Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina

Resumo

Um método para analisar a integridade do DNA na fração sobrenadante livre de células de amostras de urina é proposto. O método é adequado para a detecção precoce de neoplasias urológicas e provou ser preciso para o diagnóstico precoce do câncer de bexiga.

Resumo

Embora a presença de ADN de circulação livre de células no plasma ou soro tem sido amplamente demonstrado ser uma fonte adequada de biomarcadores para muitos tipos de cancro, poucos estudos têm-se centrado na utilização potencial de ADN isento de células de urina (UCF). A partir das hipóteses de que as células em apoptose normais produzem DNA altamente fragmentado e que as células cancerosas liberam mais DNA, o papel potencial da integridade do DNA UCF foi avaliada como um marcador diagnóstico precoce capaz de distinguir entre os pacientes com câncer de próstata ou câncer de bexiga e indivíduos saudáveis.

Uma análise da integridade do ADN UCF é proposta com base em quatro reacções de PCR quantitativo em tempo real de quatro sequências mais longas do que 250 pb: c-myc, BCAS1, HER2, e AR. As sequências que têm frequentemente um aumento do número de cópias de ADN na bexiga e cancros da próstata foram escolhidos para análise, mas o método é flexível, e estes genes podem ser substituídos por outros genes de intedescansar. A utilidade potencial de DNA UCF como fonte de biomarcadores já foi demonstrado para neoplasias urológicas, abrindo assim o caminho para novos estudos sobre a caracterização DNA UCF. O teste de integridade do DNA UCF tem a vantagem de ser não-invasivo, rápido, e fácil de executar, com apenas alguns mililitros de urina necessários para levar a cabo a análise.

Introdução

ADN livre de células pode ser detectado no sangue e na urina devido a morte celular por mecanismos apoptóticos ou necróticos. DNA livre de células no sangue tem sido amplamente estudada para fins de diagnóstico e prognóstico em várias doenças, especialmente câncer ^1. No entanto, pouco se sabe sobre o papel do DNA urinário livre de células (UCF). DNA UCF podem ser originários de passagem de sangue através do sistema de filtração glomerular ou a partir de células que entram em contacto directo com este corpo fluido ² (por exemplo, células uroteliais ou células prostáticas). A utilização de ADN UCF como uma fonte de biomarcadores tem sido principalmente investigado para o diagnóstico precoce de doença renal, da bexiga, e cancro da próstata, devido à elevada percentagem de ADN UCF vindo directamente a partir de células do tracto urinário ^3,4.

Pouco se sabe sobre DNA UCF e os melhores métodos para isolar e caracterizar-lo. Tendo em conta a hipótese de que as células tumorais libertar fragmentos de ADN mais longos do que as células normais, a avaliaçãoda integridade do ADN isento de células foi estudada na tentativa de elucidar a origem de ADN na circulação sanguínea ^5. Alguns estudos demonstraram que a integridade do ADN isento de células no sangue representa um bom teste de diagnóstico para muitos tipos de cancro ^6, e a mesma hipótese tem sido proposta em relação à urina ^7-9.

Este artigo descreve um novo método para a análise de integridade do DNA UCF com um potencial de aplicação para detecção de bexiga e câncer de próstata. Em particular, a integridade do ADN UCF fragmentos superiores a 250 pb foi testado em 4 regiões conhecidas por terem um aumento do número de cópias de ADN em tumores sólidos, incluindo o da próstata e cancro da bexiga: c-myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) e AR (Xq12) ^10-14. oncogenes específicos, em vez de seqüências aleatórias, foram escolhidos para aumentar a probabilidade de encontrá-los na fração livre de células de pacientes com câncer. Uma das principais vantagens deeste método é que é flexível e que outras regiões podem também ser seleccionada com base no tipo de tumor e características.

Protocolo

O protocolo segue as orientações do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos IRST.

NOTA: Neste protocolo, isolado DNA a partir de amostras de urina para realizar uma análise de integridade do DNA UCF. LNCaP e células MRC linhas foram utilizados para construir padrões. Técnicas tais como a extracção de ADN, a quantificação de ADN (espectrofotómetro e PCR em tempo real para o gene de controlo, STOX1), e PCR em tempo real para oncogenes específicos foram realizados (Figura 1).

1. Recolha de urina e Processamento

1. Obter uma de urina limpa primeira manhã amostra de urina em um copo limpo e seco, de plástico. Recolher pelo menos 50 ml da amostra de urina.
2. Manter a urina, a 4 ° C durante um máximo de 3 h e enviá-lo para o laboratório, à mesma temperatura.
3. Misture cada amostra invertendo-lo duas vezes imediatamente após a chegada no laboratório e transferência em dois tubos de polipropileno de fundo cónico de 50 ml.
4. Centrifugar os tubosa 850 xg durante 10 min a 4 ° C ou à temperatura ambiente.
5. transferir cuidadosamente 10 ml de a parte superior do sobrenadante de urina em dois tubos de 5 mL, deixando, pelo menos, 2 ml do sobrenadante acima da pelete de células.
   NOTA: Transferir a parte superior do sobrenadante reduz o risco de contaminação por células ou detritos celulares. Não há nenhuma clara delimitação entre as partes superior e inferior.
6. Desprezar o pelete e congelar imediatamente o sobrenadante a -80 ° C até à sua utilização.

2. Isolamento de ADN a partir do sobrenadante de urina e linhas celulares

NOTA: Isolar o ADN a partir de uma linha celular (por exemplo, LNCaP de cancro da próstata ou cancro da bexiga para MRC) usando um estojo comercial e seguindo as instruções do fabricante. Isolamento de ADN a partir do sobrenadante de urina deve ser realizado utilizando o protocolo comercial, modificado como se segue:

1. Descongelar uma alíquota do sobrenadante de urina, à temperatura ambiente.
2. Vortex e misturar a amostra de urina e transferir 1 ml de sobrenadante a urina para um tubo de 5 mL claro. Congelar a urina residual à temperatura de -80 ° C.
3. Adicionar 100 ul de proteinase K directamente para a amostra.
4. Adicionar 1 mL de tampão AL à amostra e misturar bem por pipetagem.
5. Feche os tubos e incubar as amostras a 56 ° C durante 15 min.
6. Durante a incubação, preparar uma coluna para cada amostra e preparação dos tampões de lavagem, e AW1 AW2, conforme instruções do fabricante (adicionar a quantidade indicada de 100% de etanol).
7. Trazer as amostras de volta à temperatura ambiente e adicionar 1 ml de etanol absoluto. Misturar completamente por pipetagem.
8. Adicionar 650 ul da mistura obtida no passo 2.7 para a coluna e centrifugar-lo a 6,000 xg durante 1 min.
9. Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e colocar a coluna em um tubo de recolha de novo, limpo. Repita os passos 2.8 e 2.9 até que toda a mistura de amostra foi usado (5 vezes).
10. Adicionar 500 &# 181; ul de tampão AW1 sem molhar a borda da coluna. Centrifugar-lo a 6,000 xg durante 1 min.
11. Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e substituí-lo por um novo tubo de recolha, limpo.
12. Adicionar 500 ul de tampão de AW2 sem molhar a borda da coluna. Centrifugar-lo à velocidade máxima (20000 x g) durante 3 min.
13. Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e substituí-lo por um novo tubo de recolha, limpo.
14. Repita o passo 2.12 para remover qualquer tampão de lavagem residual.
15. Colocar a coluna para um tubo limpo de 1,5 mL. Adicionar 50 ul de tampão de eluição AE e esperar 7 min para assegurar que os molha tampão da coluna.
16. Centrifugar a 8.000 xg lo durante 1 min.
17. Pipetar o eluente do passo 2.15 para o mini-coluna e centrifugar-lo à velocidade máxima durante 1 min para assegurar a máxima recuperação do DNA.

3. DNA Quantificação e Diluição

1. Usando um espectrofotómetro, realizar a quantificação do ADN de both, a linha de células e as amostras de urina sobrenadante. Use 2 ul de amostra num espectrómetro de bancada, de acordo com as instruções do fabricante.
2. Diluir as amostras de DNA de UCF para obter uma concentração de 1 ng / mL e armazenar o ADN à temperatura de -20 ° C até que a análise da integridade do ADN.
   NOTA: Se a quantidade de ADN não é suficiente para prosseguir com PCR em tempo real (pelo menos 100 ng), realizar um novo processo de isolamento de DNA.
3. Dilui-se o ADN a partir de amostras de linha de células para obter seis padrões com diferentes concentrações: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 e 2 ng / mL, cada uma com um volume de 100 uL (ST1, ST2, ST3, sT4, ST5, e ST6). Armazenar os padrões de ADN da linha de células à temperatura de -20 ° C até que a análise da integridade do ADN.

4. DNA Integrity Test - PCR

1. Descongelar os iniciadores (a concentração depende do tipo de ensaio), Supermix verde, padrões de ADN da linha de células, e amostras de DNA UCF diluídos em gelo.
2. Prepare tubos tira na placa de fou o disco do rotor 72 poços. Alíquota de 10 uL em duplicado para cada padrão e amostra diluída e 10 uL de água isenta de RNase para o controlo negativo.
3. Prepara-se uma mistura de 1 mL de cada iniciador (as concentrações são indicadas na Tabela 1), 12,5 uL de Supermix verde, e 6,5 mL de água isenta de RNase para cada amostra. Ao preparar a mistura, utilize o seguinte número de amostras: 6 padrões para 2 repetições, número de amostras por 2 repetições, controle negativo para 2 repetições, e 2 amostras extras.
4. Aliquota de 15 uL da mistura em cada cavidade. Não pipeta ou girar os tubos.
5. Inicie o protocolo com as condições de PCR indicados na Tabela 1.
   NOTA: Para obter o valor DNA UCF, 29 amostras de DNA foram processados ​​para cada experimento em tempo real usando o disco do rotor 72 poços: 29 x 2 amostras + 6 x 2 padrões + control x 2 = 72 (valor de DNA UCF) negativo.
   NOTA: O protocolo para a análise da integridade do ADN também pode ser UCFrealizada utilizando um outro instrumento de PCR em tempo real (quando se utiliza um outro dispositivo, ROX corante pode precisar de ser adicionado).

5. DNA Integrity Test - Análise de Dados e Interpretação

NOTA: O valor de ADN UCF para cada amostra foi obtida por um software de sistema de detecção de instrumento em tempo real, utilizando uma construção curva padrão para cada avaliação individual do gene por PCR e utilizando interpolação curva padrão, tal como anteriormente descrito ^7-9 (Figura 2).

1. Avaliar as repetições; amostra replica com uma diferença ≥1 Ct deve ser descartado e re-avaliado em um segundo experimento.
2. Calcule o Ct mediana para cada amostra e considerar amostras com um valor de Ct ≤ 36.
3. Avaliar a especificidade dos produtos de PCR por meio de análise de fusão.
4. Avaliar a concentração de cada fragmento amplificado por interpolação com a curva padrão; obter um valor de concentração (ng / mL) para cada fragmento amplificado.

Resultados

A concentração total de ADN livre foi quantificado por espectrofotometria para todas as amostras analisadas, mostrando uma gama de entre 1,51 e 138 ng / mL. Cinco amostras de controlo foram utilizados para a reprodutibilidade dos dados: duas experiências independentes em tempo real foram realizados para c-myc, HER2, BCAS1, AR, e STOX1. Os coeficientes de variação (CV) foram então calculados para cada gene (Tabela 2), com um bo...

Discussão

UCF análise da integridade do ADN é um método novo, não invasivo para avaliar a integridade do ADN na urina. Recentemente, foi proposto para o diagnóstico precoce da bexiga e próstata ^{9 7,8.} Um certo número de vantagens e desvantagens do teste de integridade do DNA UCF são discutidos aqui, juntamente com perspectivas futuras.

A principal vantagem do método é que ele oferece um método barato, não-invasivo e um protocolo simples para estudar urina como uma fonte potencial...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mini Kit QIAamp DNA	Qiagen	51304
iQ SYBR  Supermix Verde, 100 x 50 µ L rxns, 2,5 mL (2 x 1,25 mL)	Biorad	1708880
IDT oligos de DNA personalizados	IDT		Purificação da HPLC, espectrofotômetro oligo NanoDrop 1000 do ADN 100nMole
	Thermo científico		Outros métodos espectrofotométricos podiam igualmente ser usados quantificar o
Rotor-Gene 6000	Corbett		um outro instrumento do PCR do tempo real poderia igualmente ser centrifugador usado
microcentrifuge
um para os tubos de
incubadora-80
° C freezer-20
&graus; C freezer
10 μ L pipeta
20 μ L pipeta
200 μ L pipeta
1.000 μ Ponteiras de pipeta
(10; 20; 200; 1.000)
Tubos de 1,5 mL Tubos
de 50 mL Tubos
			15 mL
Rotor-Disc 72 Rotor	Corbett	9018899
Tubos e tampas de tira, 0,1 mL (250)	Qiagen	981103
Tubos de coleta (2 mL)	Qiagen	19201
Tampão AL (264 mL)	Qiagen	19075
Proteinase K (10 mL)	Qiagen	19133