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Artigo de método

Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System

14.9K vistas

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DOI:

10.3791/55078

⸱

12 de janeiro de 2017

 ,  , 
1Department of Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, National University Health System, 2Department of Urology, National University Hospital

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga ortotópico de murídeo em Ratinhos C57BL / 6J e a monitorização do crescimento do tumor.

Resumo

Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga em ratos C57BL / 6J ratinhos fêmea, utilizando a linha celular de cancro da bexiga de murino MB49, que foi modificado para secretar humano Antigénio Específico da Próstata (PSA), e o procedimento para a confirmação da implantação do tumor. Em resumo, os ratos são anestesiados usando drogas injectáveis ​​e são feitos para colocar na posição dorsal. A urina é desocupado da bexiga e 50 ul de poli-L-lisina (PLL) é instilada lentamente a uma taxa de 10 mL / 20 s utilizando um cateter de 24 g IV. É deixado na bexiga durante 20 minutos por tapando o cateter. O cateter é retirado e PLL é desocupado por uma leve pressão sobre a bexiga. Isto é seguido por instilação da linha celular de cancro da bexiga de murino (1 x 10 5 células / 50 ul) a uma taxa de 10 mL / 20 s. O cateter é tapado para evitar a evacuação prematura. Após 1 h, os ratinhos são reavivado com uma droga inversão, e a bexiga está desocupado. A taxa de instilação lenta é importante,uma vez que reduz o refluxo vesico-ureteral, o que pode causar tumores a ocorrer no tracto urinário superior e nos rins. A linha de células deve ser bem re-suspensa para reduzir a aglutinação de células, como esta pode levar à tamanhos irregulares após a implantação do tumor.

Esta técnica induz tumores com alta eficiência. O crescimento do tumor é monitorizado pela secreção urinária PSA. monitorização PSA marcador é mais fiável do que o ultra-som ou de imagem de fluorescência para a detecção da presença de tumores na bexiga. Os tumores em ratinhos geralmente atingem um tamanho máximo que afeta negativamente a saúde em cerca de 3-4 semanas, se deixados sem tratamento. Ao monitorizar o crescimento do tumor, é possível diferenciar os ratinhos que estavam curados do que aqueles que não foram implantadas com sucesso com tumores. Com a análise de ponto final, apenas, o último pode ser assumida por engano ter sido curado por terapia.

Introdução

O objetivo deste método é gerar tumores de bexiga murino ortotópico e monitorar os tumores implantados mais exacta possível, de modo que os ratos sem a implantação do tumor não são pensados ​​para ter sido curado a análise de ponto final. Em geral, o método mostrado irá reduzir a necessidade de grandes números de ratinhos para análise experimental e assegurar uma maior precisão na determinação dos resultados terapêuticos.

O desenvolvimento de um modelo ortotópico de câncer é importante, como células tumorais implantando subcutânea não recapitular o ambiente da doença clínica ou permitir o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A arquitectura da bexiga permite a instilação de terapias do cancro da bexiga directamente na bexiga com efeitos sistémicos mínimos. Assim, os modelos animais que recapitulam neste ambiente, tais como um modelo ortotópico, são importantes para avaliar novas terapias. As conclusões tiradas a partir de qualquer experimental set-up são dependenT sobre as limitações do modelo.

Diversas técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de tumores da bexiga ortotópico em murganhos. Estes dependem danificar a camada de glicosaminoglicano da bexiga, permitindo que as células tumorais a ser implantado. As técnicas utilizadas incluem a electrocauterização, o que resulta em um único ponto de dano na parede da bexiga, conduzindo ao desenvolvimento de tumores em um local na bexiga 1,2. No entanto, a taxa de sucesso da implantação do tumor usando electrocauterização é dependente do operador variando de 10 - 90%, e inclui o risco de que a parede da bexiga será perfurado, levando a desenvolver tumores na cavidade peritoneal. Cauterização química é realizada utilizando nitrato de prata, que danifica a parede da bexiga 3. Da mesma forma, o ácido foi utilizado para danificar a parede da bexiga 4. A tripsina também tem sido utilizado para danificar a bexiga, bem 5. Estes métodos podem resultar no desenvolvimento de mais de um tumor na bexiga.Além disso, existe o perigo de danos graves para a bexiga se os produtos químicos são deixados em contacto com a parede da bexiga por muito tempo. O método desenvolvido por Ninalga et ai. utiliza o poli-L-lisina carregada positivamente (PLL) 6 moléculas para o revestimento da parede da bexiga; isso permite que as células tumorais carregadas negativamente para furar a camada de glicosaminoglicanos da bexiga. Este método resulta geralmente em mais do que um tumor em desenvolvimento na bexiga, mas a implantação do tumor é a 80 - 100% 4,7. Tecnicamente, é também o processo mais fácil de executar. Para assegurar que os tumores que se desenvolvem são bastante uniforme em tamanho, é importante que as células tumorais não são agrupados em grandes aglomerados antes do implante.

A fim de avaliar a eficácia terapêutica, é melhor para realizar este estudo em ratos com tumores bastante de tamanho semelhante. Assim, um sistema de detecção de boa que pode quantificar o tamanho do tumor logo após o implante é importante. Várias estratégias têm a abelhaN utilizado para avaliar tumores. Estes incluem a imagiologia por ressonância magnética (MRI) de 8-10, de fluorescência 11, bioluminescência 12,13, ultra-sons 14, e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) 15,16. Enquanto ressonância magnética e ultra-som não requerem modificações de células tumorais, existe uma necessidade de equipamentos e agentes de contraste para ressonância magnética sensíveis. Os ensaios fluorescence-, luminescence-, e baseado em ELISA exigir a modificação das células tumorais para expressar proteínas marcadoras que podem ser detectados por estes métodos. Para luminescência, um substrato é necessária para a detecção da actividade de luciferase; Assim, existe um passo adicional e aumento de custo. Ambos luminescência e fluorescência requerem equipamento especializado. Para produzir fluorescência, proteína fluorescente verde (GFP) ciclização, a qual é catalisada por oxigénio molecular, é necessária. Assim, a expressão GFP pode ser variável dentro de uma massa tumoral dependendo do acesso ao oxigênio, tornando este um marcador pouco fiável 17. Modificação da linha de células de cancro da bexiga murino MB49 a secretar próstata humana Specific Antigen (PSA) 15,16 como um marcador substituto é outra estratégia. Esses marcadores também fornecem um meio alternativo de confirmar a presença do tumor no final da experiência, tornando-os uma alternativa à imuno-histoquímica. Este estudo relata o método PLL de implantação do tumor ortotópico e apresenta uma comparação de sistemas de detecção de tumor, isto é, ELISA, a fluorescência, e ultra-sonografia.

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Protocolo

Todos os trabalhos animais aderiu às diretrizes Comitê Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) sobre o uso de animais e manipulação (número de protocolo 084/12) da Universidade Nacional de Cingapura.

1. crescimento de células MB49-PSA in vitro e medição PSA Secreção

  1. Manter murino de cancro da bexiga células MB49-PSA 15 em completa de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mmol / l de L-glutamina, e 0,05 mg / ml de penicilina-estreptomicina, numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. Adicionou-se 200 ug / ml de higromicina B para manter a pressão de selecção de células secretoras de PSA.
  2. Para determinar a secreção de PSA, placa 1 x 10 6 células em uma placa de cultura de 6 poços e incuba-se que a 37 ° C na presença de 5% de CO 2 durante 48 h.
  3. Dois dias depois, recolher o sobrenadante para a medição da PSA.
    1. Com uma pipeta Pasteur, transferir o supernatant para um tubo de centrífuga de 15 mL.
    2. Centrifugar durante 5 minutos a 250 xg para remover as células flutuantes e detritos. Se o ensaio de PSA é realizada num dia diferente, armazenar o sobrenadante a - 30 ° C em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Se não, avançar para a próxima etapa imediatamente.
    3. Determinar a concentração de PSA usando um free-humana PSA ELISA kit 7.
  4. Enumerar as células plaqueadas.
    1. Usando uma pipeta de Pasteur, lavar as células cuidadosamente com 1 ml de DMEM. Aspirar e remover completamente os meios de comunicação.
    2. Adicionar 1 ml de meio fresco e raspe suavemente com um raspador de células para soltar as células do poço.
    3. Transferir as células para um tubo de microcentrífuga e re-suspender-los completamente para assegurar uma suspensão de célula única.
    4. Mistura de volumes iguais da suspensão de células e uma solução de azul de tripano a 0,4%. Contar as células vivas (que não ocupam o corante), utilizando um hemocitômetro.
  5. Calcula-se a expressão do PSA como ngde PSA / mL de meio / 10 6 células. A expressão PSA de células MB49-PSA para implantação em ratos é de 80 - / mL / 10 6 células 120 ng.

2. a determinação da sensibilidade de medições de PSA por ELISA e análise de PCR em tempo real

  1. Placa células MB49-PSA em meio DMEM completo numa placa de cultura de 6 poços com diferentes quantidades de células MB49 parentais de tal modo que há um máximo de 1 x 10 6 culas por po (isto é, 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 ou células MB49-PSA são cultivadas com 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, 10 0 ou células MB49, respectivamente).
  2. Um dia depois, recolher o sobrenadante para a medição de PSA, tal como descrito na etapa 1.3. Determinar a concentração de PSA usando um free-humana PSA ELISA kit 7.
  3. Extrai-se a ARN a partir das células.
    1. lisar ascélulas diretamente na placa por adição de 1 ml de reagente de extração de RNA.
    2. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e transferir o lisado celular para um tubo de microcentrífuga. Adicionar 0,2 ml de clorofórmio e as amostras vortex vigorosamente durante 15 s. Incubar-los durante 3 minutos à temperatura ambiente.
    3. Centrifugar as amostras a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Transferir cuidadosamente a fase aquosa superior (0,5 ml) para um tubo fresco, sem perturbar a interfase.
    4. Adicionar 0,5 ml de álcool isopropílico. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar as amostras a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante completamente, sem perturbar o precipitado de ARN no fundo do tubo.
    5. Lava-se a pelete uma vez com 1 ml de etanol a 75%. Centrifugar a 7.500 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover todo o etanol e permitir que o sedimento seco ao ar durante 10 min.
    6. Dissolve-se o ARN em 30 jil de água isenta de nuclease. Incubar durante 5 min a 60 ° C para aumentar a assimlubility.
    7. Quantificar o ARN através da medição da absorvância utilizando espectroscopia ultravioleta (UV) a 260 nm (A260). Para avaliar a pureza do RNA, medir a absorvência a 280 nm (A280) e calcular a razão A260 / A280, que deve ser superior a 1,6.
  4. Reverse-transcrever cDNA a partir de 2? G de ARN.
    1. Preparar a mistura de reacção em gelo e transferi-lo para tubos de 0,2 mL.
    2. Resumidamente centrifugar os tubos de girar o conteúdo e eliminar as bolhas de ar.
    3. Carregar os tubos no termociclador e realizar a transcrição reversa nas seguintes condições: 60 min a 37 ° C seguido por 5 min a 95 ° C. Uma vez que a execução é completada, as amostras de cDNA manter a 4 ° C.
    4. Armazenar as amostras a - 30 ° C para armazenamento a longo prazo.
  5. Realizar uma análise de PCR em tempo real para PSA e actina beta citoplasmática. beta actina é utilizada para normalizar as amostras. Realizar o ensaio em 100 ng de ARN transcrito reversamente em um pla de 96 cavidadeste. Ensaiar todas as amostras em triplicado. Realizar 40 ciclos com os seguintes parâmetros: 2 min a 50 ° C, 10 min a 95 ° C, 15 s a 95 ° C para a desnaturação, e 1 min a 60 ° C. Definir o menor limite de detecção em um limite de ciclo (CT) de 35; assim, todas as amostras com um valor de C T para além de 35 é considerado não detectável.

3. Manter a tumorigenicidade da linhagem de células MB49-PSA

NOTA: prolongado crescimento in vitro conduz a uma perda de tumorigenicidade. Para manter a tumorigenicidade, a linha de células MB49-PSA é passadas através do rato pelo menos uma vez a cada 2 anos.

  1. Células.
    1. Colheita crescimento exponencial células raspando-as delicadamente com um raspador de células estéril. Mistura de volumes iguais da suspensão de células e uma solução de azul de tripano a 0,4%. Contar as células vivas usando um hemocitômetro. Não implante se mais de 20% das células estão mortas.
    2. Calcula-se a quantidade necessária de células vivas (1 x 107 células / mL) e transferi-los para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifuga-se a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Re-suspender o pellet celular em DMEM mídia em branco. Repetir a lavagem três vezes para remover todos os vestígios de FBS antes da implantação.
    3. Manter a suspensão de células em gelo até os ratinhos são pronto para implantação.
  2. Implantar as células de tumor subcutaneamente nos ratinhos no flanco dorsal.
    1. Anestesiar um rato C57BL6 / J 4 a 6 semanas de idade, utilizando uma mistura de anestésicos de cetamina e a medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, respectivamente), injectado intraperitonealmente em 0,1 mL por 10 g de peso corporal.
    2. Raspar o flanco direito para expor a pele.
    3. Utilizando um par de pinças, levanta a pele para separá-lo do músculo subjacente e injectar 0,1 mL da suspensão de células (1 X 10 6 células) subcutaneamente com uma agulha de 24 g. Ao retirar a agulha, apertar o local de injecção durante 5 a 10 s para que as células tumorais fazernão vazar para fora do local de injecção.
    4. Reviver o rato com uma injecção subcutânea de atipamezol (1 mg / kg) a 0,1 mL por 10 g de peso corporal.
  3. Monitorizar o crescimento do tumor de dois em dois dias, medindo o diâmetro do tumor utilizando compassos de calibre. O volume do tumor é calculado usando a fórmula V = (ab 2) / 2, onde "a" é a dimensão mais longa e "b" é a largura perpendicular, ambos em mm.
  4. Quando o volume do tumor é pelo menos 50 mm (3 cerca de 7 dias), o rato eutanásia com CO2. Extirpar da massa tumoral com um par de pinças e tesouras estéreis sob condições assépticas e coloque em DMEM.
  5. Numa placa de cultura de 6 poços, o tumor mediu em pequenos pedaços, utilizando bisturis estéreis. Usar um êmbolo 1 mL da seringa como uma "pilão" desagregar mais do tumor.
  6. Adicionar 3 ml de DMEM completo e manter as células em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2.
  7. Uma vez que as células aderem ao plate (entre um e dois dias), remova a mídia, detritos e células não aderentes por aspiração suavemente com uma pipeta de Pasteur estéril. Lavar duas vezes com DMEM. Tome cuidado para não perturbar as células.
  8. Adicionar 1 ml de DMEM e colheita das células raspando-as com um raspador de células. Para seleccionar e expandir colónias individuais, contar as células utilizando um hemocitómetro e uma placa de células por poço numa placa de cultura de 96 poços. Células de cultura em DMEM com 200 ug / ml de higromicina B a 37 ° C e 5% de CO 2.
  9. Troque a mídia e Antibiótico cada 4 - 5 dias. Monitorar as células até que eles estão em cerca de 80-90% confluentes. Re-placa as células em uma placa de cultura de 24 cavidades por pipetagem para desalojar as células do poço.
  10. Uma vez que as células da placa de cultura de 24 poços são confluentes, as desalojar raspando com um raspador de células e placa-los em uma placa de cultura de 6 poços.
  11. Peneirar os diferentes clones para a secreção de PSA, tal como descrito no passo 1. Cryo-preservar o clone com o maior segredo PSAion e usá-lo para futuros experimentos do mouse.

4. Implantação do Tumor

NOTA: Cada ratinho é implantado com 1 x 10 5 células MB49-PSA em 50 ul de meio DMEM em branco na bexiga. Devido ao espaço morto no cateter, sempre preparar volume extra (pelo menos 100 ul adicionais por ratinho). Uma abordagem alternativa seria a utilização de uma seringa cheia de ar, tal como descrito por Kasman et ai. 5, em vez de uma seringa cheia.

  1. Células.
    1. Um dia antes da implantação, quando as células são de aproximadamente 80% confluentes, a passagem das células de tumor MB49-PSA em meio DMEM completo (suplementado com 10% de FBS, 2 mmol / l de L-glutamina, 0,05 mg / ml de penicilina-estreptomicina, e 200 ug / ml de higromicina B) a 37 ° C e 5% de CO 2 a uma razão de divisão de 1: 2.
    2. No dia do processo, a colheita das células raspando-os suavemente com um raspador de células estéril. Mistura de volumes iguais da suspensão de células eum tripano 0,4% de solução de azul. Contar as células vivas usando um hemocitômetro. Não implante se mais de 20% das células estão mortas.
    3. Calcula-se a quantidade necessária de células vivas (2 x 10 6 células / ml) e transferi-los para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifuga-se a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Re-suspender o pellet celular em DMEM mídia em branco. Repetir a lavagem três vezes para remover todos os vestígios de FBS antes da implantação.
    4. Manter a suspensão de células em gelo até os ratinhos são pronto para implantação.
  2. Permitir que a 4 a 6 semanas de idade, fêmea C57BL 6J / a aclimatizar durante uma semana antes do procedimento. Todo o trabalho animal deve ser realizado numa câmara de segurança biológica para manter as condições estéreis.
    1. Pesar cada rato e injectar anestesia (75 mg / kg de cetamina e 1 mg / kg de medetomidina) intraperitonealmente a 0,1 mL por 10 g de peso corporal. Bodyweights deve ser entre 17 e 22 g. Confirmar anesthetization observando nenhuma respoNSE após uma pitada dedo do pé.
    2. Para identificação, marcar o ouvido usando um soco orelha.
    3. Injectar de Hartmann solução ou composto de sódio lactato intraperitoneal em 0.1 mL por 10 g de peso corporal a cada 1-2 h para a hidratação.
    4. Aplicar pomada oftálmica estéril para ambos os olhos, usando uma lâmpada de algodão estéril, uma vez que o reflexo de piscar é perdido sob anestesia e os olhos secar. Reaplicar quando necessário.
    5. Coloque os ratos em decúbito dorsal em toalhas de papel na parte superior de um pacote de calor (ativado pelo contato com o ar) para manter a temperatura do corpo e fita adesiva nas pernas traseiras para baixo.
  3. Com um dedo, aplique uma leve pressão para a região abdominal inferior e recolher a urina da bexiga em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Este exemplo serve como o valor basal de PSA urinária.
  4. Retirar estéril poli-L-lisina (PLL) para uma seringa de 1 mL e anexar um cateter intravenoso de calibre 24, com o estilete agulha removida. Aplicar um lubrificante para a ponta do cateter e insTRE do cateter através da uretra para a bexiga usando uma pinça para orientar o cateterismo. Pare quando sentir resistência. NOTA: Os investigadores devem discutir com seu pessoal veterinário sobre a necessidade do uso de um gel lubrificante com anestésico para injeções intravesical eo uso de analgésicos pós-procedimento.
  5. Incutir 50 mL de PLL lentamente, a uma taxa de 10 ul a cada 20 s, para evitar o refluxo vesico-ureteral 18. Deixar o cateter na bexiga durante 20 min com uma rolha para evitar de fluxo de saída.
  6. Após 20 min, remover o cateter e desocupar a bexiga de quaisquer conteúdos pressionando cuidadosamente na região abdominal inferior. Usando um vazio seringa de 1 mL, lave qualquer conteúdo restante para fora do cateter.
  7. Misture células MB49-PSA completamente por pipetagem e retirá-las em uma seringa de 1 mL. Fixe o cateter e aplicar lubrificante. Incutir 50 uL de 1 x 10 5 células a uma velocidade lenta de 10 mL a cada 20 s. Substitua o bujão nodo cateter. Dê ratinhos de controlo 50 ul de solução salina.
  8. Depois de 1 h, remover os cateteres e desocupar a bexiga de quaisquer conteúdos. Remover a fita sobre as patas traseiras e colocar os ratinhos sobre as suas faces ventral. Revive os ratos por via subcutânea injetar a droga reversão (1 mg / kg atipamezol) em 0.1 mL por 10 g de peso corporal.
  9. Monitorar os ratos até a motilidade é observado. Devolver os ratos para suas gaiolas.
  10. Após a conclusão de um protocolo de detecção de tumores (seções 5, 7 ou 8), eutanásia os ratos usando CO 2. detecção de tumores pós-mortem é descrita na secção 6.

Crescimento do tumor 5. Monitoring com ELISA

NOTA: a presença do tumor e crescimento é monitorado em ratos através da medição da secreção PSA na urina. Pesquisadores devem consultar o seu pessoal veterinário sobre o acompanhamento da saúde animal e implantação de pós-tumor bem-estar e endpoints humanas.

  1. Existem dois métodos para recolher a urina de ratos.
    1. Recolha de urina durante a noite pela colocação de um único rato em uma gaiola metabólica indivíduo destinado a separar de urina a partir de material fecal. Se o set-up não tem de refrigeração, adicionar um inibidor da protease (100 mL) para dentro do tubo de recolha de urina para evitar a degradação do PSA durante a noite. No entanto, o número de gaiolas metabólicas disponíveis limita a utilidade deste método de recolha de urina.
    2. Nos casos em que é impossível usar logisticamente gaiolas metabólicas (tais como nos quartos ABSL2), recolher a urina local usando um dedo para exercer uma ligeira pressão na região abdominal mais baixa quando os ratos são anestesiados conforme descrito no passo 4.2.1. Isso geralmente é feito antes que a terapia é instilada. Pela nossa experiência, pelo menos 150 mL de urina podem ser coletadas 1 h após a anestesia.
  2. Imediatamente coloque a urina coletada no gelo. Hematúria pode ser visível a partir da segunda semana após a implantação do tumor. amostras hemolisadas altamente pode afetar a análise de ELISA. Por conseguinte, urinadeve ser colocado sobre gelo e processada rapidamente após a colheita.
  3. Centrifugar os tubos de urina a 6700 xg durante 5 min a 4 ° C para remover células ou detritos.
  4. Para normalizar a diferença na produção de urina entre os ratinhos, a alíquota de urina para novos tubos e armazená-las a -30 ° C até à realização de análises de PSA utilizando um kit de ELISA sete e creatinina utilizando um kit de ensaio de 7. Mesmo que os ratinhos não produzem PSA, existem baixos níveis de ligação não específica detectadas utilizando o ensaio ELISA. Para as amostras a ser considerado positivo, o limite deve ser fixado em valores maiores do que em ratos normais + 3 desvios padrão (SD) 15.

6. Detecção de presença do tumor com PCR em tempo real

  1. Ao término, dissecar a cavidade abdominal do rato e localizar a bexiga. Extirpar a bexiga e colocá-lo em um frasco de congelação. Congelar imediatamente em azoto líquido.
  2. Extrai-se a RNA por homogeneização dos tecidos em uma extr ARNreagente ação.
  3. Realizar análise de transcrição reversa e PCR em tempo real para a PSA, tal como descrito acima na secção 2.

Crescimento do tumor 7. Monitoring com fluorescência de imagem

  1. Rotular 1 x 10 7 células MB49-PSA com um corante fluorescente no infravermelho próximo 19.
  2. Re-placa e colher as células marcadas nos dias 4, 7, 11, 14, 18, e 21 para verificar se células retêm viabilidade e fluorescência por citometria de fluxo 20.
  3. Implantar as células MB49-PSA rotulados em bexigas de ratos, como descrito acima no ponto 4.
  4. Monitorar o crescimento de tumor utilizando um sistema de imagiologia de fluorescência de dois em dois dias.
  5. No dia da imagiologia, pesar e anestesiar os ratos utilizando uma mistura de anestésicos de cetamina e a medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, respectivamente), injectado intraperitonealmente em 0,1 mL por 10 g de peso corporal.
  6. Raspar a área abdominal para expor a pele.
  7. Coloque os ratos na câmara de imagem e adquiriras imagens de bexigas usando o software fornecido com o sistema de imagem.
  8. Revive os ratos por via subcutânea injetar uma droga reversão (1 mg / kg atipamezol) em 0.1 mL por 10 g de peso corporal.

Crescimento do tumor 8. Monitoramento com alta frequência Ecografia

  1. tumores de implantes em ratos, como descrito acima na Secção 4.
  2. A cada dois dias, acompanhar o crescimento do tumor usando ultra-sonografia.
  3. No dia da imagiologia, pesar e anestesiar os ratos utilizando uma mistura de anestésicos de cetamina e a medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, respectivamente), injectado intraperitonealmente em 0,1 mL por 10 g de peso corporal.
  4. Raspar a área abdominal para expor a pele.
  5. Instilar 100 ul de solução salina estéril a 0,9% na bexiga usando um cateter intravenoso de calibre 24. A solução salina irá distender a bexiga e melhorar a visibilidade durante a ultra-sonografia.
  6. Posicione o mouse sobre a plataforma de ultra-som e aplicar gel condutor ao labdómen ower.
  7. Abaixe a sonda de mão para a pele e adquirir imagens em modo B da bexiga sobre a plataforma de imagem 21.
  8. Reavivar a ratos por via subcutânea da droga de injecção reversão (1 mg / kg atipamezol) a 0,1 mL por 10 g de peso corporal.

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Resultados

a secreção de PSA a partir de células MB49 foi encontrada a variar com o meio de crescimento. MB49-PSA é cultivada em meio DMEM, porque isto resulta em aumento da secreção de PSA (Figura 1A). A fim de determinar a sensibilidade do PSA ELISA e PCR em tempo real, os diferentes números de MB49-secretoras de PSA células foram misturadas com células parentais MB49. PSA ELISA detecta um mínimo de 1 x 10 5 células secretoras de PSA / 1 x 10 6 células

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Discussão

Os passos mais críticos no protocolo são: 1) manter com sucesso a tumorigenicidade da linha celular; 2) assegurando a secreção PSA mensurável antes da implantação de células tumorais em camundongos; 3) a geração de uma suspensão de uma única célula para o implante, de modo a reduzir a variação no tamanho do tumor; e 4) células instilar a uma velocidade lenta para evitar o refluxo vesico-ureteral, resultando na implantação de células de tumor no rim.

Após passagem prolongada in vitro,

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Pesquisa Médica de Cingapura (NMRC/CIRG/1335/2012) concedida ao Professor Kesavan Esuvaranathan.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células MB49-PSAN/AN/Aref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 mediaHyCloneSH30027.01 
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)BiowestL0102
Soro Fetal Bovino (FBS) Sul-AmericanoBiowestS1810
Soro Fetal Bovino (FBS) Sul-Americano, PremiumBiowestS181B
Soro Fetal Bovino (FBS)HyCloneSH30088.03 
L-glutaminaBiowestX0550
Penicilina-EstreptomicinaBiowestL0022
Higromicina BInvitrogen10687-010
PSA livre (Humano) Kit ELISAAbnovaKA0209
Reagente TRIzol para extração de RNA Kitde
com Inibidor de RNaseApplied Biosystems4374967
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
TaqMan Ensaio de Expressão Gênica - Mouse ActbApplied Biosystems4331182Mm00607939_s1
TaqMan Ensaio de Expressão Gênica – Humanos KLK3Applied Biosystems4331182Hs00426859_g1
camundongos fêmeas C57BL / 6JIn Vivos4 - 6 semanas de
idade Anestesia (75 mg / kg de cetamina e 1 mg / kg de medetomidina)local
Medicamento de reversão (1 mg / kg de atipamezol)Farmácia
Perfurador de orelhaMicroscopia eletrônica Ciências72893-01
Solução Hartmann's ou Composto de lactato de sódioB Braun
Pomada oftálmica - Pomada lubrificante ocular estéril DuratearsAlcon
Heat pack - Aquecedores de mãos HotHandsHeatmax Inc
B Braun425130024 G x 3/4″
Geléia lubrificante Aquagelpara farmácia
, 0,01%,SigmaP4707
cOmplete, Mini, Inibidor de Protease sem EDTA CocktailRoche4693159001
Quantichrom Creatinine Assay SystemsDICT-50 
Corante fluorescente - VivoTrack 680Perkin ElmerNEV12000 
Solução de transição de tecido congelado RNAlater-ICEAmbion4427575
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento e software
7500 Sistema de PCR em tempo realaplicado Software Biosystems
7500 v2.3Applied Biosystems
Metabolic CageTecniplast Rack tipo vertical para 12 gaiolas
BD FACSCanto I system BD Biosciences
BD FACSSutenssoftware de imagem v7BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo sistema de imagem Caliper Life Sciences 
Software de Imagem Viva v3.1Caliper Life Sciences 
Sistema de imagem Vevo 2100VisualSonics 
Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade Ambion 15596026 Farmácia local Cateter Introcan Certo IV Solução de poli-L-lisina local

Referências

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