Artigo de método
Descrevemos aqui um método de isolamento para obtenção de linfócitos intraepiteliais endocervicais humanos para análise de células T gama delta intraepiteliais. Este protocolo pode ser estendido para a purificação de células T gama delta endocervicais por esferas magnéticas ou por classificação de células.
O trato reprodutivo (FRT) da mucosa sistema imunológico feminino serve como a primeira linha de defesa. Melhor conhecimento da mucosa genital é, portanto, essencial para a compreensão da patogenicidade de diferentes patógenos, incluindo o HIV. Gama células delta (GD) T são o protótipo de células T 'não convencionais' e representam um subconjunto relativamente pequeno de células T definidos pela sua expressão de receptores de células T heterodiméricos (TCRs) compostas de cadeias gama e delta. Isso os diferencia das células T clássicos e muito melhor conhecidos CD4 + auxiliares e células CD8 + T citotóxicos que são definidos por TCRs alfa-beta. GD células T muitas vezes mostram a localização específica do tecido e são enriquecidos em epitélio. GD células T orquestrar respostas imunes em inflamação, vigilância de tumores, doenças infecciosas e auto-imunidade.
Aqui, apresentamos um método para isolar reprodutível e analisar linfócitos intra-epiteliais endocervicais humanos GD T. que have amostras cytobrush endocervicais usados mulheres participantes Infecção Estudo Interagency HIV das Mulheres (WIHS). Conhecimento sobre GD células T interações durante as condições em que não é um insulto à mucosa vaginal poderia ser aplicada a qualquer estudo clínico em que a vulnerabilidade das mucosas são os destinatários, incluindo o desenvolvimento de adição microbicides.In vaginal, o conhecimento sobre as respostas das células da mucosa GD T tem potencial para aplicação de terapia imunitária baseada em células T GD no tratamento de doenças infecciosas.
Nós desenvolvemos metodologia de utilização de amostras escova endocervical para avaliar células GD T intra-epitelial. O canal endocervical é recoberto por uma camada única de epitélio colunar. Linfócitos intra-epiteliais representam linfócitos linha de frente que residem na camada epitelial que podem iniciar rapidamente as respostas imunes ao encontrar micróbios patogênicos 7, 8. Compreender os eventos imunológicos do compartimento intra-epitelial endocervical é importante para a concepção de estratégias eficazes para prevenir infecções, incluindo o HIV.
O nosso método pode ser a....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
atividades de estudo teve lugar na Universidade de Miami Unidade de Pesquisa de HIV em colaboração com Estudo das Mulheres Miami HIV Interagency (WIHS) e do Centro Miami for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (Universidade de Miami Miller School of Medicine) aprovação foi obtida antes ao recrutamento e quaisquer procedimentos de avaliação ou de estudos relacionados.
Coleta de Amostras 1. Endocervical Escova
NOTA: Os participantes foram submetidos a um exame vaginal realizado por MD treinados ou ginecologista e recolha de linfócitos intra-epiteliais foram realizadas em exame especular, inserindo cyt....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Recentemente, analisamos células GD T intraepiteliais endocervicais e fomos o primeiro a relatar sobre a perda de células T gama delta endocervical em mulheres infectadas pelo HIV 9, 11. Aqui, descrevemos o protocolo para isolar e analisar o subconjunto de células T gama delta endocervical. Como mostrado na Figura 1, as células T GD pode ser facilmente detectado em amostras de células endocervicais humanos.
<.......Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Avaliação da vulnerabilidade das mucosas do tracto genital inferior feminino é um componente essencial de estudos clínicos que abordam risco de aquisição e transmissão do HIV. Tipicamente FGT vulnerabilidade à infecção do HIV é avaliada através da medição moduladores imunitários solúveis em secreções genitais (citocinas, quimiocinas e péptidos antimicrobianos) 12, 13. No entanto, estes biomarcadores são apenas indicativos da inflamação vaginal, são afetados por .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Autores não têm associação comercial ou outra, que podem representar um conflito de interesses (por exemplo, a propriedade de ações farmacêutica, consultoria, a adesão Advisory Board, patentes relevantes, ou o financiamento da investigação).
Agradecemos aos participantes do estudo Miami WIHS para a sua vontade de participar neste trabalho. Os dados apresentados nesta manuscrito foram recolhidos por Interagency HIV Study das Mulheres Miami (WIHS). O conteúdo desta publicação é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam a posição oficial do National Institutes of Health (NIH). Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e das mulheres Infecção Estudo Interagency HIV (WIHS) [subvenção número U01 AI103397], Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, Instituto Nacional de Saúde [número de concessão P30AI073961], Centro Nacional para a Promoção ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, EUA | ||
| IMDM, Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter (A Série Vi-CELL Cell Cell Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimetilsulfóxido | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Soro Fetal Bovino | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Kit de Mancha de Células Mortas Amarelas Fixáveis | Life | Technologies,L349S9 | |
| 1% paraformaldeído | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Citômetro de fluxo Fortessa | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads eBioscience | 01-2222-42 | ||
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| Separador | |||
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE
Solicitar permissão