Uso da técnica de sobreposição de Soft-agar para triagem de compostos inibidores produzida por bactérias

Resumo

Descrevemos um método simples de triagem de culturas bacterianas para a produção de compostos inibidores de outras bactérias.

Resumo

A técnica de sobreposição-ágar mole foi originalmente desenvolvido mais de 70 anos atrás e tem sido amplamente utilizada em várias áreas de investigação microbiológica, incluindo o trabalho com bacteriófagos e bacteriocinas, agentes antibacterianos proteicas. Esta abordagem é relativamente barata, com o mínimo de requisitos de recursos. Esta técnica consiste em detectar sobrenadante a partir de uma estirpe dadora (potencialmente tóxico que alberga um composto (s)) sobre uma camada de agar macio solidificada que é semeado com uma estirpe bacteriana de ensaio (potencialmente sensíveis ao composto tóxico (s)). Nós utilizamos esta técnica para rastrear uma biblioteca de Pseudomonas syringae estirpes de morte intra-específica. Ao combinar esta abordagem com um passo de precipitação e deleções de genes-alvo, vários compostos tóxicos produzidos pela mesma estirpe podem ser diferenciadas. Os dois agentes antagônicos comumente recuperados usando esta técnica são bacteriófagos e bacteriocinas. Estes dois agentes podem ser diferenciadas usandodois testes adicionais simples. A realização de uma diluição em série de um sobrenadante contendo o bacteriófago resultará em placas individuais se tornando menos em número com uma maior diluição, enquanto que a diluição em série de um sobrenadante contendo bacteriocina resultará uma zona de compensação, que se torna mais uniformemente turvo com uma maior diluição. Além disso, um bacteriófago vai produzir uma zona de compensação, quando visto numa camada de agar macio fresco semeada com a mesma estirpe, ao passo que uma bacteriocina não vai produzir uma zona de compensação, quando transferidos para um relvado agar mole fresco, devido à diluição da bacteriocina.

Introdução

Recentemente, tem havido um interesse significativo em aprofundar a compreensão da ecologia microbiana (particularmente os microbiomas de vários ambientes), bem como novos compostos anti-bacterianos para uso no combate a agentes patogénicos resistentes aos antibióticos ^1,2. Um tema de interligação entre estes interesses é compreender as interacções antagonistas entre estirpes de bactérias em seu ambiente natural. Há inúmeras maneiras em que as bactérias antagonizam concorrentes ^3. Bacteriocinas, um grupo diversificado de compostos proteicos, antibacterianos, têm sido estudados para determinar seu papel na mediação antagonismo interbacterial, com duas das espécies mais estudadas sendo Pseudomonas aeruginosa ^4,5 e Escherichia coli ^6, importantes patógenos humanos. Além de bacteriocinas, profagos induzidas também podem agir como agentes anticompetitor, permitindo uma estirpe para invadir um nicho que já é colonizada ^7. Pseudomonas syringae é um agente patogénico de plantas conhecido por produzir uma variedade de agentes antimicrobianos, incluindo bacteriocinas única proteína ^8, bacteriocinas derivado de cauda de bacterióf agos ⁽⁹ tailocins denominados), bem como metabolitos secundários não proteináceos ^10. Recentemente, tem havido interesse em compreender como estes antimicrobianos influenciar a ecologia deste organismo, bem como a forma como eles podem ser aproveitados para controlar doenças de plantas ^11.

Um método amplamente utilizado para estudar ambos bacteriocinas e bacteriófago é a técnica de sobreposição de soft-agar. Este método foi descrito pela primeira vez por Gratia em 1936 para a ajuda ao enumerar bacteriófago ^12,13.

Aqui descreve-se a aplicação do método da sobrecamada de ágar mole, em combinação com a manipulação genética direccionada e polietileno glicol precipitação (PEG), para distinguir entre os três agentes antimicrobianos diferentes (um bacteriófago, um elevado peso molecular Bacteriocin, e um baixo peso molecular bacteriocina) produzido por uma única estirpe bacteriana. A vantagem dessa abordagem é que é relativamente simples e barato, que é por isso que, apesar de ser decididamente 'low-tech', ainda é amplamente utilizado.

Protocolo

1. Preparação de sobrenadante a ser testados à actividade

1. Prepara-se uma solução de estoque de 0,5 mg / ml de mitomicina C por dissolução da quantidade apropriada em M estéril _MgSO4 tampão de 0,1 (por exemplo, 1 mg de mitomicina C / 2 ml de tampão). estoque Armazenar a 4 ° C num recipiente protegido da luz (mitomicina C é sensível à luz).
2. Inocular uma única colónia de P. syringae em 3 ml de meio B de King (KB) de caldo ^14. Incubar durante a noite com agitação (200 rpm) à temperatura ambiente (21-25 ° C).
3. Na manhã seguinte, dilui-se a cultura de caldo de 1/100 em 3 ml de caldo fresco KB. Incubar durante 3-4 horas com agitação à temperatura ambiente. Adicionar mitomicina C (0,5 ug / ml, concentração final). Incubar a cultura durante a noite com agitação à temperatura ambiente.
   NOTA: A mitomicina C provoca quebras de ADN de cadeia dupla, estimulando assim a resposta SOS da célula, levando à produção de ambos bacteriófago e bacteriocinas.
4. Pellet 1-2 ml de mitomicina C culturas induzidas por centrifugação a 20000 xg durante 5 minutos numa microcentrífuga de bancada.
5. Remover e esterilizar os sobrenadantes da cultura, quer por passagem do sobrenadante através de um filtro de tamanho de poro de 0,22 um, ou por tratamento do sobrenadante com clorofórmio (100 ul de clorofórmio por cada 1 ml de sobrenadante).
   1. Se usando clorofórmio, vortex a mistura durante 15 segundos e deixar incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Após a incubação, centrifugar a mistura a 20000 xg durante 5 min.
      NOTA: Clorofórmio eficazmente mata células por solubilização de suas membranas. O benefício da utilização de clorofórmio, durante a esterilização de filtro é que é mais barato e mais fácil de dimensionar-se se o processamento de muitos (> 20) amostras de cada vez. Pode haver uma possibilidade de que uma dada actividade de morte é perdido após o tratamento com clorofórmio como resultado da partição para a fase orgânica.
   2. Remover a fase superior, aquosa, utilizando uma pipeta de 1 ml para um fresco, esterilizado de 1,5 ou 2,0 mltubo de microcentrífuga. Tenha cuidado para não transferir qualquer da camada de clorofórmio inferior (que é melhor para remover menos da fase aquosa para evitar carry-over).
   3. Incubar o sobrenadante transferido destampei em um exaustor para permitir que o clorofórmio residual para evaporar (várias horas). sobrenadantes armazenar a 4 ° C.

2. Separação e Concentração de Elevado Peso Molecular Os compostos bactericidas por polietilenoglicol (PEG) Precipitação

1. Para o sobrenadante estéril, adicionar NaCl e PEG 8000 a concentrações finais de 1 H e 10%, respectivamente. Repetidamente inverter a amostra até que tanto o NaCl e PEG são completamente dissolvido. Incubar as amostras num banho de gelo durante 1 hora ou durante a noite a 4 ° C.
2. Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C. A pelete deve formar, na parte inferior do tubo de centrifugação. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em volume desejado (por exemplo, 1/10 ou 1/100 do volume original é sobrenadanteUME) de tampão (Tris 10 mM, _MgSO4 10 mM, pH 7,0) por pipetagem repetida.
3. Remover PEG residual por duas extracções sequenciais com um volume igual de clorofórmio.
   1. Combinar clorofórmio com o sedimento ressuspenso e vortex durante 10 a 15 segundos, em seguida, centrifuga-se a mistura a 20000 xg durante 5 min. Transferir a fase superior, aquosa para um tubo de microcentrífuga novo. Repetir esta extracção até branco sem interface entre a fase aquosa e orgânica é visível (normalmente 2 extracções no total). Permitir clorofórmio residual a evaporar-se a partir de sobrenadantes extraídos numa hotte.

3. Preparação de sobreposição e Testes sobrenadantes para Atividade

1. Inocular uma colónia isolada de uma estirpe de P. syringae a ser testada para a sensibilidade em 3 mL de KB, incubar durante a noite com agitação à temperatura ambiente.
2. Na manhã seguinte, de volta diluir a cultura 1/100 em KB fresco. Incubar 3-4 horas com agitação a temperatu quartoré.
3. Prepare agar água esterilizada por autoclavagem uma suspensão 0,35-0,7% de agar em água ultrapura (v / w).
   NOTA: Um estoque de agar água macia pode ser derretido em um forno de microondas e reutilizado várias vezes, sobreposição fresco não precisa estar preparado para cada experimento. Se agar água é reutilizada, é fundamental para garantir que ele é completamente derretido seguinte microondas. Se não, a sobreposição terá uma textura granulada mediante solidificação que vai fazer difícil interpretação. Se isto ocorrer, derreter o agar durante vários minutos mais longos do que no microondas feito anteriormente.
4. Manter o agar mole fundido num banho de água a 60 ° C antes de usar. Usando uma pipeta serológica estéril, transferência de 3 ml de agar mole para um tubo de cultura estéril. Devolver o tubo de cultura com banho de água para manter num estado fundido.
5. Para verter a superposição, primeiro permitir que o agar derretido para se refrescar (que deve sentir-se quente, mas não quente ao toque), mas não permita solidificar.
6. Numa hote estéril, inocular 100 ml dea cultura da estirpe de teste em agar mole e agitar com vortex para misturar. Gire a cultura com a mão por 10-15 segundos, em seguida, despeje em um agar de fundo (KB agar). Inclinar a placa em todas as direcções para garantir o agar mole cobre uniformemente o ágar de fundo.
   NOTA: O ágar de fundo pode ser qualquer (1,5% de agar) meio solidificado em que a estirpe de teste cresce vigorosamente. Para um diâmetro de 100 mm numa caixa de Petri padrão, utilizar ~ 20 ml de meio derretida. O ágar de fundo pode ser preparado de várias semanas antes do tempo (se mantida a 4 ° C sem secagem) ou podem ser preparadas no mesmo dia. Se preparou o mesmo dia em que realizar a sobreposição, é melhor fazê-lo antes do passo 3.4.
7. Cobrir a placa e permitir que ele 20-30 minutos para solidificar. Tenha cuidado para não perturbar o prato enquanto solidificando.
8. Uma vez solidificado, spot 2-5 jul de sobrenadante (gerado nas secções 1 e 2, acima) sobre a sobreposição. Permitir que as placas a incubar durante a noite à temperatura ambiente. Observe e resultados recordes na manhã seguinte.
   Anotepode ser útil para realizar e identificar a partir de uma diluição em série do sobrenadante. Isso permitirá que os pesquisadores a distinguir entre bacteriófagos e da atividade de compensação bacteriocina. Neste caso, recomenda-se realizar a 1: 5 ou 1:10 diluições.

Resultados

A combinação da camada de agar macio e precipitação com PEG pode ser utilizado para identificar e caracterizar diferentes agentes antimicrobianos produzidos pela mesma estirpe. A Figura 1 mostra duas estirpes de P. syringae (A e B) que são inibidas por uma terceira estirpe da mesma espécie. As duas estirpes, no entanto, são inibidos por diferentes bacteriocinas. A zona de clareira na estirpe A exibe uma borda afiada, enquanto que a zona de clareira na estirpe B é maior, e exibe uma borda não afiada. manipulações genéticas dentro da estirpe produtora que, especificamente inactivar ou o tailocin (tailocin deficiente) ou baixo peso molecular bacteriocina confirm (bacteriocina deficiente) que estirpes A e B são sensíveis às bacteriocinas distintas. A Figura 2 mostra que a morte mediada por de bacteriófago podem ser distinguidos de outros agentes antimicrobianos não-replicativas comparando uma série de diluição. Porque ambas as bacteriocinas eprofago pode ser induzida por tratamento mitomicina C, as actividades destes dois agentes podem se assemelham uns aos outros (em particular se o fago activado é abundante). No caso de compensação mediada por bacteriófagos, a diluição do sobrenadante vai resolver em placas individuais de compensação (zonas) enquanto compensação bacteriocina mediada não resolver em tais placas.

Figura 1: diferenciação fenotípica de vários agentes anti-microbianos produzidos pela mesma estirpe. A estirpe A é sensível a uma bacteriocina de elevado peso molecular (tailocin), mas não um peso molecular baixo alternativa bacteriocina, tal como evidenciado pela falta de compensação na estirpe deficiente tailocin, mas não a bacteriocina estirpe deficiente. Por outro lado, a estirpe B é insensível à tailocin, mas é sensível à bacteriocina baixo peso molecular. O tailocin é efficiently recuperado após precipitação com PEG, enquanto bacteriocinas de baixo peso molecular não são. WT = tipo selvagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A distinção entre antimicrobianos não-replicativas e bacteriófagos. (A) A diluição de um alto título de bacteriófagos resultados em placas individuais que se tornam menos numerosas (topo de título elevado, baixo título inferior). (B) Diluição de bacteriocinas resultado em uniformemente menos compensação que não se resolve em placas individuais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A técnica de sobreposição-ágar mole descrita aqui tem sido amplamente aplicada por muitas décadas por pesquisadores interessados ​​em bacteriófagos ou bacteriocinas. Os principais benefícios desta abordagem é que ela é simples, barato e relativamente fácil de interpretar. Ao combinar a sobreposição soft-agar com precipitação com PEG e diluição em série, os agentes antimicrobianos podem ser separados em elevado vs agentes de baixo peso molecular, e replicativas versus não-replicativo agentes (isto é, contra bacteriófagos tailocin, respectivamente). Finalmente, a incorporação de manipulação genética alvo (supressão e complementação) de bacteriocina putativo ou loci profago firmemente pode determinar a identidade de um dado composto antagonista. Nós temos usado recentemente este método para descrever um novo bacteriófago derivado bacteriocina prevalente entre Pseudomonas syringae estirpes ^9.

Os meios de crescimento e condições indicadas neste trabalho protocolo bem para Pseudomonas syringae e provavelmente suficiente para outras bactérias gram-negativas que crescem vigorosamente sob estas condições. No entanto, os investigadores usam este método vai quer para optimizar o tempo, o meio de cultura, o método de indução, temperatura de incubação e para o seu sistema. Os parâmetros críticos incluem induzir a produção de cultura, enquanto na fase logarítmica de crescimento, bem como a sobreposição semeando soft-agar com cultura em fase logarítmica suficiente para assegurar uma distribuição uniforme bacteriana, mas não excessiva da cultura, o que irá obscurecer zonas de compensação potenciais. Existem muitas bacteriocinas que não são induzidos como parte da resposta SOS, mas sim são induzidos através de sistemas de sensor de quorum baseados em péptidos (particularmente bacteriocinas Gram-positivas ^15), assim, um investigador pode querer rastrear vários métodos diferentes de indução (tais como a modificação do conteúdo de nutrientes de induzir médio, ou permitindo a incubação prolongada da estirpe produtora).

quando se utilizaNesta técnica, a sobreposição soft-agar deve ser completamente derretida e mantida a 55-60 ° C antes da adição da estirpe semeadura. Tivemos várias experiências em que o agar mole não foi completamente derretido (embora visualmente parecia ser) e resultou em uma sobreposição com um aspecto granulado. Os resultados de um granulado de sobreposição pode ainda ser geralmente interpretável, no entanto, esta é dependente da força de inibição (inibição mais fraca será mais difícil de observar). Um, variável de confusão final a considerar quando se utiliza esta técnica é que a temperatura do fundido de ágar é permitido tempo suficiente para arrefecer antes da inoculação com a estirpe de sementeira, de modo a evitar a morte da estirpe de semeadura. Para evitar esse problema, podemos garantir a-agar macio é quente, mas não quente, ao toque. Ao longo destas linhas, também observamos que se dar tempo inadequado para uma cultura de semeadura para se aclimatar ao agar fundido, antes de despejar a sobreposição, recuperamos geralmente pobres g bacterianaRESCIMENTO, o que torna a interpretação de inibição específica difícil ou impossível de interpretar. É por isso que permitem 10-15 segundos adicionais de incubação entre vórtex e despejando a sobreposição. O trade-off entre a manutenção do agar em um estado completamente fundido (mais quente é melhor), mas não letal para a estirpe semeadura (mais quente não é melhor) é aquele que provavelmente terá de ser determinada por um investigador através de tentativa e erro.

Se um passo de precipitação de PEG é utilizada, seria benéfico incluir um controlo negativo, onde um meio de caldo estéril é processado identicamente ao sobrenadante da cultura. Isto irá assegurar que matar actividade não é o resultado de PEG residual ou clorofórmio dentro do sobrenadante da amostra.

Como ambos os bacteriófagos e bacteriocinas tendem a ser altamente específico, não é incomum encontrar nenhuma actividade de morte aparente, com uma dada combinação de estirpes. Isto pode resultar de uma variedade de re-específica estirpemecanismos sistência, sendo um deles de que a tensão testador quer faltas ou tem uma versão não reconhecida do receptor necessário para a segmentação por um determinado bacteriocina ou bacteriófago.

Um método alternativo, o método de rastreio de bacteriocina foi descrito por Kawai et al. , Mas sofre de desvantagens e não foi amplamente adotado ^16. Especificamente, esta técnica requer observando amostras de caldo a intervalos de tempo que pode ser pesada, e não permite a discriminação entre as actividades de matança de bacteriófagos derivada e derivada bacteriocina.

As principais limitações desta técnica é que ele não é bem adequado para os organismos que não crescem de forma robusta (e, assim, faltará zonas de compensação facilmente discerníveis), ou que prophages porto ou bacteriocinas que não são robustamente produzidos sob condições de laboratório. Adaptação desta técnica para detectar bacteriocinas produzidas em amostras ambientais que tanto expandir o utilitáriodesta técnica e facilitar um maior conhecimento sobre o papel das bacteriocinas dentro de ambientes naturais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mitomicina C	Santa Cruz Biotecnologia	sc-3514	Carcinogênico. use EPI apropriado (ou seja< / em> luvas, proteção para os olhos e máscara facial), principalmente ao preparar a solução estoque.
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	34854	Agudamente tóxico, risco respiratório. Use EPI apropriado (luva e protetor ocular), manuseie recipientes abertos dentro de um exaustor químico.
Ágar Polietilenoglicol (PEG)	Amresco	0159
Ágar de grau bacteriológico	Genesee Scientific	20-274