Estabelecimento de células tetraplóides proliferativa de fibroblastos humanos não transformadas

Resumo

Embora as células poliplóides proliferativas sejam necessárias para analisar a instabilidade cromossômica das células poliplóides, não é fácil criar essas células a partir de células humanas não transformadas. O presente relato descreve procedimentos relativamente simples para estabelecer células tetraplóides proliferativas livres de uma população diplóide de fibroblastos humanos normais.

Resumo

Células poliplóides (principalmente tetraplóides) são frequentemente observadas em lesões pré-neoplásicas de tecidos humanos e sua instabilidade cromossômica tem sido considerada responsável pela carcinogênese nesses tecidos. Embora as células poliplóides proliferativas sejam necessárias para analisar a instabilidade cromossômica de células poliplóides, criar tais células a partir de células humanas não transformadas é bastante desafiador. A indução de tetraploidia por agentes químicos geralmente resulta em uma mistura de populações diplóides e tetraplóides, e a maioria dos estudos empregou classificação ou clonagem de células ativadas por fluorescência, limitando a diluição para separar células tetraplóides de células diplóides. No entanto, esses procedimentos são demorados e trabalhosos. O presente relato descreve um protocolo relativamente simples para induzir células tetraplóides proliferativas de fibroblastos humanos normais com contaminação mínima por células diplóides. Resumidamente, o protocolo é composto pelas seguintes etapas: deter células em mitose por demecolcina (DC), coletar células mitóticas após agitação, incubar células coletadas com DC por mais 3 dias e incubar células em meio livre de drogas (elas retomam a proliferação como células tetraplóides dentro de alguns dias). Dependendo do tipo de célula, a coleta de células mitóticas por agitação pode ser omitida. Este protocolo fornece um método simples e viável para estabelecer células tetraplóides proliferativas a partir de fibroblastos humanos normais. As células tetraplóides estabelecidas por este método podem ser um modelo útil para estudar a instabilidade cromossômica e o potencial oncogênico de células humanas poliplóides.

Introdução

Poliploidia foi observada não só em tecidos especializados de espécies de mamífero, mas também de uma variedade de condições patológicas, como o cancro e doenças degenerativas. Células poliplóides (principalmente tetraplóides) são muitas vezes observada em lesões pré-neoplásicas de tecidos humanos, tais como esófago ^1,2 ou lesões intra-epiteliais escamosas de Barrett, do colo do útero ^3,4, e foram considerados para ser a fonte de células malignas aneuploides nesses tecidos ^{5 , 6.} Embora seja sugerido que a conversão de células tetraplóides para aneuploides poderia ser um evento essencial nas fases iniciais de tumorigénese, os mecanism....

Protocolo

Cultura 1. celular

1. Obter as células para induzir tetraploidia. Até à data, foi confirmado que esta técnica pode ser aplicada a linhas de células humanas de fibroblastos TIG-1, BJ, IMR-90 e da telomerase-imortalizada TIG-1 (TIG-HT).
2. Cultivar células em meio essencial mínimo com modificação α ou qualquer outro meio de cultura celular adequado para o tipo de célula a ser estudada suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), por incubação numa atmosfera de 5% (v / v) _{de CO2} a 37 ° C. células de passagem a cada 3 ou 4 dias não deve exceder a densidade subconfluentes.
   NOTA: O nível de duplicação da....

Resultados

Na nossa experiência, as células TIG-1 pode ser feito quase completamente tetraplóide por tratamento contínuo simples com 0,1 ug / ml CC durante 4 dias (Figura 2A). Em contraste, outras estirpes de fibroblastos, tais como BJ ou IMR-90, e as células TIG-HT, tornou-se uma mistura de diplóide e populações tetraplóides seguindo o mesmo tratamento, e o isolamento de células mitóticas por o método shake-off é necessária durante o curso DC de tratamento (geralmente 16 - 18 h ap.......

Discussão

Um problema importante na indução de tetraploidia a partir de células diplóides por agentes químicos, quer por inibidores de citocinese ou por inibidores do fuso, é que as células tornam-se muitas vezes uma mistura de populações diplóides e tetraplóides, e células tetraplóides têm de ser separados a partir de células diplóides. abordagens mais comuns para isolamento de uma população de células tetraplóides livre diplóides utilizar FACS ou clonagem por diluição limitante. No entanto, esses procedimentos são trabalhosos e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
MEM-&alfa;	Sigma-Aldrich	M8042-500ML
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
FBS	Sigma-Aldrich	172012-500ML
Solução Demecolcina (10 μ g/mL em HBSS)	Sigma-Aldrich	D1925-10ML
BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits	BD Biosciences	#340242	Para exame de ploidia de DNA por citometria de fluxo
Sonda FISH multicolorida para cromossomo humano 24XCyte	MetaSystems	#D-0125-060-DI	Conjunto de filtros especializados e software para análise mFISH são necessários
Sistema de imagem Isis com software mFISH	O	kit de sonda MetaSystems

Specialized é necessário