Metodologia para o Estudo da transferência horizontal de genes em Staphylococcus aureus

Summary

Descrevemos aqui três protocolos diferentes para a investigação in vitro de conjugação, transdução, transformação e natural em Staphylococcus aureus.

Abstract

Uma característica importante do grande agente patogénico humano oportunista Staphylococcus aureus é a sua capacidade extraordinária para adquirir rapidamente resistência a antibióticos. Estudos genómicos revelam que o S. aureus transporta muitos genes de virulência e resistência localizadas em elementos genéticos celulares, sugerindo que a transferência genética horizontal (HGT) desempenha um papel crítico na evolução S. aureus. No entanto, uma descrição completa e detalhada da metodologia utilizada para estudar HGT em S. aureus ainda está em falta, especialmente em relação transformação natural, que foi recentemente relatada nesta bactéria. Este trabalho descreve três protocolos que são úteis para a investigação in vitro de HGT em S. aureus conjugação, a transdução do fago, e transformação natural. Para este objectivo, o gene cfr (cloranfenicol / resistência florfenicol), que confere as fenicóis, Lincosamidas, Oxazolidinonas, pleuromutilinas, e estreptogramina A (PhLOPSA) -resistência fenótipo, foi usado. Compreender os mecanismos através dos quais S. aureus transfere material genético para outras estirpes é essencial para compreender a rápida aquisição de resistência e ajuda a esclarecer os modos de difusão relatados em programas de vigilância ou de prever ainda mais o modo de propagação no futuro.

Introduction

Staphylococcus aureus é uma bactéria Gram-positiva comensais que habita naturalmente na pele e cavidade nasal do ser humano e animais. Esta espécie bacteriana é a principal causa de infecções nosocomiais em hospitais e estabelecimentos de cuidados. Além disso, a sua capacidade de desenvolver resistência a diferentes compostos antimicrobianos fez a gestão das infecções causadas por esta bactéria em uma preocupação mundial.

Duas principais vias envolvidas na divulgação de fenótipos de resistência são conhecidos: a disseminação clonal de genótipos resistentes e de difusão dos determinantes genéticos entre a piscina bacteriana. No ca....

Protocol

NOTA: As estirpes e os materiais utilizados neste trabalho estão listados na Tabela 1 e a Tabela de Materiais, respectivamente. Nos experimentos de transmissão, N315 e COL cfr derivados -positivas foram usados como doadores do gene cfr (N315-45 e COL-45). Estas estirpes foram anteriormente obtidos por conjugação, utilizando como doador de um CFR clínica -positivo estirpe de Staphylococcus epidermidis (ST2), seguindo o protocolo padrão de conjugação (ver abaixo). Esta estirpe abrigavam o gene cfr em um plasmídeo pSCFS7-like ^7.

1. Conjugação Usando o mét....

Results

Os resultados aqui representadas foram previamente publicados (adaptado da referência ⁷ com a permissão do editor). Foram estudados os potenciais vias de transmissão do gene CFR, o que faz com baixo nível de resistência de linezolida e a expressão do fenótipo de resistência ^{PhLOPSA-14, 15} em estirpes de S. aureus, investigando três mecanismos de HGT.

Discussion

Este trabalho descreve os três métodos principais para estudar a HGT de determinantes genéticos em S. aureus. Apesar de transdução e conjugação têm sido estudados há décadas, a existência de transformação natural só recentemente foi reconhecida ^2. Assim, S. aureus é equipado com todos os três principais modos de HGT, e testar todos eles é necessária para esclarecer as possíveis vias de disseminação de determinantes genéticos. O objetivo deste trabalho é compilar protocolos.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caldo de Soja Tríptico (TSB)	Becton Dickinson
Infusão Cérebro Coração (BHI)	Becton Dickinson
Caldo nutriente nº 2	Oxoid	CM0067
Ágar sangue de ovelha	Eiken Chemical Co., Ltd.	E-MR96	Ágar tríptico de soja adicionado com 5% (v/v) de sangue de ovelha de acordo com o fabricante.
Pó de ágar	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Citrato de sódio (citrato trissódico di-hidratado)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Éster de celulose gradeado 0,45 μ L HAWG filtro	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243