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Imagens ao vivo para estudar microtúbulos instabilidade dinâmica em cancros da mama resistentes a taxano

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DOI:

10.3791/55027

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20 de fevereiro de 2017

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, Signal Transduction Research Group, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

Neste artigo

Resumo

Neste artigo, relatamos um protocolo que descreve um método in vivo para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células de câncer de mama resistentes ao docetaxel (MCF-7TXT). Neste método, um sistema de imagem de microscopia de deconvolução é usado para detectar a expressão de GFP-tubulina em células-alvo.

Resumo

Taxanos como o docetaxel pertencem a um grupo de agentes direcionados aos microtúbulos (MTAs) que são comumente usados para tratar o câncer. No entanto, a resistência ao taxano em células cancerígenas reduz drasticamente a eficácia do uso a longo prazo dos medicamentos. Evidências acumuladas sugerem que os mecanismos subjacentes à resistência ao taxano incluem mecanismos gerais, como o desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas devido à superexpressão de proteínas de efluxo de drogas, e mecanismos específicos de taxano, como aqueles que envolvem a dinâmica dos microtúbulos.

Como os taxanos têm como alvo os microtúbulos celulares, medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos é uma etapa importante na determinação dos mecanismos de resistência ao taxano e fornece informações sobre como superar essa resistência. No experimento, um método in vivo foi usado para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos. A α-tubulina marcada com GFP foi expressa e incorporada em microtúbulos em células MCF-7, permitindo o registro da dinâmica dos microtúbulos por lapso de tempo usando uma câmera sensível. Os resultados mostraram que, ao contrário das célulasMCF-7 CC parentais não resistentes, a dinâmica dos microtúbulos das célulasMCF-7 TXT resistentes ao docetaxel é insensível ao tratamento com docetaxel, o que causa a resistência à parada mitótica e apoptose induzida pelo docetaxel. Este artigo descreverá este método in vivo de medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos.

Introdução

A principal causa de mortalidade por câncer de mama é através de metástases 1, 2. Os taxanos, como o docetaxel e o paclitaxel, são actualmente utilizados como esquemas de primeira linha para o tratamento de cancro da mama metastático 2, 3, 4, 5, 6. Eles fazem parte de um grupo de agentes de metas de microtúbulos (MTA) que interrompem a dinâmica dos microtúbulos. No entanto, um dos maiores desafios para a utilização em terapia curativa taxanos é o desenvolvimento de resistência taxano em células de cancro, o que leva à recorrência da doença sete. A resistência às drogas é responsável por mais de 90% de todas as mortes entre os pacientes com câncer de mama metastático 7.

Os microtúbulos são formados pela polimerização de heterodímeros a- e p-tubulinaclass = "xref"> 8, 9. A regulação exacta da dinâmica dos microtúbulos é importante para muitas funções celulares, incluindo a célula de polarização, progressão do ciclo celular, o transporte intracelular e a sinalização celular. Desregulação dos microtúbulos e sua dinâmica irá interromper a função das células e resultar em morte celular 10, 11. Dependendo de como eles causam esta desregulação, drogas MTA pode ser classificada quer como agentes de estabilização de microtúbulos (isto é, taxanos) ou agentes de microtúbulos-destabalizing (isto é, alcalóides vinca, colchicina ou local agentes de ligação) 20. Apesar dos seus efeitos opostos sobre a massa de microtúbulos, numa dosagem suficiente, ambas as classes podem matar as células cancerosas através dos seus efeitos sobre a dinâmica dos microtúbulos 21.

Os taxanos funcionar primariamente por estabilização de microtúbulos do fuso 12, levando adesalinhamento cromossómico. A subsequente activação perpétua do checkpoint de montagem do fuso (SAC) prende a célula na mitose. Paragem da mitose prolongado, em seguida, faz com que a apoptose 13, 14. Taxano interage com os microtúbulos através do sítio de ligação taxano em β-tubulina 8, 15, que só está presente no tubulina montados 16.

Vários mecanismos de resistência de taxano têm sido propostos 9, 17. Estes mecanismos incluem tanto a resistência a múltiplas drogas em geral, devido à sobre-expressão de proteínas e de resistência 5, 9, 18, 19 específicos de taxano de droga-efluxo. Por exemplo, as células cancerosas resistentes a taxano podem ter alterado a expressão e função de certos β-banheiraUlin isotipos 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Ao usar um método in vivo para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos, mostra-se que, quando comparado com a não-resistentes, parentais células MCF-7 CC 17, a dinâmica dos microtúbulos de células MCF-7 resistente ao TXT docetaxel são insensíveis ao tratamento com docetaxel.

Para entender melhor a função de MTAs e o mecanismo exacto de taxano-resistência em células cancerosas, que é essencial para medir a dinâmica dos microtúbulos. Aqui, nós relatamos um método in vivo de fazê-lo. Utilizando imagens ao vivo em associação com a expressão de tubulina GFP em células, pode-se medir a dinâmica dos microtúbulos de células MCF-7 TXT e células MCF-7 com CC e without tratamento com docetaxel. Os resultados podem nos ajudar a projetar drogas mais eficazes que podem superar a resistência taxano.

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Protocolo

1. Preparar as células for Imaging ao vivo

  1. Cultura de células e sementeira
    1. Utilização de células MCF-7 de cancro da mama seleccionados para resistência ao docetaxel (MCF-7 TXT) e sua linha celular parental não resistente (MCF-7 CC). O processo de selecção detalhada e a caracterização destas linhas celulares seleccionadas foram descritos anteriormente 24.
    2. Cresça todas as células em placas de cultura de 10 cm a 37 ° C num meio composto de 90% de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e 10% de soro fetal de bovino (FBS) e suplementado com aminoácidos não-essenciais. Manter o meio numa atmosfera de 5% de CO 2. Manter as células MCF-7 em TXT 5 nM de docetaxel.
    3. Semear as células em lamelas para geração de imagens ao vivo. Esterilizar 24 mm lamelas de vidro com poli-L-lisina-revestidas, enxaguando-as com álcool a 70% e, em seguida, expondo-os a radiação UV durante a noite. Coloque as lamelas numa placa de cultura de 6 poços de 35 mm. Place uma lamela em cada poço.
    4. Remover o meio a partir da placa de cultura de 10 cm e lavar as células com PBS. Adicionar 0,5 ml de tripsina-EDTA para o prato para separar as células do prato. Adicionar 5 ml de meio de cultura para o prato para neutralizar a tripsina seguindo o descolamento das células.
    5. Contar as células com um hemocitómetro para determinar o número de células por unidade de volume.
    6. Adicionar cerca de 5 a 10 células em cada poço com base no número de células por unidade de volume. Depois de sacudi-la gentilmente, pôs o prato de volta para a incubadora para permitir que as células para anexar as lamelas.
  2. Expressão de GFP α-tubulina
    1. Para ensaiar dinâmica dos microtúbulos, transduzir as células com GFP α-tubulina com controlo a transdução de GFP comercial (por exemplo, BacMam) de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Cultura das células nos poços durante 36 h numa incubadora de cultura de células de 37 ° C para permitir COMpleta adesão e 60% de confluência.
    3. Calcular o volume apropriado de GFP α-tubulina para adicionar a cada poço, de acordo com a seguinte equação:
      figure-protocol-1
      O número de células é o número estimado de células no poço no momento da marcação e o PPC desejado é o número de partículas por célula.
      NOTA: Semear as células MCF-7 deveria ter o dobro da contagem de células a partir de 10 5 a 2 x 10 5 com um PPC desejada de 20, o volume necessário para cada lamela é, por conseguinte, 40 ul. Para diferentes células, o volume calculado com base na fórmula acima pode ser o melhor. O volume exato deve ser ajustada de acordo com o nível de expressão real da GFP-tubulina.
    4. Misture a a-tubulina várias vezes GFP por inversão para assegurar uma solução homogénea. não vortex.
      NOTA: Para o controle, o (controle) reagente nulo carece de qualquer genética de mamíferoselementos e pode ser usado para ajudar a determinar os potenciais efeitos mediada por baculovírus e fluorescência de fundo. Um controle de transdução não-alvo GFP podem também ser utilizados, o que irá acender-se toda a célula.
    5. Substituir o meio de cultura com meio fresco. Adicionar 2 ml do novo meio e 40 uL de GFP α-tubulina a cada poço.
    6. Agitar a placa suavemente para permitir uma mistura completa de GFP α-tubulina com o meio de cultura. Retornar a placa na incubadora e incubar a cultura durante 24 horas para permitir a expressão de GFP-tubulina.
  3. Células Tratar com docetaxel
    NOTA: Esta experiência é testar o efeito do docetaxel na instabilidade dinâmica dos microtúbulos. Assim, as células são tratadas com a concentração desejada de docetaxel.
    1. Prepara-se uma forma composta de 90% de DMEM e 10% de FBS e suplementado com aminoácidos não-essenciais. Use DMEM sem vermelho de fenol vermelho de fenol porque pode interferir com o fluorescence de GFP-tubulina. Adicionar a concentração desejada de docetaxel (variando de 10 nM a 10 uM). A solução estoque de docetaxel é 10 mM em sulfóxido de dimetilo (DMSO).
    2. Pré-aquecer o meio contendo docetaxel a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos.
    3. Substituir o meio normal de cultura com o meio contendo docetaxel e incubar durante 30 min no incubador de cultura de tecido. Deve haver pelo menos 3 lamelas por poço para cada concentração de docetaxel.

2. Imagens ao vivo para examinar microtúbulos instabilidade dinâmica

  1. Configurando o sistema
    1. Realizar experiências numa câmara mantida a 37 ° C e 5% de CO 2. Adquirir imagens de fluorescência por lapso de tempo com um sistema microscópico equipado com um 60X, lente objetiva 1,42 NA óleo em um microscópio de fluorescência invertido e com uma câmera CCD.
    2. Configurar as células para geração de imagens ao vivo. tanto o titular pré-aquecer a amostra eo meio para 37 ° C. Escolha uma lamela para examinar. Colocar a tampa de interesse num suporte de amostra e incuba-se com 1 ml de meio contendo docetaxel preparado no passo 1.3.1.
  2. Imagens ao vivo de microtúbulos instabilidade dinâmica
    1. Identificar as células que serão utilizadas para imagiologia. Eles devem ser plana, tem uma elevada intensidade de fluorescência de GFP expressa-tubulina, e tem estruturas de microtúbulos claras.
    2. Escolha uma célula do grupo de células identificadas a partir da etapa 2.2.1 examinar em primeiro lugar. Concentre-se na área periférica da célula identificada. Configurar o programa para o tempo de exposição e a frequência de aquisição de imagem. Como o tempo de exposição é geralmente 0,5 s, as imagens serão adquiridas a cada dois s.
    3. Permitir que um 20 min adicional para os passos de 1,33 para 2.2.3. Assim, exactamente 50 min após a adição de docetaxel, tal como descrito no passo 1.3.3, iniciar imagem (isto é para a normalização).
    4. Grave a microtúbulos dynamics por 2 min, tirar uma foto a cada 2 s. No total, 60 adquirir imagens para a célula identificado.
    5. Mover para a próxima célula identificada e repita os passos 2.2.2 a 2.2.4. Repita o procedimento até 5 células foram fotografadas. É imperativo que fazer isso antes do tempo atinge 70 min após a adição de docetaxel, tal como descrito no passo 1.3.3.
    6. Para cada condição de tratamento, repita os passos 2.2.1 a 2.2.5 para 3 lamelas diferentes. No total, as células de imagem 15, que há dados suficientes para medir microtúbulos instabilidade dinâmica.

3. Processamento de Imagem e Análise de Dados

  1. Deconvolution de imagens
    1. Deconvoluir as imagens adquiridas para alcançar uma alta qualidade. Abra o programa de desconvolução equipado com o sistema de microscópio.
    2. Clique em "Processos" e selecione "deconvoluir." Arraste o arquivo de imagem para a janela "Input" e clique em "Do." O arquivo de imagem será deconvolved, eoarquivo deconvolved será salvo como um novo arquivo automaticamente.
  2. Geração de vídeos
    1. Clique no arquivo de imagem deconvolved de abrir com software equipado.
    2. Clique em "Arquivo" e selecione "Salvar como filme." Selecione a opção "formato de Filme" como "AV" e o "estilo de Animação", como "Forward". Defina a "qualidade de compressão" para "100%" e "Taxa de quadros" para "5 / segundo."
    3. Marque a caixa de "Animar através do tempo" e clique em "Faça isso." O vídeo será gerado.
  3. Medição de encurtamento dos microtúbulos ea taxa de crescimento
    1. Identificar os microtúbulos que serão usados ​​para a medição. Para cada célula, a poucos microtúbulos será capaz de ter o seu encurtamento ou crescimento seguido clara e completamente.
    2. Analisar cada quadro de vídeo para identificar o quadro que mostra o comprimento de partida da um microtúbulond do quadro com a microtúbulos mais prorrogado ou reduzido. Medir a variação de comprimento entre as duas microtúbulos e o tempo decorrido entre as duas armações.
    3. Calcula-se a taxa de crescimento ou encurtamento dividindo a mudança no comprimento de tempo (a unidade é um / s). Para cada condição de tratamento, siga pelo menos 10 células e medir pelo menos 20 microtúbulos.
    4. Calcule a média eo desvio-padrão para cada condição de tratamento. Analisar a diferença estatística entre as condições utilizando o teste de Student. Reportam os dados em uma tabela e / ou em um gráfico.

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Resultados

Usando o protocolo aqui apresentado, foram estudados os efeitos do docetaxel sobre a dinâmica dos microtúbulos de (MCF-7) TXT células cancerosas de mama normal (MCF-7 CC) e docetaxel-resistente. Dois conjuntos de imagens mostram os efeitos do docetaxel (0,5 ^ M) sobre o crescimento e encurtamento dos microtúbulos em células MCF-7 CC e MCF-7 TXT células (Figura 1A).

T...

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Discussão

Existem dois métodos principais para medir instabilidade dinâmica dos microtúbulos: in vitro e in vivo. No método in vitro, tubulina purificada é usada para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos com microscopia de contraste de interferência diferencial-lapso de tempo melhorado-computador. No método in vivo, microinjectados tubulina fluorescente, ou expressaram a GFP-tubulina, é incorporado em microtúbulos. A dinâmica (crescimento e encurtamento) dos microtúbulos é então grav...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Esta pesquisa é apoiada por financiamento do CBCF (para ZW).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Aminoácidos não essenciaisLife Technologies, Invitrogen11140-050
FBSGibco, Invitrogen12483
Anti-Anti (100x)Life Technologies, Invitrogen15240-062
docetaxelSigma-Aldrich01885-5mg-F
DMEM fenol vermelho-livreGibco, Invitrogen21063
Reagente de CellLight *BacMam 2.0* GFP-tubulinThermoFisher ScientificC10613Reagente chave para expressar tubulina de GFP em células
Reagente de CellLight *BacMam 2.0* GFPThermoFisher ScientificB10383Controle
Dimetil Sulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich+B9:AA9472301para dissolver decetaxel
22-mm coveslip de vidroFisher Scientifics12-545-101
Placa de cultura de 6 poçosGreiner Bio-One Internationalcultura Celi de 6 poços
DeltaVision Microscopy Imaging SystemsGE HealthEste sistema está equipado com estação meteorológica para controle de temperatura e CO2. Também é equipado com o software Worx para controle de deconvolução e lapso de tempo.
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenolThermoFisher Scientific25200056
conjunto de hemactómetros de linha brilhante, Hausser ScientificHausser Scientific, distribuído pela VWRN.º do fornecedor: 1492 N.º da VWR:15170-172
Placa de

Referências

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