Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese

Resumo

A termoforese em microescala (MST) é uma tecnologia sensível para caracterizar as interações aptâmero-alvo. Este manuscrito descreve um protocolo MST para caracterizar as interações aptâmero-pequenas moléculas.

Resumo

A caracterização das interações moleculares em termos de parâmetros básicos de ligação, como afinidade de ligação, estequiometria e termodinâmica, é uma etapa essencial na ciência básica e aplicada. A termoforese em microescala (MST) é um método biofísico sensível para obter essas informações importantes. Contando com um efeito físico chamado termoforese, que descreve o movimento das moléculas através de gradientes de temperatura, essa tecnologia permite a determinação rápida e precisa dos parâmetros de ligação em solução e permite a livre escolha das condições de tampão (de tampão a lisados/soros). O MST usa o fato de que uma molécula não ligada exibe um movimento termoforético diferente de uma molécula que está em complexo com um parceiro de ligação. O movimento termoforético é alterado no momento da interação molecular devido a mudanças no tamanho, carga e hidratação da casca. Ao comparar os perfis de movimento de diferentes proporções moleculares dos dois parceiros de ligação, informações quantitativas como afinidade de ligação (pM a mM) podem ser determinadas. Mesmo interações desafiadoras entre moléculas de tamanhos pequenos, como aptâmeros e pequenos compostos, podem ser estudadas pelo MST. Usando a interação do modelo bem estudada entre o aptâmero de DNA DH25.42 e o ATP, este manuscrito fornece um protocolo para caracterizar as interações aptâmero-moléculas pequenas. Este estudo demonstra que o MST é altamente sensível e permite o mapeamento do sítio de ligação do aptâmero de DNA de 7,9 kDa à adenina do ATP.

Introdução

A interacção entre as moléculas é a base da natureza. Assim, os cientistas em diversas áreas de pesquisa básica e aplicada tentar entender os princípios fundamentais de interacções moleculares de diferentes tipos. MicroScale termoforese (MST) permite aos cientistas realizar a caracterização rápida, precisa e de custo eficiente e de qualidade controlada de interações moleculares em solução, com uma livre escolha de buffers. Já existem mais de 1.000 publicações utilizando MST, a partir de 2016 sozinho, descrevendo diferentes tipos de análises, incluindo rastreios de bibliotecas, a ligação validações de eventos, ensaios de competição, e experimentos com múltiplos parcei....

Protocolo

1. Preparação de Trabalho Aptamer a Bolsa

1. Seguir as instruções do fabricante e dissolve-se o oligonucleótido (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, a sequência de referência ¹⁸⁾ em água, alcançando uma concentração final de 100 uM.
2. Preparar a solução de aptâmero de trabalho por diluição da oligonucleótido a 200 nm com tampão de ligação (Tris 20 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; _MgCl2 5 mM; 0,01% Tween 20).
3. Incubar a mistura durante 2 min a 90 ° C, deixar a amostra arrefecer imediatamente para baixo sobre o gelo, e usar a amostra à temperatura ambiente.

2. Preparação da série de diluição Ligand....

Resultados

Neste estudo, o MST foi aplicado para caracterizar o local de ligação do aptâmero ADN DH25.42 ¹⁸ em ATP. Em contraste com outros estudos que caracterizam a interacção de ATP ou ATP-imitando as moléculas pequenas com as proteínas marcadas aleatoriamente com um ou mais fluoróforos ^38-40, este estudo inclui uma versão marcada do aptâmero 7,9 kDa ADNcs com uma molécula de Cy5 na extremidade 5' . Diferentes derivados de ATP e de moléculas relacionadas, todos diferind.......

Discussão

controles de qualidade:

Inespecífica colagem / adsorção do material da amostra para as superfícies, bem como os efeitos de agregação, ter uma influência dramática na qualidade dos dados de afinidade. No entanto, apenas algumas tecnologias state-of-the-art oferecem opções precisas e rápidas para monitorar e evitar esses efeitos. MST oferece controlos de qualidade integrados que detectam e ajudar a ultrapassar estes problemas, permitindo a optimização gradual da configuração técnica. informações .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
		de ligação aptâmero	20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
ATP marcado com fluorescência aptâmero	IDT, Leuven, Bélgica		sequência: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Alemanha	A2383	10 mM de soluções de estoque armazenadas a - 20 °; C
ADP	Sigma Aldrich, Alemanha	A2754	10 mM de soluções de reserva armazenadas a - 20 °; C
AMP	Sigma Aldrich, Alemanha	A2252	10 mM de soluções de reserva armazenadas a - 20 °; C
Adenina	Sigma Aldrich, Alemanha	A8626	10 mM soluções de reserva armazenadas a - 20 °; C
SAM	Sigma Aldrich, Alemanha	A7007	10 mM soluções de estoque armazenadas a - 20 &graus; C
dATP	Sigma Aldrich, Alemanha	11934511001	10 mM de soluções de reserva armazenadas a - 20 °; C
CTP	Sigma Aldrich, Alemanha	C1506	10 mM de soluções de reserva armazenadas a - 20 °; C
GTP	Sigma Aldrich, Alemanha	G8877	Soluções de estoque de 10 mM armazenadas a - 20 graus; Monólito C
NT.115	NanoTemper Technologies, Munique, Alemanha	Dispositivo MO-G008	Blue/Red Channel MST com detector padrão, Monolith NT115 pico é um dispositivo MST com detector de alta sensibilidade
Monolith NT.115 capilares Standard	NanoTemper Technologies, Munique, Alemanha	MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf	, Alemanha	30124537
Software de controle Monolith. 2.1.33, pré-instalado em o dispositivo	NanoTemper Technologies, Munique, Alemanha
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Munique, Alemanha
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software

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