Artigo de método

In Situ Deteção e única célula quantificação de nanopartículas de óxido de Metal usando análise de microsonda Nuclear

DOI:

10.3791/55041

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3 de fevereiro de 2018

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1Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), Université de Bordeaux, 2Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), CNRS, 3Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), CNRS, 4Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), Université de Bordeaux

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos um procedimento para a detecção de elementos químicos presentes em situ em células humanas, bem como a sua quantificação em vitro . O método é adequado para qualquer tipo de célula e é particularmente útil para análises químicas quantitativas em células únicas em vitro exposição a nanopartículas de óxido metálico.

Resumo

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Técnicas de microanálise com base nas imagens do elemento químico permitem a localização e quantificação de composição química a nível celular. Eles oferecem novas possibilidades para a caracterização dos sistemas vivos e são particularmente adequados para detectar, localizar e quantificar a presença de nanopartículas de óxido de metal, tanto em amostras biológicas e do ambiente. Na verdade, todas essas técnicas requisitos relevantes em termos de sensibilidade (i) (de 1 até 10-µg.g-1 de massa seca), micrômetro (ii) escala de resolução espacial e a detecção de vários elemento de (iii). Tendo em conta estas características, imagens de elemento químico microbeam podem poderosamente complementar técnicas de imagem de rotina tais como óptica e microscopia de fluorescência. Este protocolo descreve como realizar uma análise microsonda nuclear em células cultivadas (U2OS) expostas a nanopartículas de dióxido de titânio. As células devem crescer e ser expostas diretamente em um suporte de amostra especialmente projetado usado no microscópio óptico e na fase de análise microsonda nuclear. Mergulho-congelamento criogênica fixação das amostras preserva a organização celular e a distribuição do elemento químico. Análise de simultânea microsonda nuclear (microscopia de transmissão íon, espectrometria de Retrodispersão de Rutherford e partícula induzida por emissão de raios x) realizada na amostra fornece informações sobre a densidade celular, a distribuição local de os elementos químicos, bem como o conteúdo celular de nanopartículas. Há uma necessidade crescente de tais ferramentas analíticas dentro biologia, especialmente no contexto emergente de Nanotoxicology e nanomedicina para o qual deve ser aprofundado nossa compreensão das interacções entre as nanopartículas e amostras biológicas. Em particular, como análise de microsonda nuclear não requer nanopartículas de ser rotulados, abundâncias de nanopartículas são quantificáveis para o nível de células individuais em uma população celular, independentemente do seu estado de superfície.

Introdução

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Homeostase celular é determinado pelo controle de absorção, assimilação e localização intracelular de diferentes elementos de traço (íons, metais, compostos inorgânicos exógenos). Estes componentes são frequentemente sob a forma de vestígios, mas, no entanto, podem ter um impacto considerável na fisiologia do sistema. Assim, o estudo da bioquímica celular em situações normais e patológicos/estressado é um passo-chave para uma compreensão geral dos mecanismos metabólicos celulares. Portanto, o desenvolvimento de técnicas analíticas e de imagem, permitindo a investigação de abundâncias químicas intracelulares, organização estrutural e suas funções metabólicas relacionad....

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Protocolo

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1. preparação do suporte de amostra

  1. Preparação e projeto de titular de amostra
    1. Fabricar um porta-amostras perfurando um quadrado de 5 x 5 mm em um quadro PEEK espesso de 1 mm.
    2. Limpe por lavagem com etanol 70% (v/v) e manter-se em placas estéreis até que esteja pronto para usar.
      Romance Um porta-amostras apropriado para cultura de células e manipulação de célula é necessário. Ele precisa ser projetado para cultivo, observações em vitro com microscopia óptica e análise microsonda nuclear e a imagem latente de célula. Este suporte é feito de um PEEK quadro13.
  2. Prepa....

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Resultados

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Cultura celular e a imagem latente de fluorescência do TiO fluorescente etiquetada 2 NPs

Nós projetamos um porta-amostras adaptado para cultura de células, manipulação de células, bem como a análise multimodal. Especificamente, era importante que o titular permitida rotina microscopia óptica como bem como nuclear microsonda análise e geração de imagens. Este suporte d.......

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Discussão

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Nós descrevemos um método de fornecer informações úteis, além do que é possível com outras técnicas de imagem, especialmente a nível subcelular. Além de sua capacidade de geração de imagens, análise de microsonda nuclear também oferece possibilidades de quantificação dos elementos químicos que entram na composição de uma amostra biológica. No presente trabalho, estudamos as populações de células humanas e voltada para a análise de uma região escolhida de interesse com base em uma única célula exposta ao TiO2 N.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos Serge Borderes direção e edição do vídeo. A agência francesa de investigação nacional apoia o programa de pesquisa TITÂNIOS (ANR CES 2010, n ° CESA 01 009). O CNRS e a Comunidade Europeia como uma atividade de integração desde o "apoio de público e Industrial pesquisa usando íon feixe tecnologia (espírito)" sob o contrato CE n ° 227012. Este trabalho foi apoiado por acções Marie Curie - redes de formação inicial (ITN) como um "integrando atividade apoio pós-graduação com estágios na indústria e treinamento excelência em pesquisa" (SPRITE, D1.3) sob contrato CE n. º 317169. O C'NANO Grand Sud Ouest e a região Aquitânia apoiar o programa de pesquisa TOX-NANO....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cultura de células
U2OSATCC, LGC STANDARDSATCC HTB-96
Médio MCCOY 5A sem L-GlutaminaDominique DUTSCHERL0211-500
FBS 500 mLDominique DUTSCHER500105U
Penicilina/Estreptomicina ThermoFisher Scientific11548876
  L-Glutamina 200 mM, 100 mL Invitrogen25030024
Geneticina,  20 mLThermoFisher Scientific10092772
Tripsina-EDTA 0,25% (v/v)  500 mLThermoFisher Scientific11570626
Viromer RedLipocalyxVR-01LB-01
Matrix-roGFP PlasmidAddGene#49437
Hoechst 33342ThermoFisher ScientificH3570Manuseie com cuidado
preparação de NPs
TiO2 P25 AERÓXIDODegussa/Evonik
Isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC)SIGMA-ALDRICHT3163Modificação da superfície de NPs
Preparação da amostra
Folha de policarbonatoGoodfellowCT301020
Éter Éter Cetona suporte (PEEK)MatechplastA-239-4047
Etanol, ACS absolutoSIGMA-ALDRICH02860-6x1L
Chlorform, Anidro, 99%SIGMA-ALDRICH372978-1L Cuidado tóxico
Formvar 100 gAgar ScientificAGR1201Nocivo. Use em uma concentração de 10 µ g por mL de clorofórmio
NaOHSIGMA-ALDRICHS5881-500G
Fixação da amostra
Pó, 95% ParaformaldeídoSIGMA-ALDRICH158127-500GCuidado tóxico. Use como solução a 4% em PBS
PBS (pH 7,4, sem Ca2+ e Mg2+)ThermoFisher Scientific11503387
Prolong Gold Antifade ReagentThermoFisher ScientificP36934
Triton X-100SIGMA-ALDRICH93443
NocivoCriofixação de amostras
nitrogênio líquido santeMetilbutano prejudicial
> = 99%SIGMA-ALDRICH  M32631-1LCuidado tóxico
Placa de transferência de alumínioCaseiro
Água destilada e desionizadaCaseiroProduzido em laboratório utilizando o sistema Barnstead Smart2Pure
ParafilmVWR52858-000
Equipment
Barnstead Smart2PureThermoFisher BancadaScientific 50129870
, classe IIThermoFisher ScientificMSC-Advantage
TC20Biorad145-0102SP
Lâminas de contagem 2 poçosBiorad1450016
detector PIPS, 25 mm2, resolução de energia de 12 keV @5.5 MeVCanberra PD25-12-100AM
Detector de estado sólido Si (Li) de alta resolução, resolução de 145-eVenergy, @Mn-Kαda Oxford Instruments
 Orsay Physics1-SED
XRF Calibração Padrão sódio ou cloro como NaClMicromatéria34381
Padrão de calibração XRF Magnésio como MgF2Micromatéria34382
Padrão de calibração XRF Alumínio como metalAl Micromatéria34383
Calibração XRF Padrão Silício como SiOMicromatéria34384
Padrão de calibração XRF Enxofre como CuSxMicromatéria34385
Padrão de calibração XRF Cálcio como CaF2Micromatéria34387
Padrão de calibração XRF Titânio como Ti metalMicromatéria34388
Calibração XRF Padrão Ferro como Fe metalMicromatéria34389
Sonicator 750WSonics Materiais11743619
Microssonda 3MMBioblock scientific220-05
Liofilizador no vácuoElexienceEK3147
Microscópio óptico Zeiss AxioObserver Z1Carl Zeiss MicroImaging, GmbH431006-9901
Platina motorizada xyCarl Zeiss MicroImaging, GmbH432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0,50 Ph2 M27 objetivaCarl Zeiss MicroImaging, GmbH420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objetivaCarl Zeiss MicroImaging, GmbH420781-9910
Conjunto de filtros Zeiss 02Carl Zeiss MicroImaging, GmbH488002-9901
Conjunto de filtros Zeiss 38HECarl Zeiss MicroImaging, GmbH489038-9901
Conjunto de filtros Zeiss 31Carl Zeiss MicroImaging, GmbH000000-1031-350
Hotte químicoErlabCaptair SD321
Acelerador de partículasHVEEsingletron
Software
ImageJ softwareNational Institutes of health, EUAImageJ 1.51
SimNRA softwareMax-Planck-Institut fü r Plasmaphysik, AlemanhaSIMNRA 6.06
Software GupixUniversidade de Guelph, CanadáGUPIXWIN 2.2.4
Líquidos de de Biossegurança Contador de células automatizado Detector de elétrons secundário (SED) tipo Everhart-Thornley

Referências

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  1. Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
  2. Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
  3. Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H.

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