em 40 ul de tampão de isolamento (4 ° C) por 10 7 células.
    6. Adicionar 10 ml de Naïve CD4 + T celular Biotina-Antibody Cocktail II por 10 7 células.
    7. Mistura, e incubar durante 10 min a 4 ° C.
    8. Lave as células por adição de 40 ml de PBS (4 ° C), e centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover as células e ressuspender em sobrenadante de tampão de isolamento de 80 ul por 10 7 células.
    9. Adicionar 20 ul de microesferas anti-biotina por 10 7 células. Misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C.
    10. Encha até 50 ml com PBS frio, e centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C.
    11. Prepare colunas LS (equilibrar com 3 ml de tampão de isolamento). Para evitar a sobrecarga da coluna, utilizar uma coluna para maximamente 250 x 10 6 PBMC, ou menos, se as CMSPs conter muitas células vermelhas do sangue.
    12. Remover o sobrenadante e ressuspender cells em tampão 3 ml de isolamento. Transferência de células para a coluna LS. Recolhe fluxo através, que contém as células T CD4 + naive, em tubos de 15 ml.
    13. Lave com tampão de isolamento tubo 2 ml. Transferir para a coluna.
    14. 3x Lavar a coluna com 3 ml de tampão de isolamento. Sempre espere até que a coluna pára gotejamento, antes de adicionar qualquer novo líquido.
    15. Aqui o fluxo através da CD4 + (células T naive) e centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. As colunas podem ser descartados.
    16. Remover o sobrenadante completamente. Lavar as células com 15 ml de meio, centrífuga de 450 xg durante 10 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante completamente.
      NOTA: tampão de isolamento contém EDTA, que quela os iões de cálcio e assim prejudica a activação das células T. Antes de quaisquer ensaios de estimulação, remova o tampão de isolamento completamente e lavar as células duas vezes com 15 ml de meio.
    17. Ressuspender as células em meio de cultura de células T a 2-3 x 10 6 culas por ml. células de descanso em frasco adequado oR assim durante a noite na incubadora. Se as células são usados ​​diretamente para ensaios de estimulação, lavá-los mais uma vez com meio.
  4. Pureza Controle Coloração
    1. Take ~ 50.000 células (Tnaïve; nTreg; PBMC) cada, em 20 ul.
      NOTA: Se ambos Tnaïve e painel de nTreg devem ser manchado, tomar 2 amostras de cada um.
    2. Prepare 2x pré-mistura concentrada de anticorpo (em PBS) como apropriado para o instrumento, por exemplo: o painel Tnaïve: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 01:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. Para o painel Treg, substitua CD45RO-PE com CD25-PE, 1:10.
      NOTA: Somente determinados anticorpos CD25, que reconhecem epitopos diferentes do que as CD25-microesferas, podem ser usados ​​para corar nTregs isolados com micropérolas CD25.
    3. Adicionar 20 ul de pré-mistura de anticorpos para células 20 ul. Também preparar colorações individuais para cada fluorocromo (utilizando uma amostra contendo células positivas, por exemplo, PBMCs) e uma amostra não corado, por citometria de fluxo Definiçõesgs e compensação.
    4. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
    5. Encher cada amostra com 200 ul de PBS, e centrifugar a 450 xg durante 5-10 min.
    6. Tome-se células em células activadas por fluorescência (FACS) tampão (= tampão de isolamento, sem EDTA) e analisar por citometria de fluxo. A pureza das células CD4 + T naive é normalmente> 95% (ver Figura 2).

2. Treg de cultura de indução

  1. Preparação de Estimulação Mídia e Placas
    1. Preparar e meio de cultura de células T pré-aquecido: hematopoiético médio livre de soro suplementado com 2 mM de L-alanil-L-glutamina.
    2. Prepare citocinas, anticorpos e a estimulação concentrações banco de compostos.
      1. Preparar a solução de estoque de IL-2: 400.000 Ul / ml em ácido acético esterilizada por filtração (com filtro resistente ao ácido) de 100 mm (167 ug / ml, se a actividade do lote utilizado é de 2.400 UI por 1 ug; confirmar com fornecedor). Alíquota para esterilizado vinculativo 0,5 ml tubos de baixa proteína, selar com Parafilm, congelar em gelo seco e armazenar a -80 ° C para armazenamento a longo prazo ou a -20 ° C por até 3 meses.
      2. Preparar a solução de estoque de TGF-β1 (para 10 ug frasco, isento de transportador): Centrífuga TGF-β1 pó (1.000 xg, 3 minutos), adicionar 100 mL de HCl 4 mM (esterilizado por filtração com um filtro resistente ao ácido) para preparar a solução estoque com 100 ug / ml, permitir que se dissolva completamente; vórtice. Alíquota de 5 ul cada para esterilizado vinculativo 0,5 ml tubos de baixa proteína, selar com Parafilm, congelar em gelo seco e armazenar a -80 ° C por até 6 meses.
      3. Preparar a solução de estoque de ATRA: Dissolve-se o pó em 20 mg / ml (66,6 mM) em DMSO. Preparar a solução de estoque de 10 mM, por diluição adicional em aliquotas de DMSO e armazenam, protegida da luz, à temperatura de -80 ° C durante até 1 ano. ATRA é sensível à luz, calor e ar.
      4. Preparar a solução da rapamicina: 1 mg / ml (1,11 mM) em DMSO, armazenam-se em aliquotas a -80 ° C duranteaté 1 ano.
      5. Preparar a solução estoque butirato de sódio: H (ml 0,1 mg /) 0,908 estoque em ultra-pura esterilizada H2O e filtro estéril. Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
    3. Preparar 4x pré-misturas concentradas (50 uL por poço) em meio de cultura de células T como na Tabela 1.
    4. No dia anterior, as placas de revestimento com anticorpo anti-CD3. Revestimento desejado número de poços de placa de 96 poços L com 5 ug / ml de anticorpo anti-CD3, em PBS, 65 ul / poço. Enrole placa com papel alumínio e incubar durante a noite a 4 ° C.
      NOTA: Não use os poços de margem de placas de 96 poços. podem ser utilizados poços maiores, mas poços em forma de U facilitar o uso dos mesmos números de celulares por área através experimentos. Se forem necessários mais células, piscina a quantidade necessária de poços após o cultivo. Geralmente, após 4-6 dias de expansão, 2 poços de cada amostra são suficientes para análise de citometria de fluxo e análise de ARN.
      1. No dia do plaqueamento, pouco antes do plaqueamento, remover anti-CD3 solução de poços. Encher os poços com 200 ul / cavidade de PBS. Remover PBS. Repetir a lavagem com 200 ul / cavidade de PBS. Remover completamente PBS e utilizar placas imediatamente.
    5. Prepare placas (não use poços de margem):
      1. Para cada cavidade, adicionar 50 ul de 4x anti-CD28 / IL-2 de pré-mistura (excepto para as células "não estimuladas", adicionar meio de T de cultura de células), 50 ul 4x TGF-β1 pré-mistura (para todos os iTregs) ou cultura de células T 50 ul meio para "a estimulação apenas" controle simulada, 50 ul 4x ATRA, ATRA / rapamicina ou premix butirato (quando aplicável) ou médio
      2. Encher todos os poços vazios, incluindo os poços de margem, com 200 mL PBS. Placas pré-aquecer a 37 ° C / 5% de CO 2.
  2. Prepare células naive T para Galvanização
    1. Depois de células em repouso, transferir para tubo de 15 ml, lavar frascos / poços com meio de cultura de células pré-aquecido T e piscina para tubo. Encha tubo para 15 ml com meio de cultura de células T.
    2. células centrifugar a 450 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    3. Remover o meio e tomar-se as células em meio fresco, pré-aquecido de cultura de células T a uma densidade de 2,2-2,6 x 10 6 / ml. Contagem de células como no passo 1.2.2 e ajustar a densidade, se necessário.
    4. Adicionar células a placas de estimulação preparadas (ver 2.1), células 50 ^ l / cavidade (110,000-130,000 células / poço). Cada poço deverá conter um volume total de 200 ul.
    5. Enrole placas em folha de alumínio para proteger ATRA da luz; incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante períodos de tempo desejados.
  3. Monitorar Treg Cultura Indução
    1. Monitorar Treg culturas por microscopia de luz (40X). De volta do dia 2 a 3, pequenos aglomerados de células em proliferação devem tornar-se visível, que se fundem em aglomerados maiores em momentos posteriores. Culturas cultivadas com rapamicina geralmente crescem menos. Ver também a Figura 3.
    2. Em pontos de tempo desejados, colher amostras para RNA eXtraction ou citometria de fluxo fenotipagem (ver abaixo). Para pontos de tempo posteriores, com a proliferação de células, uma de cada poço é suficiente, de outro modo, de 1 x 10 5 x 10 -1 6 células para cada RNA e 3 x 10 5 x 10 -1 6 células por citometria de fluxo.
  4. Avaliando FOXP3 Estabilidade
    1. Para avaliar a estabilidade do fenótipo iTreg como descrito anteriormente 22,27, lavar iTregs duas vezes com meio de cultura de células T, e outras iTregs cultura em meio de cultura de células T, sem ou com anti-CD3 e anti-CD28 re-estimulação, como descrito em 2.1 e 2.2 . Adicionar citocinas, tal como 50 UI / ml de IL-2, para estudar a sua influência na estabilidade FOXP3.
    2. Em pontos de tempo desejado, para tomar amostras de extracção de ARN, a citometria de fluxo fenotipagem (ver abaixo), e análise de metilação, tal como descrito TSDR 22,28.

3. Análise fenotípica de iTregs por qRT-PCR

  1. Preparação deamostras
    1. Em pontos de tempo desejados, tome 1 x 10 5 a 1 x 10 6 células por amostra para extração de RNA. Transferir as células para um tubo de 1,5 ml de RNase isenta de, e centrifugar a 500 xg durante 5 min.
    2. Se necessário, remover parte do sobrenadante e congelar para o ensaio ligado a enzima (ELISA) ou análise similar. Remover completamente restante sobrenadante a partir de células. Vá diretamente para a extração de RNA ou congelar pellet celular em gelo seco e armazenar a -20 ° C a -80 ° C por até 2 semanas.
    3. Extrair o RNA e executar qRT-PCR para FOXP3 e um gene de manutenção (como RPL13A) de acordo com protocolos padrão. Além disso, medir a expressão de outros genes assinatura Treg (por exemplo `Treg up' genes IL2RA, CTLA4, IKZF4, e` Treg down' genes IFNg, SATB1).

4. A análise fenotípica por citometria de fluxo

NOTA: Este protocolo é otimizado para manchaing em formato de placa de 96U com 3 x 10 5 x 10 -1 6 células. Se houver menos células por poço, começar com vários poços e piscina, tal como descrito abaixo.

  1. Re-estimulação celular (Opcional)
    1. Se a coloração de citocinas intracelulares for desejado, as células pulsadas com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) / Ionomicina na presença de um inibidor de transporte de proteínas.
      NOTA: Este procedimento não influenciar a expressão FOXP3 em culturas iTreg acima descritos, mas outros marcadores podem mudar - por exemplo, CD4 é regulada negativamente.
    2. Prepare 10x Brefeldina A / PMA / ionomicina de pré-mistura (20 ul por cavidade) em meio de cultura de células T: Brefeldina A solução-mãe 1: 100, Ionomicina (stock 5 mg / mL) 1: 1300, PMA (estoque 12,35 mg / mL, pré -dilute 1: 1235) 1: 100 de estoque pré-diluído.
    3. 4 horas antes da coloração, adicionar 20 ul de Brefeldina A / PMA / ionomicina 10x mistura por poço para obter concentrações finais de 1: 1000 Brefeldina A, 0,5 μH (375 ng / ml) Ionomicina, 10 ng / ml de PMA.
    4. Incuba-se durante 4 horas a 37 ° C / 5% de CO 2
  2. coloração da superfície
    NOTA: O painel sugeriu aqui é uma sugestão; outros painéis podem ser usados ​​dependendo das antígenos de interesse e configuração do instrumento.
    1. Arrefecer PBS em gelo. Prepare tampão FACS (PBS com albumina 0,5% de soro humano, HSA) e fresco no gelo. BSA ou FBS pode ser usado como uma alternativa à ASH.
    2. células re-placa em placa de coloração: Ressuspender as células com uma pipeta e transferir as células em uma nova placa de 96U, deixando um poço livre em torno de cada poço (para evitar transbordamento no processo de coloração mais tarde). Se menos do que o número de células desejadas estão presentes no poço original, remover parte do sobrenadante antes de ressuspensão, e piscina várias cavidades em uma coloração bem.
    3. Centrifugar placa 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    4. Remover o sobrenadante. Derrama o sobrenadante para caixa de resíduos, deixe a placa de cabeçapara baixo e imediatamente (sem olhar para trás a placa) bata a placa uma vez com um papel absorvente. Então, imediatamente voltar o prato. placa Vortex para voltar a suspender as células no líquido restante.
    5. Adicionar 25 ul de pré-mistura a coloração da superfície (CD25-PE 01:20, CD4-PerCP 1: 5 em tampão de FACS) e ressuspender.
      NOTA: Também incluem colorações individuais para cada um dos fluorocromos utilizados com amostras que contêm células positivas para o antigénio respectivo; e incluir uma amostra imaculada. Estes serão necessários para a configuração de compensação de instrumento. Como alternativa, use esferas de compensação.
    6. Incubar 30 min a 4 ° C no escuro.
    7. Adicionar 200 ul de PBS, a placa de centrífuga de 400 xg durante 10 min a 4 ° C e remover o sobrenadante tal como descrito no passo 4.2.4. placa Vortex.
    8. Repita o passo 4.2.7 duas vezes.
  3. a coloração de viabilidade
    NOTA: coloração de Viabilidade é indispensável, uma vez que após a fixação / permeabilização células mortas não pode ser suficientemente excluída porFSC / SSC e pode dar origem a sinais inespecíficos. Um corante de viabilidade fixável tem de ser usado.
    1. Ressuspender as células em 130 ul mancha viabilidade premix (viabilidade solucionáveis ​​dye-eFlour780 1: 1.400 em PBS) e as células imediatamente ressuspender com a pipeta multicanal.
      NOTA: incluem também uma única coloração para o corante de viabilidade contendo células mortas, por exemplo, células T não estimuladas cultivadas durante vários dias ou matar as células por aplicação de calor como por instruções dos fabricantes. Estes serão necessários para a compensação.
    2. Incubar 30 min a 4 ° C no escuro.
    3. placa Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante do passo 4.2.4. placa Vortex.
    4. Encha com 200 ul de tampão FACS. Repita o passo 4.3.3.
    5. Encha com 200 mL PBS. Repita o passo 4.3.3.
  4. A coloração intracelular com FOXP3 Coloração do Buffer Set
    1. Para cada bem, preparar: 150 ul Fix tampão / Perm (diluir Fix / Perm concentrate 1: 4 com diluente); 850 ul de tampão de permeabilização 1x (10x tampão de permeabilização diluir 1:10 com ultra-pura H2O).
    2. Depois de vórtex, Ressuspender as células em 150 ul Fix tampão / Perm e imediatamente ressuspender com pipeta. É importante para ressuspender imediatamente para evitar a fixação de aglomerados de células.
      Cuidado: tampão Fixation contém paraformaldeído e deve ser manuseado e descartado de forma adequada.
    3. Incubar 30 min a 4 ° C no escuro.
    4. Adicionar 100 ul de PBS frio. Centrifuga-se a 850 xg durante 10 min a 4 ° C.
      NOTA: A partir deste passo em diante, a velocidade de centrifugação é aumentada para evitar a perda de células. Após a fixação, as células tornam-se invisível e deve ser tomado cuidado para remover o sobrenadante tal como descrito no passo 4.2.4 e imediatamente após a centrifugação é acabado para minimizar a perda de células.
    5. Remover o sobrenadante tal como descrito no passo 4.2.4. placa Vortex.
      NOTA: A coloração pode ser interrompido a esta etapa; dentroNeste caso, lavar as células duas vezes com 200 ul de PBS; em seguida, tomar-se em 250 ul de PBS e armazenar a 4 ° C, protegidos da luz. As células podem ser armazenadas durante alguns dias, em seguida, efectuar a permeabilização. No entanto, os melhores resultados são alcançados quando prosseguiu directamente para a permeabilização.
    6. Após agitação em vórtex, adicionar 200 ul de tampão de permeabilização. Centrifuga-se a 850 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante tal como descrito no passo 4.2.4. placa Vortex.
    7. Adicionar 200 tampão permeabilização ul para voltar a suspender.
      NOTA: Aqui, as amostras podem ser divididas em coloração intracelular e amostra de controlo de isotipo (tirar metade de cada amostra). Se o número de células são limitantes, uma amostra isótipo agrupada pode ser preparado (tirar 10-20 ul de cada amostra e piscina). Além disso, as amostras podem ser tomadas para fluorescência-menos-um controles (FMO).
    8. Centrifuga-se a 850 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante tal como descrito no passo 4.2.4. placa Vortex.
    9. Ressuspender em pelete44 ul de tampão de permeabilização mais 1 ul de soro normal de ratinho (pré-misturado) para bloquear a ligação inespecífica.
      NOTA: Isto aplica-se se os anticorpos usados ​​no passo seguinte são de isótipo murino. Se forem utilizados outros anticorpos, tais como derivados de rato,, incluem o soro apropriado para o bloqueio (por exemplo, soro de rato).
    10. Incubar a 4 ° C durante 15 min no escuro.
    11. Adicionar anticorpos:
      NOTA: Informe-se as concentrações de anticorpos para os lotes específicos. Se não for feito no passo 4.2 com anticorpos contra antigénios de superfície (por exemplo, CD4) com as respectivas fluorocromos, também incluem colorações individuais para cada um dos fluorocromos utilizados com amostras que contêm células positivas para compensação.
      1. Adicionar 15 ul de pré-mistura de anticorpo para as amostras (excepto para colorações individuais, as amostras não coradas, as amostras de controlo de isotipo e os controlos FMO): pré-mistura por amostra: 0,7 ul (0,35 ug) anti-interferão gama (IFN-γ) -FITC (se for o caso, após a re-estimulação ),2,3 ul (0,115 mg) de CTLA-4 Brilhante Violeta 421, 2 ul (0,05 ug) Anti-FOXP3-APC, 10 ul de PBS.
      2. Para isotipo amostras de controlo, adicionar 15 ul de pré-mistura de anticorpo de isotipo, usando as mesmas quantidades de anticorpos como para os anticorpos utilizados em 4.4.11.1: pré-mistura por amostra: 0,7 ul (0,35 ug) com FITC de rato de controlo de isotipo de IgG1 K (se aplicável), 0,58 ul (0,115 g) de IgG2a de ratinho de isotipo-BV421, 0,5 ul (0,05 ug) APC IgG1 de ratinho de controlo de isotipo K, 13,2 ul de PBS.
      3. No controlo da FMO, adicione anticorpos como no 4.4.11.1, substituindo um anticorpo cada um com PBS.
    12. Incubar a 4 ° C durante 30 min no escuro.
    13. Adicionar 200 ul de tampão de permeabilização. Centrífuga, remover o sobrenadante e vortex como no passo 4.4.8. Repetir uma vez.
    14. Ressuspender as células em tampão FACS frio (volume de acordo com o instrumento usado) e adquirem, de preferência imediatamente, no citómetro de fluxo.

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Resultados

A Figura 1 mostra um esquema da montagem experimental. A Figura 2 mostra uma coloração controle de pureza representante para as células T CD4 + naïve magneticamente isoladas e nTregs.

F igura 3A mostra a citometria de fluxo estratégia de propagação e Figura 3B mostra FOXP3 representativa e CD25 citometria de fluxo colorações no dia 6 da cultura nas ...

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Discussão

O protocolo descrito permite a indução de CD4 humano robusta + FOXP3 + iTregs a partir de células T CD4 + naive humanas. Ele inclui um novo protocolo que descrevemos recentemente, usando uma combinação de TGF-β, ATRA e rapamicina, para a indução de iTregs com superiores in vitro a função supressora 22. Em comparação com outros protocolos publicados, outra vantagem é a indução de diferentes populações iTreg em paralelo por diferentes protocolos, o que permite a comparação directa dos efeito...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Nina Nagel é grata pela assistência técnica durante a gravação do vídeo e preparação experimental. Agradecemos a Eva-Maria Weiss pela ajuda com o protocolo de coloração intracelular FOXP3 e a Elisabeth Suri-Payer e Nina Oberle por estabelecer o protocolo de isolamento nTreg. Matilda Eriksson e Peri Noori são reconhecidas pela gestão laboratorial.

Financiamento: A.S. foi apoiado por uma bolsa Marie Curie Intra European no âmbito do 7º Programa-Quadro da Comunidade Europeia, da Fundação Dr. Åke Olsson e das fundações de pesquisa KI; A.S. e J.T. foram apoiados por uma bolsa CERIC (Centro de Excelência para Pesquisa em Inflamação e Doenças Cardiovasculares), J.T. foi apoiado por Vetenskapsrådet Medicina e Saúde (Dnr 2011-3264), Fundação Torsten Söderberg, FP7 STATegra, AFA Insurance e Conselho do Condado de Estocolmo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido retinóico totalmente transSigma AldrichR2625-50MG   
anit-humano Foxp3-APC clone 236A/E7eBioscience17-4777-42
microesferas anti-CD25 humanasMiltenyi Biotec130-092-983
anti-humano CD25-PEMiltenyi Biotec130-091-024
anti-humano CD28 anticorpo, LEAF Purified Biolegend302914
anticorpo CD3 humano, purificado por LEAF Biolegend317315
CD45RA anti-humano, FITCMiltenyi Biotec130-092-247
clone PE CD45RO anti-humano UCHL1BD Biosciences555493
clone anti-CD4-PerCP humano SK3; mIgG1BD Biosciences345770
anti-CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2aeBioscience48-0086-42 
anti-humano CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, violeta brilhante 421BD Biosciences562743 clone
anti-humano IFN-g FITC 4S. B3; mIgG1keBioscience11-7319-81 
Solução contendo Brefeldin A: GolgiPlugBD Biosciences555029
kit de síntese de cDNA: SuperScript VILO(transcriptase reversa) Kit de síntese de cDNAInvitrogen11754-250
Meio de centrifugação de densidade: Ficoll-PaqueGE healthcare17-1440-03
DMSO 99,7%Sigma AldrichD2650-5X5ML
FBS, Invitrogen10082-147
Corante de Viabilidade Fixável Inativado por Calor, eFluor 780   eBioscience65-0865-14 ou 65-0865-18 
Conjunto de tampão de coloração Foxp3eBioscience00-5523-00Cuidado: contém paraformaldeído. Também pode ser comprado em kit combinado com anticorpos; 77-5774-40 Conjunto de coloração anti-humana Foxp3 Clone APC: 236A/E7 Conjunto
GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutamina)Invitrogen35050-061
kit de isolamento de células T CD4 virgens humanas IIMiltenyi Biotec130-094-131
Albumina sérica humana 50 g/LBaxter1501057
Ionomicina de Streptomyces conglobatus >98%Sigma AldrichI9657-1MG
Colunas MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401
mouse IgG1 K Controle de Isotipo APC Clone: P3.6.2.8.1eBioscience17-4714-42
mouse IgG1 K Controle de Isotipo FITC 50 μ geBioscience11-4714-81 
controle de isotipo IgG2a de camundongo, violeta brilhante 421, clone MOPC-173BD Biosciences563464
plástico pipetado Pasteur, embalado individualmenteSarstedt86.1172.001   
PMA Phorbol 12-miristato 13-acetatoSigma AldrichP1585-1MG 
RapamicinaEMD (Merck)553210-100UG
IL-2 humana recombinante, CFR & D202-IL-050/CF
Humano Recombinante TGF-beta 1, CFRnD240-B-010/CF
Kit de isolamento de RNA: RNAqueous-Micro KitAmbionAM1931   
RPMI 1640 Médio Invitrogen72400-054 
Butirato de sódioSigma AldrichB5887-250MG 
Meio de cultura de células T: meio X-Vivo 15, com gentamicina+fenolvermelhoTaqMan Lonza04-418Q
, FOXP3 (Melhor Cobertura) do ensaio 4331182;Applied BiosystemsCuidado: contém paraformaldeído
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Melhor Cobertura)Applied Biosystems4351370; ID do ensaio: Hs04194366_g1   Cuidado: contém paraformaldeído
Mistura mestre de expressão gênica TaqMan 4369514Applied Biosystems
Ensaio de Expressão Gênica ID da : Hs01085834_m1

Referências

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