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Artigo de método

Estabelecimento de células tetraplóides proliferativa de fibroblastos humanos não transformadas

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DOI:

10.3791/55028

⸱

8 de janeiro de 2017

 , 
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

Neste artigo

Resumo

Embora as células poliplóides proliferativas sejam necessárias para analisar a instabilidade cromossômica das células poliplóides, não é fácil criar essas células a partir de células humanas não transformadas. O presente relato descreve procedimentos relativamente simples para estabelecer células tetraplóides proliferativas livres de uma população diplóide de fibroblastos humanos normais.

Resumo

Células poliplóides (principalmente tetraplóides) são frequentemente observadas em lesões pré-neoplásicas de tecidos humanos e sua instabilidade cromossômica tem sido considerada responsável pela carcinogênese nesses tecidos. Embora as células poliplóides proliferativas sejam necessárias para analisar a instabilidade cromossômica de células poliplóides, criar tais células a partir de células humanas não transformadas é bastante desafiador. A indução de tetraploidia por agentes químicos geralmente resulta em uma mistura de populações diplóides e tetraplóides, e a maioria dos estudos empregou classificação ou clonagem de células ativadas por fluorescência, limitando a diluição para separar células tetraplóides de células diplóides. No entanto, esses procedimentos são demorados e trabalhosos. O presente relato descreve um protocolo relativamente simples para induzir células tetraplóides proliferativas de fibroblastos humanos normais com contaminação mínima por células diplóides. Resumidamente, o protocolo é composto pelas seguintes etapas: deter células em mitose por demecolcina (DC), coletar células mitóticas após agitação, incubar células coletadas com DC por mais 3 dias e incubar células em meio livre de drogas (elas retomam a proliferação como células tetraplóides dentro de alguns dias). Dependendo do tipo de célula, a coleta de células mitóticas por agitação pode ser omitida. Este protocolo fornece um método simples e viável para estabelecer células tetraplóides proliferativas a partir de fibroblastos humanos normais. As células tetraplóides estabelecidas por este método podem ser um modelo útil para estudar a instabilidade cromossômica e o potencial oncogênico de células humanas poliplóides.

Introdução

Poliploidia foi observada não só em tecidos especializados de espécies de mamífero, mas também de uma variedade de condições patológicas, como o cancro e doenças degenerativas. Células poliplóides (principalmente tetraplóides) são muitas vezes observada em lesões pré-neoplásicas de tecidos humanos, tais como esófago 1,2 ou lesões intra-epiteliais escamosas de Barrett, do colo do útero 3,4, e foram considerados para ser a fonte de células malignas aneuploides nesses tecidos 5 , 6. Embora seja sugerido que a conversão de células tetraplóides para aneuploides poderia ser um evento essencial nas fases iniciais de tumorigénese, os mecanismos envolvidos no presente processo não são completamente compreendidos. Isto é em parte porque nenhum modelo in vitro tem sido disponível onde as células humanas não transformadas poliplóides pode se propagar.

Alguns investigadores induziram tetraploidia em células epiteliais humanas não transformadas através da geração de células binucleadas por INHibiting citocinese 7-9. Neste método, no entanto, as células diplóides desnecessárias devem ser eliminadas por activadas por fluorescência de células (FACS) 7,8 ou clonagem por diluição limitante 9. Porque esses procedimentos são trabalhosos e não é fácil de realizar, métodos mais simples para estabelecer células tetraplóides não transformadas são desejados para a investigação neste domínio.

No presente relatório, nós descrevemos um protocolo para estabelecer células tetraplóides de proliferação de fibroblastos humanos normais ou fibroblastos humanos imortalizados-telomerase através de procedimentos relativamente simples. Os procedimentos usar fuso demecolcina veneno (DC) para prender células diplóides na mitose e células mitóticas recolhidos por agitando fora são ainda tratados com DC. células mitóticas diplóides tratados com DC por tempo prolongado converter em células G1 tetraplóides, e essas células proliferar como células tetraplóides após a paragem do crescimento durante vários dias após a remoção de drogas. Este protocolo prevêum método eficiente para a criação de um modelo útil para estudar a relação entre a instabilidade dos cromossomas e o potencial oncogénico de células humanas poliplóides.

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Protocolo

Cultura 1. celular

  1. Obter as células para induzir tetraploidia. Até à data, foi confirmado que esta técnica pode ser aplicada a linhas de células humanas de fibroblastos TIG-1, BJ, IMR-90 e da telomerase-imortalizada TIG-1 (TIG-HT).
  2. Cultivar células em meio essencial mínimo com modificação α ou qualquer outro meio de cultura celular adequado para o tipo de célula a ser estudada suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), por incubação numa atmosfera de 5% (v / v) de CO2 a 37 ° C. células de passagem a cada 3 ou 4 dias não deve exceder a densidade subconfluentes.
    NOTA: O nível de duplicação da população (PDL) deve ser calculado a cada vez em passaging para avaliar o crescimento celular e idade celular. PDL pode ser calculado a partir do número de células semeadas em um prato (N1) e o número de células colhidas na próxima Passaging (N2) com a seguinte fórmula (X é o PDL inicial). PDL = X + (log N1 - log N2) / log 2

2. Indução e Thisbelecimento de células tetraplóides de fibroblastos diplóides

  1. Induzir tetraploidia sem shake-off.
    NOTA: Algumas estirpes de células (por exemplo, TIG-1) pode tornar-se quase completamente tetraplóide por tratamento contínuo com demecolcina (DC) como se segue.
    1. células de passagem para uma ou duas placas de 100 mm no dia antes do tratamento para induzir tetraploidia. Geralmente, preparar 5 x 10 5 a 1 x 10 6 culas por prato para a indução de células tetraplóides.
    2. Tratar as células em crescimento exponencial com meio contendo 0,1 ug / ml CC durante 4 dias.
    3. Substituir DC contendo meio com meio isento de fármaco e incubar as células numa atmosfera de 5% (v / v) de CO2 a 37 ° C. As células normalmente retomar a proliferação dentro de 1 semana.
  2. Induzir tetraploidia com shake-off.
    NOTA: A maioria das células tornam-se uma mistura de populações diplóides e tetraplóides como um resultado do tratamento com CC simples descrito acima (2.1). Portanto, algumas modificações do pPROCEDIMENTO para eliminar uma população diplóide são necessários os seguintes (Figura 1).
    1. células de passagem em vários T75 frascos o dia antes do tratamento para induzir tetraploidia. Geralmente, preparam-se pelo menos 5 x 10 6 células (1 X 10 6 células por frasco) para indução de células tetraplóides.
    2. Tratar as células em crescimento exponencial com meio contendo 0,1 ug / ml CC durante 16 - 18 h, para reter as células em mitose. O tempo necessário para reter as células em mitose pode depender de células alvo e deve ser determinado por experiências preliminares para obter tantas células mitóticas quanto possível. Por exemplo, as células de crescimento mais lento deve ser tratada com DC durante mais tempo do que as células de crescimento mais rápido.
      NOTA: Se as células são tratadas por muito tempo nesta etapa, eles podem sofrer derrapagem mitótico e aderir à superfície do prato, tornando impossível para coletar células mitóticas por shake-off na próxima etapa.
    3. Recolha células mitóticas DC-presos pelo método shake-off, no which células mitóticas frouxamente aderentes são recolhidas por agitação suave dos frascos e a lavagem com o meio, seguido por centrifugação (300 xg, 5 min). Contar o número de células por um método apropriado nesta etapa.
    4. Repropagação células mitóticas recolhidas em placas de cultura de 60 mm e o tratamento de células com 0,1 ug / ml CC por um período adicional de 3 dias. Semente mais do que 1 x 10 6 células mitóticas por placa, porque menos de 10% das células podem sobreviver a este tratamento.
    5. Substituir DC contendo meio com meio isento de droga e esperar para as células a retomar a proliferação, o que geralmente ocorre dentro de 1 semana.
  3. células de passagem de forma semelhante às células diplóides originais.

3. Análise do ADN Ploidia

NOTA: Este é um procedimento bem estabelecido e um manual técnico deve ser referido para procedimentos detalhados e dicas técnicas.

  1. Células colheita (5 x outubro 5-1 x 10 6) através da incubação de células com uma solução contenção 0,05% de tripsina e 0,02% de EDTA durante 10 minutos a 37 ° C, e neutralizar a tripsina por meio contendo FBS a 10%.
  2. Centrifugar as células em meio e lavá-las por ressuspensão em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) seguido por centrifugação (300 xg, 5 min).
  3. Preparar células para análise de ADN por um dos dois métodos seguintes
    1. Um método para analisar as células não fixadas 10
      NOTA: Este método pode ser realizado utilizando um kit disponível comercialmente para análise do ciclo celular. As amostras preparadas com este método devem ser analisadas imediatamente, porque as células não são fixos no procedimento e corados núcleos vai ficar danificado ao longo do tempo.
      1. Lavar as células com tampão de citrato 40 mM contendo 250 mM de sacarose. Subsequentemente, o tratamento de células com 250 ul de 0,1% (v / v) de Nonidet P40 e 30 ug / ml de tripsina em tampão de citrato 200 ul de 40 mM contendo sacarose 250 mM durante 10 min à temperatura ambiente.
      2. Adicionar 200 uL de 0,5 ug / mL de tripsina INHibitor e 0,1 ug / ml de RNase A em tampão de citrato 40 mM contendo 250 mM de sacarose, e incuba-se as células durante 10 min a temperatura ambiente.
      3. Adicionar 200? L de 0,4 mg / mL de iodeto de propídio (PI) em tampão de citrato 40 mM contendo 250 mM de sacarose, e incuba-se as células durante 10 minutos à temperatura ambiente para corar os núcleos das células.
    2. Um método para a análise de células fixadas
      1. Fixar as células com etanol a 80% por células suspensão em 1 mL de PBS, adição de 4 ml de EtOH a 100%, gota a gota, enquanto a mistura da suspensão de células e deixando-o à temperatura ambiente durante 30 min. Células nesta fixador pode ser armazenado a -20 ° C durante várias semanas.
      2. Lave as células por ressuspensão em 5 ml de PBS seguido de centrifugação (300 xg, 5 min). Tratar as células com 0,5 mg / ml de RNase A e manchar os com iodeto de 50 ug / mL de propídio (PI) (475 ul de 0,5 mg / ml de ARNase A e 25 uL de 1 mg / mL de PI) durante 30 min à temperatura ambiente.
  4. Analisar o conteúdo de DNA de tele células utilizando um citómetro de fluxo com um laser de 488 nm e filtro de emissão de canal vermelho (tempo passar> 610 nm). Analisar uma amostra de referência preparada a partir de células diplóides genuínos ao mesmo tempo para avaliar ploidia das células alvo.
    1. Alternativamente, adicionar fluorescência grânulos padrão para avaliar a relação da intensidade de fluorescência das células diplóides versus os grânulos. Use a 'altura do pulso largura de pulso vs.' opção do citômetro de fluxo para discriminar entre as células tetraplóides individuais e aglomerados de células diplóides 11.

4. Exame de contagem de cromossomos e análise do cariótipo

NOTA: Estes são todos os procedimentos bem estabelecidos e um manual técnico ou protocolos do fabricante deve ser referido para procedimentos detalhados e dicas técnicas.

  1. Tratar as células em crescimento exponencial com 0,1 ug / ml CC durante 4 h para prender células em metafase.
  2. Preparar lâminas de cromossomos.
    1. Células colheita (pelo menos 5 x 10 5 células) por tripsinização e suspender em meio contendo FBS.
    2. centrifugar células em meio (300 xg, 5 min) e tratar com uma solução hipotónica (5 ml de 0,075 M de KCl) a 37 ° C durante 10 min.
    3. Fix e suspender as células em fixador de Carnoy (metanol: ácido acético = 3: 1).
    4. Espalhe células numa lâmina de vidro deixando cair um pequeno volume (25-35 mL) de suspensão de células. medidas adicionais, tais como a exposição ao vapor quente pode ser necessário para melhorar cromossomo espalhando.
  3. Células mancha para contagem de cromossomos ou análise do cariótipo ou fluorescência multicolor de hibridação in situ (mFISH).
    1. contagem de cromossomos.
      1. As células são coradas com solução Giemsa 5% (ou 5 ng de PI / ml contendo 0,5 mg / ml de ARNase A para a microscopia de fluorescência) por 15 - 20 min.
      2. fotografar digitalmente pelo menos 50 células em metafase.
      3. Contagem número de cromossomos por célula usando um softwa análise de imagemre após a separação manual de tocar e sobreposição cromossomos usando um software de edição de fotos. Embora o número de cromossomos podem ser marcados manualmente, pontuação computadorizado é recomendado.
    2. A análise do cariótipo
      NOTA: Esta análise deve ser realizada por um técnico treinado ou uma companhia profissional.
      1. Células de manchas de acordo com uma técnica G-bandas padrão de 12.
      2. Analisar cromossomos para fazer cariogramas padrão de 12.
    3. mFISH
      NOTA: Este passo é opcional e deve ser realizada, se necessário.
      1. Células mancha usando sondas FISH multicolor para cromossomos humanos de acordo com o protocolo do fabricante 13.
      2. Analise cromossomas utilizando um microscópio de fluorescência com filtros adequados e um software para análise mFISH 13.

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Resultados

Na nossa experiência, as células TIG-1 pode ser feito quase completamente tetraplóide por tratamento contínuo simples com 0,1 ug / ml CC durante 4 dias (Figura 2A). Em contraste, outras estirpes de fibroblastos, tais como BJ ou IMR-90, e as células TIG-HT, tornou-se uma mistura de diplóide e populações tetraplóides seguindo o mesmo tratamento, e o isolamento de células mitóticas por o método shake-off é necessária durante o curso DC de tratamento (geralmente 16 - 18 h ap...

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Discussão

Um problema importante na indução de tetraploidia a partir de células diplóides por agentes químicos, quer por inibidores de citocinese ou por inibidores do fuso, é que as células tornam-se muitas vezes uma mistura de populações diplóides e tetraplóides, e células tetraplóides têm de ser separados a partir de células diplóides. abordagens mais comuns para isolamento de uma população de células tetraplóides livre diplóides utilizar FACS ou clonagem por diluição limitante. No entanto, esses procedimentos são trabalhosos e...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm qualquer interesse financeiro que faça concorrência.

Agradecimentos

Agradecemos à Sra. Matsumoto pela assistência técnica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MEM-&alfa;Sigma-AldrichM8042-500ML
Tripsina-EDTASigma-AldrichT4174
FBSSigma-Aldrich172012-500ML
Solução Demecolcina (10 μ g/mL em HBSS)Sigma-AldrichD1925-10ML
BD CycleTES Plus DNA Reagent KitsBD Biosciences#340242Para exame de ploidia de DNA por citometria de fluxo
Sonda FISH multicolorida para cromossomo humano 24XCyteMetaSystems#D-0125-060-DIConjunto de filtros especializados e software para análise mFISH são necessários
Sistema de imagem Isis com software mFISH Okit de sonda MetaSystems
Specialized é necessário

Referências

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