Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina

Resumo

Um método para analisar a integridade do DNA na fração sobrenadante livre de células de amostras de urina é proposto. O método é adequado para a detecção precoce de neoplasias urológicas e provou ser preciso para o diagnóstico precoce do câncer de bexiga.

Resumo

Embora a presença de ADN de circulação livre de células no plasma ou soro tem sido amplamente demonstrado ser uma fonte adequada de biomarcadores para muitos tipos de cancro, poucos estudos têm-se centrado na utilização potencial de ADN isento de células de urina (UCF). A partir das hipóteses de que as células em apoptose normais produzem DNA altamente fragmentado e que as células cancerosas liberam mais DNA, o papel potencial da integridade do DNA UCF foi avaliada como um marcador diagnóstico precoce capaz de distinguir entre os pacientes com câncer de próstata ou câncer de bexiga e indivíduos saudáveis.

Uma análise da integridade do ADN UCF é proposta com base em quatro reacções de PCR quantitativo em tempo real de quatro sequências mais longas do que 250 pb: c-myc, BCAS1, HER2, e AR. As sequências que têm frequentemente um aumento do número de cópias de ADN na bexiga e cancros da próstata foram escolhidos para análise, mas o método é flexível, e estes genes podem ser substituídos por outros genes de intedescansar. A utilidade potencial de DNA UCF como fonte de biomarcadores já foi demonstrado para neoplasias urológicas, abrindo assim o caminho para novos estudos sobre a caracterização DNA UCF. O teste de integridade do DNA UCF tem a vantagem de ser não-invasivo, rápido, e fácil de executar, com apenas alguns mililitros de urina necessários para levar a cabo a análise.

Introdução

ADN livre de células pode ser detectado no sangue e na urina devido a morte celular por mecanismos apoptóticos ou necróticos. DNA livre de células no sangue tem sido amplamente estudada para fins de diagnóstico e prognóstico em várias doenças, especialmente câncer ^1. No entanto, pouco se sabe sobre o papel do DNA urinário livre de células (UCF). DNA UCF podem ser originários de passagem de sangue através do sistema de filtração glomerular ou a partir de células que entram em contacto directo com este corpo fluido ² (por exemplo, células uroteliais ou células prostáticas). A utilização de ADN UCF como uma fonte de biomarcadores tem sido ....

Protocolo

O protocolo segue as orientações do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos IRST.

NOTA: Neste protocolo, isolado DNA a partir de amostras de urina para realizar uma análise de integridade do DNA UCF. LNCaP e células MRC linhas foram utilizados para construir padrões. Técnicas tais como a extracção de ADN, a quantificação de ADN (espectrofotómetro e PCR em tempo real para o gene de controlo, STOX1), e PCR em tempo real para oncogenes específicos foram realizados (Figura 1).

1. Recolha de urina e Processamento

1. Obter uma de urina limpa primeira manhã amostra de urina em um copo l....

Resultados

A concentração total de ADN livre foi quantificado por espectrofotometria para todas as amostras analisadas, mostrando uma gama de entre 1,51 e 138 ng / mL. Cinco amostras de controlo foram utilizados para a reprodutibilidade dos dados: duas experiências independentes em tempo real foram realizados para c-myc, HER2, BCAS1, AR, e STOX1. Os coeficientes de variação (CV) foram então calculados para cada gene (Tabela 2), com um bo.......

Discussão

UCF análise da integridade do ADN é um método novo, não invasivo para avaliar a integridade do ADN na urina. Recentemente, foi proposto para o diagnóstico precoce da bexiga e próstata ^{9 7,8.} Um certo número de vantagens e desvantagens do teste de integridade do DNA UCF são discutidos aqui, juntamente com perspectivas futuras.

A principal vantagem do método é que ele oferece um método barato, não-invasivo e um protocolo simples para estudar urina como uma fonte potencial.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mini Kit QIAamp DNA	Qiagen	51304
iQ SYBR  Supermix Verde, 100 x 50 µ L rxns, 2,5 mL (2 x 1,25 mL)	Biorad	1708880
IDT oligos de DNA personalizados	IDT		Purificação da HPLC, espectrofotômetro oligo NanoDrop 1000 do ADN 100nMole
	Thermo científico		Outros métodos espectrofotométricos podiam igualmente ser usados quantificar o
Rotor-Gene 6000	Corbett		um outro instrumento do PCR do tempo real poderia igualmente ser centrifugador usado
microcentrifuge
um para os tubos de
incubadora-80
° C freezer-20
&graus; C freezer
10 μ L pipeta
20 μ L pipeta
200 μ L pipeta
1.000 μ Ponteiras de pipeta
(10; 20; 200; 1.000)
Tubos de 1,5 mL Tubos
de 50 mL Tubos
			15 mL
Rotor-Disc 72 Rotor	Corbett	9018899
Tubos e tampas de tira, 0,1 mL (250)	Qiagen	981103
Tubos de coleta (2 mL)	Qiagen	19201
Tampão AL (264 mL)	Qiagen	19075
Proteinase K (10 mL)	Qiagen	19133

do ADN do 50 mLLde