É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

15.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/55058

⸱

12 de dezembro de 2016

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, University of Georgia

Neste artigo

Resumo

Consecutivos crio-secções são recolhidas para permitir que aplicações histológicas e enriquecimento do RNA para medições de expressão de genes usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. RNA de alta qualidade é obtida a partir de 20 - 30 mg de criosecções e medições agrupados serão comparadas diretamente entre aplicativos.

Resumo

Com este método, criosecções consecutivos são coletadas para permitir que ambas as aplicações de microscopia para a histologia do tecido e enriquecimento do RNA para a expressão do gene usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. Normalmente, é um desafio para alcançar a homogeneização adequada de amostras de músculo esquelético pequenas porque os volumes de tampão pode ser muito baixa para aplicações de moagem eficientes, mas sem ruptura mecânica suficiente, a arquitetura do tecido denso de limites musculares penetração de reagentes tampão, em última análise, causando baixo rendimento RNA. Seguindo o protocolo aqui relatado, 30 um secções são recolhidas e combinadas permitindo cryosectioning e subsequente homogeneização agulha para mecanicamente perturbar o músculo, aumentando a área de superfície exposta para a penetração tampão. As principais limitações da técnica é que ela exige um criostato, e é relativamente baixa taxa de transferência. No entanto, o RNA de alta qualidade pode ser obtido a partir de pequenas amostras de m reunidascriocortes uscle, tornando este método acessível para muitos músculos esqueléticos e de outros tecidos diferentes. Análises Além disso, esta técnica permite combinados (por exemplo, exame histopatológico dos tecidos e expressão de genes) de regiões adjacentes de um único músculo esquelético de modo que as medições podem ser diretamente comparados entre aplicativos para reduzir a incerteza experimental e para reduzir as experiências com animais replicativas necessárias para obter uma pequena de tecido para múltiplas aplicações.

Introdução

O objetivo desta técnica é fazer várias análises experimentais por diferentes modalidades, como histologia e expressão gênica, acessíveis a partir de um único tecido esquelético pequena fonte muscular. Microscopia aplicações são as mais sensíveis para amostrar os métodos de conservação, que devem ser cuidadosamente controlados para limitar a formação de artefactos de cristais de gelo durante a criopreservação. Assim, o desenvolvimento do método baseia-se no músculo tibial anterior (TA) músculo congelado parcialmente coberto com a incorporação de um banho de resina em 2-metilbutano -140 ° C líquido arrefecido com azoto como o material fonte para microscopia de imunofluorescência e a expressão do gene análises.

A necessidade de utilizar o mesmo material de origem de diversas abordagens técnicas é particularmente importante para as experiências com base em injecção intramuscular em que os músculos para a esquerda e direita representam condições diferentes, um experimental e um controlo. Por exemplo, em estudos de regeneração muscular, um muLECS é injectado com uma toxina para causar dano tecidual generalizada enquanto o músculo contralateral serve como controlo injectados com veículo 1. De igual modo, os estudos de terapia génica para doenças musculares começam tipicamente com a validação do vector de terapia genética por injecção intramuscular para ser comparado com o vector vazio, ou vector não relacionado de controlo de veículo no lado contralateral 2. Portanto, não é possível a fonte de cada músculo TA para uma aplicação diferente.

As estratégias comuns para lidar com este problema são: i) a utilização de um grupo muscular diferente para cada aplicação, ii) para usar camundongos adicionais, ou iii) para cortar um pedaço do músculo para cada aplicação. No entanto, diferenças significativas entre os grupos musculares tornam difícil comparar os dados de aplicativos separados, e os animais adicionais aumentam despesa e são mal justifica se existem outras alternativas. Dividindo o músculo após a dissecação, a fonte aplicações diferentes é a melhor opção in muitos casos. No entanto, os pedaços de músculo são muitas vezes demasiado pequena para usar pulverização sob azoto líquido ou técnicas de trituração mecânica para homogeneização 2-5. Como o músculo é um tecido altamente estrutural embalado com proteínas da matriz extracelular e contráteis, homogeneização mecânica inadequada leva a um baixo rendimento de DNA posterior, RNA ou proteína. O método descrito aqui permite que pequenas quantidades de tecido de um músculo fonte para uso em múltiplas aplicações, ea inclusão de cryosectioning e agulha trituração melhora homogeneização mecânica para um melhor rendimento de RNA.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Universidade da Geórgia Institutional Animal Care e do Comitê Use sob uso de animais protocolo A2013 07-016 (Beedle).

1. Criopreservação de Músculo Esquelético Unfixed

  1. Preparação
    1. Corte da cortiça em pequenos quadrados (cerca de 1 cm x 1 cm) com uma lâmina de barbear, escrever sobre a cortiça com um marcador de ponta fina que é resistente a 2-metilbutano para identificar o mouse fonte e músculos, e fazer um corte muito raso (aproximadamente 1 mm), através da superfície superior. Insira uma lamela de plástico para dentro do corte a ser usado para orientar o tecido. Repita até que a cortiça está pronta para cada tecido a ser criopreservados.
    2. Obter azoto líquido, 2-metilbutano, resina de incorporação, termómetro de baixa temperatura, rolhas, instrumentos de dissecação, e mouse estudo.
      CUIDADO: O líquido de nitrogênio é um gás comprimido que pode explodir se aquecido. Usar um jaleco, luvas de baixa temperatura, e proteção facial adequados ao manusear líquido niTrogen; entre em contato com a pele ou os olhos pode causar queimaduras ou congelamento. 2-metilbutano é um inflamável, tóxico, saúde e risco ambiental. Use equipamento de proteção individual (jaleco, luvas, óculos de segurança), abra o recipiente de estoque em um exaustor, transferir a pequena quantidade necessária para a congelação (tipicamente 200 a 400 ml) para um recipiente separado que pode ser bem fechados, e evitar a inalação .
    3. Euthanize ratos com um método aprovado da eutanásia sob anestesia. Resumidamente, insira o mouse em uma câmara de inalação com 2,5% de isoflurano em oxigênio a partir de um vaporizador de isoflurano, esperar até 20 segundos após o mouse pára de se mover para verificar se há um reflexo pedal. Quando o reflexo pedal é negativo, eutanásia o mouse estudo realizado por deslocamento cervical 6.
      NOTA: métodos de eutanásia requerem aprovação pelo comitê de ética institucional.
    4. Retire a pele que recobre o membro posterior distal e cortou os tendões anteriores distais logo acima do tornozelo com o ponto-fino Dissetesouras ction. Segure os tendões distais com uma pinça fina e puxe para cima e em direção ao joelho durante o corte fáscia lateral, para liberar o músculo. Retire o músculo out perpendicular a partir do joelho e fazer um corte final para extirpar o músculo TA 7.
      NOTA: O músculo TA é usado aqui como um exemplo, mas qualquer rato músculo esquelético ou o coração pode ser substituído para o TA neste protocolo se apropriado aos objetivos experimentais do usuário. A única limitação é que o tecido deve ser pequena o suficiente para conseguir a criopreservação rápida toda a sua espessura; um tamanho máximo de tecido de 1 cm x 1 cm é recomendada.
    5. Repita com a outra perna, e dissecar para fora todos os outros tecidos a serem coletados. Realizar dissecção tão rapidamente quanto possível para limitar a degradação do tecido antes da criopreservação.
    6. Orient cada músculo para seções transversais sobre a sua cortiça pré-rotulados. Levante o músculo perpendicular ao cortiça com o tendão distal tocar a cortiça e o topo da ext muscularterminando de distância, na vertical pela lamela.
    7. Criopreservar todos os tecidos para análise histológica, logo que possível após a dissecação, de preferência dentro de 5 minutos, mas definitivamente não mais do que 15 min de tempo decorrido desde a eutanásia do animal de origem.
  2. criopreservação
    1. Comece o banho de arrefecimento criopreservação cinco minutos antes do final da dissecção. Pour 2-metilbutano a uma proveta de metal abertas até uma profundidade de cerca de 3 cm. Pour azoto líquido para um recipiente isolado com uma profundidade de 2 a 4 cm. Defina o copo de 2-metilbutano para o azoto líquido; o azoto irá começar a ferver. Evitar respingos de azoto no copo 2-metilbutano.
      CUIDADO: Prepare congelamento banho em um exaustor ou uma área bem ventilada.
    2. Insira um termómetro de baixa temperatura para o 2-metilbutano para monitorar a temperatura e mexa com freqüência com um garfo para garantir o esfriamento. Continuar a agitar e arrefecer até 2-methylbutane atinge -140 ° C, adicionando novo azoto líquido para o banho externo conforme necessário.
      NOTA: -140 ° C é a temperatura óptima para minimizar artefactos de cristal de gelo no músculo estriado; outros tecidos podem criopreservar melhor a diferentes temperaturas (por exemplo, cérebro, -90 ° C).
    3. Aplicar resina incorporação apenas para a parte inferior 35 - 50% do músculo onde se encontra com a rolha e a rolha cair imediatamente para o 2-metilbutano a -140 ° C. Rapidamente repetir para até 8 tecidos por lote de congelamento. Agita-se durante 30 seg, raspando a parte inferior do copo para assegurar que os tecidos não congelar para o 2-metilbutano solidificar.
    4. Use um garfo, colher entalhada ou grandes pinças para puxar cada cortiça tecido do 2-metilbutano. remover rapidamente a lamela, dab o excesso de 2-metilbutano no copo, e depois soltar a rolha de tecido para o banho de azoto exterior. Repita o procedimento para todas as rolhas restantes no copo.
    5. amostras de transferência em nitrogênio líquido ou em gelo seco paraum congelador de -80 ° C para armazenamento.
    6. Se todos os tecidos permanecem para criopreservação, repita os passos 1.2.3 a 1.2.4. Adicionar adicional de 2-metilbutano ao copo ou nitrogênio líquido para o banho exterior como necessário e re-legal para -140 ° C. Descarte utilizado 2-metilbutano como resíduos perigosos.

2. Recolher Cortes congelados para histologia e RNA Applications

  1. Preparação.
    1. Pré-pesam um tubo esterilizado DNase / livre de RNase numa balança analítica. Em seguida, movê-lo para a câmara de criostato de pré-resfriamento. Repita até que os tubos estão prontos para todas as amostras criocorte agrupados para ser coletado.
    2. Para seccionamento músculo esquelético, confirmar que a temperatura da câmara de criostato é -21 a -22 ° C por seu termostato interno. Transfira os recipientes com os tecidos a serem cortados para dentro da câmara e permitir que o recipiente (s) para equilibrar com a temperatura criostato durante pelo menos 15 min antes da abertura.
    3. Coloque uma lâmina nova criostato descartável. Como alternativa, remover a lâmina existente, spray com solução de descontaminação RNase, enxaguar com DDH 2 O, e reinserir no criostato para esfriar. Pulverize um pano limpo com álcool 70% e limpe com cuidado a plataforma de fixação da lâmina ea lâmina.
      1. Spray de um tecido limpo com uma solução de descontaminação RNase e limpe as escovas criost�icas. Spray de um tecido com ddH2O, limpe as escovas de novo e colocá-las na câmara de criostato sobre uma superfície limpa.
        CUIDADO: A lâmina criostato deve ser coberto pelo guarda faca quando não estiver em uso. Além disso, a solução de descontaminação de ARNase é tóxico e irá congelar para formar um precipitado na câmara fria criostato. Portanto, manusear com cuidado e evitar a sua utilização na câmara de criostato.
    4. Dentro da câmara de criostato, coloque uma gota centavo de tamanho (aproximadamente 300 ul) de incorporação de resina sobre um mandril espécime quente, definir uma rolha de tecido em cima da resina, pressione para baixo, e em seguida, definir o mandril na freezing ferroviária ou sobre um elemento de congelação rápida, se disponível.
    5. Após a incorporação de resina solidifica (branco), adicione resina de embebimento adicional na parte superior da rolha, ao redor do 35% inferior do tecido e pressionar o extractor de calor para a resina a incorporação de um congelamento rápido para estabilizar melhor o tecido. Esperar 5 min antes do corte para permitir que a resina a endurecer totalmente.
    6. Certifique-se de que o prendedor de amostra está na sua posição mais recuada, o mais distante da lâmina. Insira o mandril espécime de tecido para o prendedor de amostra.
  2. preparação criocorte.
    1. Solte o suporte portador da lâmina, defina o ângulo de incidência da lâmina a 10 ° (ou um ângulo apropriado para a transportadora lâmina usada), e re-apertar. Solte o freio e girar o volante para reduzir o músculo para a lâmina. Estimar a distância mais próxima entre o tecido e lâmina, em seguida, passar o tecido longe da lâmina e envolver o freio da roda mão.
    2. Solte o leve ajuste de alturaR e deslocar o porta-lâminas para a frente ou para trás, respectivamente, se a extremidade do tecido é mais do que cerca de 2 mm a partir da lâmina ou se a lâmina atinge o tecido. Apertar e diminuir o tecido novamente para verificar distância da lâmina. Repetir ajustes até que a lâmina é de 1 a 2 mm da extremidade do tecido por estimativa visual.
    3. Abaixe o tecido na direção da lâmina e avaliar ângulo de tecido para seções transversais. Bloquear a roda de mão e solte a alavanca de fixação da amostra. Empurrar o prendedor de amostra para a esquerda ou para a direita até a orientação horizontal do tecido é perpendicular à lâmina.
    4. Empurrar a amostra da braçadeira para cima ou para baixo para ajustar a orientação de "Y" de modo que as secções de tecido será perpendicular ao eixo longo do músculo. Aperte a alavanca de fixação da amostra.
    5. Use o curso e alimentação para frente bem para fazer avançar a amostra até tocar a lâmina. Se procurando seções de uma profundidade de tecido especial, redefinir a soma das espessuras de corte para zero (parte superior do tecido).
    6. Defina o criostato à função de ajuste com espessura de corte em 30 mm. Cortar e descartar secções até a profundidade pré-seleccionada para a recolha de tecido é atingido (por exemplo, 400 um a partir do topo).
  3. Recolha criosecções para extração de RNA.
    1. Abra o tubo para seções de coleta e colocá-lo perto da porta-lâmina. Utilize uma escova de pré-arrefecido, limpo para apanhar cada secção, uma vez que é cortado a partir da lâmina e transferir o criocorte para dentro do tubo. Repetir até que as secções reunidas pesar 30 mg ou a profundidade do tecido desejado seja alcançado.
      NOTA: Para uma tibial anterior de ratinho adulto, recolha de profundidade de tecido de aproximadamente 400 a 4000 uM produz tipicamente 25 - 40 mg. Utilizando uma pinça de metal para transferir seções para o tubo de recolha não é recomendado como as seções tendem a ficar e aglutinar-se na superfície do metal.
    2. Se a incorporação de resina envolve o criocorte muscular, bloquear o travão de mão e usar uma lâmina de barbear pararaspar pequenos pedaços de resina até que haja apenas uma camada fina ao redor da parte superior do músculo. resina Sempre corte com a lâmina angulada de distância a partir do músculo.
      NOTA: Uma camada fina da incorporação de resina não prejudique substancialmente a preparação de RNA a jusante. Se mais espessa resina incorporação está presente, use escovas para provocá-lo longe do músculo antes de mover o criocorte para dentro do tubo de coleta.
    3. Em alternativa, as seções piscina no porta-lâminas e transferência em massa para o tubo de recolha.
      NOTA: No entanto, este método tende a ser mais lento, e as secções são mais propensos a manter e se aglomeram, o que pode reduzir a eficiência de homogeneização agulha em etapas posteriores.
    4. colocar rapidamente o tubo criocorte combinados num grupo de equilíbrio e tubo de registro do peso analítica. devolver imediatamente o tubo para a câmara de criostato frio para manter a temperatura da secção de perto de -20 ° C. Calcule o peso das secções reunidas.
      NOTA: Se o isolamento do RNA ocorrerá em anúnciodia ifferent, armazenar o tubo criocorte reunidos à temperatura de -80 ° C até à sua utilização.
  4. Recolha criosecções para histologia.
    1. Pressione o botão espessura de corte de finos de secção e use as setas para definir a espessura de corte criostato a 7 mm (ou outra espessura de corte apropriado, tipicamente 6 a 10 mm).
      NOTA: Diluente secções (6-10 uM) deve ser utilizado para aplicações histológicas para assegurar que os reagentes de coloração pode penetrar na profundidade da secção de tecido. Secções finas pode ser feita a partir de qualquer profundidade durante a cryosectioning, mas secções mais profundos são os preferidos porque a incorporação de resina, o que aumenta com a profundidade do tecido, não afecte a coloração histológica.
    2. Cortar e descartar 4 a 7 secções para obter uma superfície consistente, mesmo tecido. Anote a profundidade do tecido.
    3. Cortar uma secção e orientá-la sobre a superfície do suporte de lâmina. Pegar a seção de por rapidamente e gentilmente tocar a quente (temperatura ambiente) lâmina de microscópioa seção sobre o portador da lâmina. Devolver a gaveta à temperatura ambiente. Continuar até se obter o número de lâminas desejados. Anote a profundidade do tecido final.
      NOTA: Coletando uma segunda secção (duplicado) para cada tecido é recomendado.
    4. Com o corte completo, engate o freio de roda de mão, devolver o espécime para a posição traseira mais, e remover o mandril de tecidos. Use o elemento de calor criostato para derreter a resina incorporação segurando a rolha de tecido na bucha espécime. Remover cortiça tecido, seque com o tecido, e voltar para armazenamento.
    5. Repita a partir do passo 2.1.2 para cada tecido remanescente. Permitir que as lâminas secar durante 20 minutos após o último tecido é montado. Em seguida, usar lâminas para análise histológica ou coloração de imunofluorescência ou congelamento a -80 ° C numa caixa de corrediça até que seja necessário.

3. Isolamento de ARN a partir da mistura Cortes congelados

  1. extração de RNA
    1. tubo de movimento (s) de criosecções reunidas para gelo. Imediatamente adicionar umreagente de extracção de ARN orgânico em uma proporção de cerca de 1 ml de reagente por 50 mg de peso criocorte, tipicamente de 600 uL por tubo.
      CUIDADO: reagentes de isolamento de RNA são tóxico, corrosivo e irritante. Siga as instruções do fabricante para um manuseamento seguro.
    2. Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 18, extrair o ARN de extracção líquido-se e lavar as paredes do tubo até que todo o tecido é suspenso na solução. Tente minimizar bolhas de ar durante a homogeneização da agulha.
    3. Utilizar a ponta da agulha para misturar e dispersar quaisquer criocortes aglutinado e peças que aderem à parede do tubo. Triturar a homogeneizar por fazer passar a amostra cima e para baixo através da agulha para cinco cursos, e depois voltar a amostra em gelo. Repita os passos tanto de três a cinco vezes, ou tantas vezes quanto for necessário para perturbar todos os aglomerados e facilmente fazer passar a amostra através da agulha.
    4. Retire a agulha de calibre 18 e substituí-lo com uma agulha de calibre 22. cuidadosamente triturate a amostra para cinco cursos, e depois voltar a amostra em gelo. Repetir a trituração de três a quatro vezes para atingir um homogenato de tecido muito finamente disperso.
      NOTA: Se as partículas de tecidos começar a bloquear a agulha aquando da elaboração da amostra, expulsar todas as amostras da seringa e voltar para a agulha de calibre 18 para posterior homogeneização. Um passo adicional de trituração com uma agulha de calibre 25 ou 26 pode ser adicionado para se obter um rendimento máximo. No entanto, a agulha pode ficar obstruído, então há um risco de derramamento da amostra.
    5. Mover a amostra de gelo até à temperatura ambiente. Incubar durante 5 min a perturbar complexos moleculares.
    6. Numa hotte, adicionar 0,1 ml de 1-bromo-3-cloropentano (BCP) por 1 ml de reagente de isolamento de ARN utilizado (passo 3.1.1), tipicamente 60 ul por tubo. Agitar o tubo vigorosamente à mão durante 15 segundos (não vortex). Incubar a amostra à temperatura ambiente durante 2 a 3 min. Em seguida, centrifuga-se durante 15 min a 12000 xg e 4 ° C.
      CUIDADO: BCP é inflamável e tóxico. Pega em um exaustor e usar luvas, jaleco e óculos de segurança.
    7. Recolher cuidadosamente a fase aquosa superior (incolor) contendo ARN e transferi-lo para um tubo limpo. Adicionar um volume igual de etanol a 70% (em água com DEPC) e agitar com vortex para misturar. Incubar à temperatura ambiente durante até 10 min.
      NOTA: interfase meio e fases de fenol-BCP inferiores podem ser processadas para o ADN genómico e proteína, respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante ou recolhidos em um recipiente de resíduos perigosos fenol-BCP para descarte apropriado.
  2. purificação de ARN.
    1. Siga as instruções do fabricante para a ligação de exemplo, lavagem e eluição com pequenas variações 8. Por exemplo:
    2. Coloque uma alíquota de água DNase / RNase em um banho C 37 ° ou incubadora para pré-aquecer para a etapa 3.2.4.
    3. Adicionar a amostra de ARN a partir de 3.1.8 acima para uma coluna de purificação e centrifugar a amostra durante 15 sega 12.000 x g à temperatura ambiente. Verter o fluxo através de volta para a mesma coluna e re-centrifugação. Repetir um tempo adicional para maximizar a ligação de RNA, e em seguida, descartar o fluxo final através.
    4. Executar passos de lavagem de acordo com as instruções do fabricante 8. Aplicar 700 ul de tampão de lavagem (sem etanol) para a coluna, centrifugação durante 15 segundos a 12000 x g, e descartar o fluxo através.
    5. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem (com etanol) para a coluna, centrifugação durante 15 segundos a 12000 x g, e descartar o fluxo através. Repita este passo uma vez.
    6. Girar a coluna vazia durante 1 min a 12000 xg para secar a membrana.
    7. Transferir a coluna de rotação a um RNase- limpo, tubo livre de DNase. Adicionar 40 ul de DNase água pré-aquecida até / livre de RNase (a partir de 3.2.1) para o centro da membrana da coluna. À temperatura ambiente, incubar durante 2 min e, em seguida, centrifuga-se durante 2 min a 12.000 x g.
      NOTA: O volume de eluição de 40 mL é de aproximadamente 1,3 mL por mg de originaistecido para 30 mg de criocortes reunidas. Ajustar o volume de eluição, conforme apropriado para diferentes pesos de tecido de partida, mas não reduza abaixo de 32 ul. Uma segunda eluição, utilizando-se cerca de 0,7 mL por mg de tecido original, podem ser adicionados para aumentar o rendimento de ARN total.
    8. Analisar o ARN (eluição em coluna) para a concentração e a pureza por um espectrofotómetro, electroforese, e / ou um Bioanalyzer. Armazenar o ARN a -80 ° C até ser necessário para aplicações a jusante, tais como a transcrição reversa para a PCR quantitativa 4.
      NOTA: Um tratamento DNase é recomendada antes de usar o RNA em aplicações a jusante. Este tratamento pode ser realizado em algumas colunas de purificação de ARN antes do passo de lavagem, neste ponto específico na sequência de eluição em coluna ou sobre uma parte alíquota do ARN como o primeiro passo para qualquer aplicação a jusante. O ARN deve ser estável durante vários anos.

4. Análise histológica por imunofluorescência StaininCortes congelados g de músculo

  1. protocolo de imunofluorescência simples.
    1. Use uma caneta hidrofóbica dar a volta ao grupo de seções em cada slide. Gentilmente cair PBS na área circulada (aproximadamente 80 mL para uma pequena área de superfície até 500 mL de uma grande área de superfície), tomando cuidado para não tocar os tecidos. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
      NOTA: Se estiver usando lâminas congeladas, retirar as lâminas de -80 ° C congelador e incubar à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos para descongelar e seca, em seguida, proceder como acima. Pelo menos duas lâminas são necessários: uma corrediça experimental a ser incubada em anticorpo primário e secundário; e uma lâmina de controlo para o qual o anticorpo primário é excluído, o "único secundário" controle.
    2. Dica do slide para deitar fora PBS. Adicionam-se 5% de soro de burro em PBS (solução de bloqueio) à zona assinalada; ter cuidado para garantir que as seções musculares não sequem. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos (ou até várias horas numa câmara de humidade).
    3. Preparar a solução de anticorpo primário para analisar a regeneração muscular. Misturar a solução de bloqueio, com um anticorpo eMHC (01:40) e um anticorpo ColVI (1: 1000). Prepare cerca de 150 ul, 300 ul ou 500 ul para pequenas, médias ou grandes áreas de deslizamento, respectivamente. Vortex durante 5 segundos, e, em seguida, centrifuga-se durante 2 min a 15000 xg para sedimentar qualquer precipitado.
    4. Para slides experimentais, a ponta da lâmina para derramar off solução de bloqueio e, em seguida, adicione a solução de anticorpo primário a partir 4.1.3. Para a lâmina de controlo secundário, derrubar o slide para deitar fora solução de bloqueio e, em seguida, adicionar solução de bloqueio fresco (sem anticorpo). Incubar as lâminas numa câmara húmida a 4 ° C durante a noite.
      Nota: Quando as soluções de anticorpo pipetando em lâminas, sempre puxar o líquido a partir do topo do tubo de solução de anticorpo primário, não perturbar qualquer precipitado no fundo do tubo.
    5. Dica desliza para derramar off solução. Adicionar PBS gota a gota, a região circulada de cada slide para lavar, ponta para derramaroff, em seguida, adicionar mais PBS e incubar durante 3 a 5 min. Repetir para um total de três lavagens.
      NOTA: O tempo de lavagem é bastante flexível e pode ser alongado até 20 min, se desejar. Geralmente, o número de mudanças de solução é mais importante do que o tempo.
    6. Preparar a solução de anticorpo secundário para todas as lâminas (incluindo a lâmina de controlo secundário), utilizando uma diluição 1: 500 de anticorpos secundários acoplados-fluoróforo verde e vermelha para detectar IgG1 de ratinho (eMHC) e IgG de coelho (ColVI) e 1: 10000 de diluição de DAPI nuclear mancha.
      1. Por exemplo, mistura 1 ml de DAPI com 9 ul de ddH2O para obter uma diluição de 1:10 de solução DAPI. Então, para um volume final de 500 ul, adicionar 1,0 ul de anti-IgG1 de ratinho-vermelha + 1,0 ul de anti-IgG de coelho-verde + 0,5 mL de 01:10 DAPI para 447,5 ul de solução de bloqueio. Vortex para misturar e centrifugar durante 2 minutos a 15,000 xg para sedimentar qualquer precipitado.
        NOTA: Idealmente, todos os anticorpos secundários devem ser da mesma espécie hospedeira.
    7. Dica os slides para deitar fora a última lavagem PBS. Adicionar solução de anticorpo secundário para cobrir todos os tecidos. Cobrir as lâminas para as proteger da luz e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
      NOTA: Todos os anticorpos secundários devem ser validados para ter reatividade cruzada mínima com outras espécies em experiências de marcação dupla.
    8. Lavar as lâminas, tal como descrito em 4.1.5. Após a última lavagem, a ponta da lâmina para deitar fora da PBS e definir o slide em um tecido. Adiciona-se 3 a 4 gotas de um meio de montagem aquoso ao longo de um lado.
    9. Definir a aresta de uma lamela de vidro apenas para a borda externa do meio de montagem. Utilizando uma pinça, abaixe lentamente a lamela para os tecidos e, em seguida, solte a lamela e bata suavemente em sua posição. Finalmente, pressione suavemente cada canto da lamela para estabilizá-lo.
    10. Proteger os slides da luz e armazenar a 4 ° C até o uso.
      NOTA: Para o armazenamento a longo prazo, aplicar uma camada fina de unha polonês ao longo da borda do the lamela para ajudar a prevenir o slide de secagem.
  2. A avaliação histológica.
    1. Imagem os slides usando um epifluorescência ou microscópio confocal com filtros adequados para detectar eMHC (vermelho); ColVI (verde); e núcleos (azul) DAPI-manchado, tipicamente utilizando uma objectiva de 20X 1,5.
    2. Confirmar que o sinal de fluorescência a partir de lâminas experimentais é diferente a partir da lâmina de controlo secundário para demonstrar a especificidade do eMHC e ColVI detecção 4.
      NOTA: eMHC fibras em regeneração positivos deve ser visível a partir de cerca de 2 a 7 dias após uma lesão muscular e variavelmente em camundongos com distrofia muscular. Collagen VI está presente na matriz extracelular que rodeia as fibras musculares, vasos sanguíneos, nervos e e nos feixes de tecido conjuntivo maiores de peri- e epimísio. corante nuclear DAPI é útil para identificar as fibras musculares com núcleos centrais contra núcleos periféricos indicando a regeneração da fibra, e a presença de infiltrating células. fibras necróticas ou feridos podem manchar fracamente com o anticorpo secundário IgG de ratinho devido à detecção de IgG endógeno que penetra nas fibras do músculo através de membranas danificadas.
    3. Para quantificar a regeneração, tomar sobrepostas microscópio fotos com cada filtro fluorescente por toda a imagem. Unir as imagens eMHC, ColVI e DAPI para cada local e em seguida, alinhe as imagens para reconstruir um mapa de toda a secção 1,5.
    4. Utilizando um software de análise, contar o número de fibras eMHC positivos e o número de fibras no total para calcular a regeneração recente (100 * (# eMHC + fibras / fibras no total) #). Além disso, a contagem do número de fibras para fora centralmente nucleadas do total de fibras para medir a regeneração durante um período mais longo (fibras 100 * (# fibras NC + / # total) 1,5).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

RNA criocorte muscular está em alta qualidade e proporciona um rendimento suficiente para a maioria das aplicações

As análises de dezasseis preparações de ARN do músculo esquelético estão apresentados na Tabela 1, utilizando 19,4 a 41 mg do músculo tibial anterior em pool (TA) a partir de 8 ratinhos de controlo. Tanto para a esquerda (L) e direito (R músculos) TA foram preparados em experiências de regeneração co...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Para obter os melhores resultados com este método, manter a incorporação de resina restrita ao terceiro ou inferior a metade do músculo durante a criopreservação de tecido porque o excesso de resina vai retardar a recolha dos criocortes reunidas e pode aumentar a incorporação de contaminação resina no isolamento de ARN. Além disso, muita atenção durante a homogeneização da agulha é importante para maximizar o rendimento e minimizar a probabilidade de entupimento da agulha. O protocolo pode ser modificado através da util...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

A autora declara que não tem interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre e Junna Luan forneceram assistência técnica. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de concessão AR065077. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva do autor e não representa necessariamente as opiniões oficiais do National Institutes of Health.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CortiçaVWR Scientific23420-708Corte em pequenos quadrados com uma lâmina afiada.
Lamínula de plásticoFisher Scientific12-547Usado para orientar o músculo durante o congelamento.
Termómetro de baixa temperaturaVWR Scientific89370-158
2-metilbutanoSigmaM32631-4LCuidado: produto químico perigoso. Armazene em armário inflamável.
Resina de incorporação: "criomatrix"Thermo Fisher Scientific6769006Outras resinas de incorporação podem ser substituídas pela criomatrix.
CryostatThermo Fisher Scientificmicrom HM550 com suporte de lâmina descartávelQualquer criostato de trabalho deve ser suficiente para o protocolo.
Lâmina de criostato descartávelThermo Fisher Scientific3052835Use uma lâmina ou faca apropriada para o criostato a ser usado.
Solução de descontaminação de RNAse: "RNase Zap"Thermo Fisher ScientificAM9780
Balança analíticaMettler ToledoXS64
PincelDaler Rowney214900920Use para manusear criossecções. Pode ser encontrado em lojas com materiais de arte simples.
Lâmina de barbearVWR Scientific55411-050
Lâmina de microscópioVWR Scientific48311600
Reagente de extração orgânica de RNA: TRIzolThermo Fisher Scientific15596026Cuidado: O TRIzol é um produto químico perigoso. Nota: Apenas reagentes de extração orgânica são recomendados para extração de RNA do músculo esquelético.
Agulha de calibre 18VWR ScientificBD305185
Agulha de calibre 22VWR ScientificBD305155
Agulha de calibre 26VWR ScientificBD305115Opcional. Pode ser usado para uma terceira rodada de trituração de amostras no protocolo de extração de RNA.
Seringa de 1 mlVWR ScientificBD309659Para amostras de valor muito elevado, recomenda-se uma seringa Luer-Lok (por exemplo, VWR BD309628).
1-bromo-3-cloropentano (BCP)SigmaB9673
Para 70% de etanol em água DEPC: 200 álcool à provaDecon Laboratories, Inc.+M18027161MMisture 35 ml de álcool 200 proof + 15 ml de água DEPC. 
Para etanol a 70% em água DEPC: água tratada com DEPCThermo Fisher ScientificAM9922Misture 35 ml de álcool 200 + 15 ml de água DEPC.
Kit de purificação de RNA: Minikit de RNA PureLinkThermo Fisher Scientific12183018AEtapas finais da preparação do RNA.
Água livre de DNase/Rnase com Gibco10977DEPC também pode ser usada.
Espectrofotômetro: Nanodrop 2000Thermo Fisher ScientificNanoDrop 2000
Dnase IThermo Fisher ScientificAM2222Trate o RNA purificado para remover qualquer contaminação do DNA antes das aplicações a jusante.
Caneta hidrofóbicaThermo Fisher Scientific8899
Dulbecco's PBSGibco14190PBS para protocolo de imunofluorescência.
Soro de burroJackson ImmunoResearch Laoratories, Inc017-000-121Reidrate o estoque normal de soro de burro de acordo com as instruções do fabricante, depois dilua uma alíquota a 5% para imunofluorescência.  Soro de cabra normal também pode ser usado.
anticorpo eMHCUniversidade de Iowa Estudos de Desenvolvimento Banco de HibridomaF1.652
Anticorpo de colágeno VIFitzgerald Industries#70R-CR009x
Burro anti-coelho AlexaFluor488Thermo Fisher ScientificA21206
Cabra anti-rato IgG1 AlexaFluor546Thermo Fisher ScientificA21123
DAPI (4',6- diamidino-2-fenilindol)Thermo Fisher ScientificD1306
Meio de montagem aquoso: PermafluorThermo Fisher ScientificTA-030-FMUse apenas meios de montagem projetados para aplicações fluorescentes com propriedades anti-desbotamento.
Lamínula de vidroVWR Scientific16004-314Utilização para montagem de lâminas no final do protocolo de imunofluorescência
Software de análise de imagem: ImageProExpressMedia Cybernetics, Inc.Image-Pro Express ou produtos mais avançadosFreeware ImageJ também devem funcionar para contagem manual. Softwares mais avançados com capacidades de segmentação podem permitir a automação parcial do processo; por exemplo, ImageProPremier.
Mesclar e mapear imagens de seção: PhotoshopAdobePhotoshop
CardiotoxinaSigmaC9659Sigma C9659 foi descontinuado. Outras opções de cardiotoxina são EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; ou Ge Script # RP17303; mas estes não foram validados.
kit de transcrição reversa: Sistema de síntese de primeira fita sobrescrito IIIThermo Fisher Scientific18080051Podem ser usados quaisquer reagentes de transcrição reversa validados e de alta qualidade.
PCR padrão: Sistema de polimerase GoTaq FlexiPromegaM8298Qualquer sistema de polimerase Taq validado e de alta qualidade pode ser usado. Se o sequenciamento de DNA for usado para qualquer aplicação a jusante da PCR, um sistema de PCR de alta fidelidade deve ser usado.
SYBR verdeThermo Fisher ScientificS7585Para uso em qPCR quando não estiver usando uma mistura mestre de qPCR dedicada. Use com SuperROX (para instrumentos da Applied Biosystems) e polimerase e tampões GoTaq Flexi.
ROX: SuperROX, 15 mMBioResearch Technologies, Inc. Novato CASR-1000-10SuperROX é mais estável na reação de PCR, por isso é preferível para uso como um corante de referência passiva qPCR em vez de ROX (carboxi-X-rodamina). Para qPCR com instrumentos da Applied Biosystems
em tempo real AppliedBiosystems7900HT
A água tratada PCR

Referências

  1. Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).
  2. Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
  3. Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
  4. Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
  5. Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20(2016).
  6. AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx 1-102 (2013).
  7. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
  8. Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211(2010).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).
  10. Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
  11. Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
  12. Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
  13. Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20(2015).
  14. Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
  15. Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
  16. Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
  17. Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
  18. Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Extra o de RNAAn lise Histol gicaHomogeneiza o de TecidoHomogeneiza o com AgulhaCriose es AgrupadasTibial Anterior de CamundongoSeccionamento de Tecido
Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.