Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מתודולוגיה לחקר ההעברה האופקית ג'ין Published: March 10, 2017 doi: 10.3791/55087
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 5, 6,7, 6,7, 1
1Division of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 2Department of Basic Biomedical Science, Universidad Europea de Madrid, 3Human Biology Program, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 4Laboratory of Nosocomial Infections, Department of Bacteriology, Centro Nacional de MicrobiologÍa, Instituto de Salud Carlos III, 5Division of Microbiology, Department of Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense, 6Biology of Gram-Positive Pathogens, Department of Microbiology, Institut Pasteur, Paris, France, 7ERL3526, CNRS, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים כאן שלושה פרוטוקולים שונים לחקירה במבחנה של נטייה, תמרה, וטרנספורמציה טבעי Staphylococcus aureus.

Abstract

תכונה חשובה אחת של הפתוגן האנושי אופורטוניסטים הגדול Staphylococcus aureus היא היכולת יוצאת הדופן שניתן לה לרכישת התנגדות במהירות לאנטיביוטיקה. מחקרים הגנום עולים כי S. aureus שנושא גנים ארסיים והתנגדות רבים הנמצאים אלמנטים גנטיים ניידים, דבר המצביע על כך העברת גנים אופקית (HGT) ממלאת תפקיד קריטי באבולוצית aureus S.. עם זאת, תיאור מלא ומפורט של המתודולוגיה ששימשה ללמוד HGT ב S. aureus עדיין לוקה בחסר, במיוחד לגבי השינוי הטבעי, אשר דווחה לאחרונה החיידק הזה. עבודה זו מתארת שלושה פרוטוקולים מועילים לחקירה חוץ גופייה של HGT ב S. aureus: הנטייה, תמרה הפאג, וטרנספורמציה טבעי. למטרה זו, הגן CFR (chloramphenicol / התנגדות florfenicol), אשר מקנה את Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, ו Streptogramin A (PhLOPSא) -resistance פנוטיפ, היה בשימוש. הבנת המנגנונים שבאמצעותם S. aureus מעבירה חומרים גנטיים זנים אחרים היא חיונית כדי להבין את הרכישה המהירה של התנגדות ומסייעת להבהיר את דרך ההפצה דיווחה בתוכניות מעקב או להמשיך לחזות את מצב ההפצה בעתיד.

Introduction

Staphylococcus aureus הוא חיידק commensal חיובי-גראם שבאופן טבעי שוכנת חלל עור אף של בני אדם ובעלי חיים. מינים של חיידקים זהו הגורם העיקרי להיווצרות זיהומים הנרכשים בבית חולים בבתי חולים והגדרות בריאות. יתר על כן, יכולתה לפתח עמידות תרכובות מיקרוביאלית שונות הפכה הנהלת הזיהומים הנגרמים על ידי חיידק זה לתוך דאגה עולמית.

שני מסלולים עיקריים מעורבים בהפצת פנוטיפים התנגדות ידועים: הפצת המשובטים של גנוטיפים עמידים בהפצת גורמים גנטיים בין ברכת החיידקים. במקרה של S. aureus, גנים עמידים לאנטיביוטיקה שונה (כמו גם גורמים ארסיים) נמצא להיות מזוהה עם אלמנטים גנטיים ניידים (MGEs) 1. הנוכחות של אלמנטים אלה בגנום של S. aureus מציינת כי הרכישה והעברת genחומר etic בתוך אוכלוסיית חיידקי יכול לשחק תפקיד חשוב עבור הסתגלות ואבולוציה aureus S..

ניתן להחליף חומר גנטי באמצעות מנגנוני שלושה ידועים של HGT בחיידקים החיוביים גראם: טרנספורמציה, נטייה, תמרה הפאג. טרנספורמציה כרוך את הספיגה של DNA החופשי. כדי לרכוש דנ"א זר, תאי חיידקיים צריכים לפתח שלב פיסיולוגי מיוחד: שלב היכולת. כאשר בשלב זה הוא הגיע, תאי מוסמכות מסוגלים הובלת DNA לתוך הציטופלסמה, רכישת גורמים גנטיים חדשים. במקרה של S. aureus, קיומו של שינוי טבעי הודגם 2 לאחרונה. בקנה אחד עם זה, הקבוצה שלנו לשפוך אור על הרלוונטיות של הביטוי של גורם אנחה (גורם סיגמא שעתוק משני נסתר) בשלב סמכותה של פיתוח על איך ביטוי המכונן שלה הופך S. aureus מסוגל מגששתg לשלב יכולת, המאפשר לרכישת פנוטיפים עמיד ידי טרנספורמציה טבעית 2.

הצמדתי הוא תהליך המערב את העברת הדנ"א מתא בית מגורים אחד (תורם) למשנו (נמען). תאי השני חייבים להיות בקשר ישיר, המאפשרים DNA שיוחלף בעוד מוגן על ידי מבנים מיוחדים, כגון צינורות או נקבובי. העברת ה- DNA על ידי שיטה זו דורשת מנגנון conjugative. ב S. aureus, הפלסמיד אבטיפוס conjugative הוא PGO1, אשר מטפח את אופרון TraA 3 conjugative.

תמרת הפאג כרוכה בהעברת DNA מתא לתא דרך הזיהום בקטריופאג ורומזת לאריזת DNA בקטריאלי, במקום ה- DNA הנגיפי, לתוך קפסיד הפאג. רוב הבידודים S. aureus הם lysogenized ידי bacteriophages 1. עם בתנאי עקה, ניתן נכרת prophages מן genom חיידקידואר ולעבור מחזור ממס.

אלה הם המנגנונים השלושה ידועים שידור DNA ב S. aureus. ישנם כמה מנגנוני העברה נוספים, כגון "פסאודו-טרנספורמציה" 2 ומערכות דמויות הפאג בהעברת האיים פתוגניות 4. לאחרונה, קבוצה אחת דיווחה כי "צינורות" מעורבים בהעברת חומרים הסלולר (כולל DNA פלסמיד) בין תאים שכנים 5, 6, אך מחקר מעקב לא הופיע מקבוצות אחרות עד כה.

עבודה זו מספקת את המתודולוגיה צורך ללמוד HGT ב S. aureus ידי טיפול השלושה מסלולי העברה עיקריים: נטייה, תמרה, וטרנספורמציה טבעי. התוצאות שהושגו עם מתודולוגיות אלה שימשו ללמוד את העברת הגן CFR (התנגדות chloramphenicol / florfenicol) ביןS. aureus זני 7. טכניקות שלוש אלה הן כלים צדדיים לחקירת שידור MGE ב S. aureus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: זנים וחומרים המשמשים בעבודה זו מפורטים בטבלה 1 ו טבלה של חומרים, בהתאמה. בניסויי השידור, N315 ו COL CFR נגזר -positive שמשו תורמים של גן CFR (N315-45 ו COL-45). זנים אלו התקבלו בעבר על ידי נטייה, באמצעות כמו התורם זן Staphyloccocus epidermidis -positive CFR הקליני (ST2), בעקבות פרוטוקול הנטייה הסטנדרטי (ראה להלן). זן זה טיפח את הגן CFR על פלסמיד pSCFS7 דמוי 7.

הצמיד 1. לפי שיטת ההזדווגות המסננת

הערה: זן N315 S. aureus נושאת את הגן CFR (N315-45) 7 (ס"מ R) שימש התורם. COL 8 או 9 Mu50 זנים (ט R, Cm S) שימשו הנמענים. לְהַכפִּיל-מושבות עמידות (R ט, Cm R) מסוגל לגדול בנוכחות של 32 מ"ג / ליטר של chloramphenicol בתוספת 8 מ"ג / ליטר של טטרציקלין נחשבו transconjugants המשוערת ו נותחו על מנת לקבוע את נוכחותם של CFR ידי מושבת PCR ולקבוע את פרופיל רגישות נמען.

  1. בצע נטייה בעקבות פרוטוקול שתואר לעיל 10 עם כמה שינויים:
    1. הכן 5 מ"ל של תרבות לילה של התורם והמקבל במרק סויה tryptic בינוני (TSB) (עם ובלי 32 chloramphenicol מ"ג / L, בהתאמה), עם רועד ב 37 ° C.
    2. התאם את הצפיפות האופטית (OD 600) של תרבויות הלילה עד 1 (OD 600 = 1.0) באמצעות מדיום TSB טרי. מערבבים 0.5 מ"ל של התרבות התורם (N315-45) עם 0.5 מ"ל של התרבות הנמען (COL או Mu50). הוסף 1 מ"ל של PBS לתערובת.
    3. מעבירים את התערובת של חיידקים על גבי usi קרום מסנן 0.45 מיקרומטרng מערכת משאבת ואקום.
    4. שים את ממברנות סינון על צלחת אגר דם כבשים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 יום.
      הערה: בשלב זה, בינוני מועשר הכרחי כדי לאפשר את הצמיחה של תאים כפולים עמידים.
    5. קח את קרום מסנן מהצלחת להשעות ב 10 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו (PBS). וורטקס היטב כדי לאסוף את כל החיידקים מצורפים על הממברנה.
    6. הפוך דילול של פי 10 סידורי של ההשעיה חיידקי באמצעות TSB הטרי. פלייט 100 μl של דגימות 0-10 -4 מדולל על אגר TSB (TSA) צלחות בתוספת 32 מ"ג / L chloramphenicol ו -8 מ"ג / L טטרציקלין לבחירת transconjugants. פלייט 100 μl של ההשעיה המדוללת (10 -5 -10 -6) לצלחות TSA עם 8 מ"ג / טטרציקלין L לבד לספור את המספר הכולל של מקבלים. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות.
    7. לנתח מושבות כפולות עמידות (transconjugants המשוערת) לנוכחות של CFr הגן על ידי מושבת PCR 7 והפרופילים הרגישים שלהם (antibiogram).
    8. קבע את antibiogram ידי מדידת ריכוזי מעכבות מינימום (מיקרופונים) באנטיביוטיקה מתאימה בהתאם דיפוזיה דיסק או שיטת microdilution השיטה הסטנדרטית 11. הפרופיל רגישות של transconjugants חייב להיות זהה לזה של הנמען, למעט chloramphenicol (ותרכובות אחרות מושפע גן CFR). קביעה זו היא חיונית כדי לשלול התנגדות טטרציקלין שפותחה על ידי הזן התורם.

2. התמרה הפאג

הערה: MR83a בקטריופאג השייכת למשפחת Siphoviridae (מלאי מעבדה) שימש בניסויים התמרה. N315-45 שמש תורם CFR לזיהום הפאג. N315, COL, או זנים Mu50 שימשו הנמענים. רכישת CFR נקבעה על ידי ABility של זן הנמען לגדול בנוכחות chloramphenicol 32 מ"ג / L. מושבות גדלו בתנאי זה נותחו על מנת לקבוע את נוכחותם של CFR (על ידי מושבת PCR) ולקבוע את פרופיל הרגישות כדי לשלול אפשרות של זיהום.

  1. הגברה הפאג על התורם
    1. הכן תרבות הלילה של N315-45 ב 5 מ"ל של מרק מזין בתוספת 3.6 מ"מ Ca 2 + (NBCaCl 2) על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (180 סל"ד).
      הערה: סידן נדרש זיהום הפאג. עיין חומרי הטבלה. מרק מזין מחברות אחרות עלולים להיתקל בבעיות, כגון ממטרי סידן.
    2. הכן תרבויות משנה על ידי דילול התרבות לילה 1: 1,000 בנפח סופי של 10 מ"ל של NBCaCl 2 צלוחיות זכוכית 50 מ"ל או צלוחיות זכוכית. לגדל את החיידקים עבור שעה 1 ב 37 ° C עם רועד (180 סל"ד).
    3. הכינו סדרה של MR83a הפאג מדולל NBCaCl 2 Mediאממ (10 -2, 10 -3, 10 -4, 10 -5, ו -10 -6). הוסף 20 μl של הפאג מדולל לתוך התרבות חיידקים. כמו כן להכין תרבות שליטה ללא זיהום הפאג, אשר משמשת כביקורת חיובית לצמיחה תא החיידק וניתן להשתמש בו כדי לקבוע את כייל הפאג למחרת.
    4. לגדל את תרבויות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (100 סל"ד) למשך הלילה.
      הערה: התאים יגדלו במידה מסוימת כאשר הפאג המדביק אינו עולה; אז, הם ייכנסו לתוך שלב תמוגה בשל הגברת הפאג דרך המחזור הממס. התרבות ללא הפאג תציג צמיחה מלאה, בעוד תרבויות עם הפאג תצגנה שיעורים ברורים של שקיפות.
    5. בחר בקבוקוני תרבות פינה אחת או שניים עם הדילול הגבוה ביותר של הפאג הוסיף.
    6. מעבירים את תרבויות לתוך 15 מ"ל צינורות צנטריפוגות. הוסף 250 μl של כלורופורם ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינורות.
    7. בצנטריפוגה צינורות ב 5000
    8. מעבירים את supernatants לצינורות טריים ולאחסן אותם ב 4 ° C עד השימוש.
      הערה: הפאג הוא יציב במשך לפחות כמה חודשים, אבל לאחסון הכנת הפאג במשך זמן רב מדי מפחית את היעילות כייל תמרה.
  2. מדידת כייל הפאג (assay פלאק הפאג)
    1. כן אגר מרק מזין (1.5% אגרו) בינוני; לשמור אותו חם באמבט מים ב 55 ° C. להוסיף autoclaved 0.5 M CaCl 2 פתרון למדיום לריכוז סופי של 3.6 מ"מ. יוצקים את התערובת לתבנית 90 מ"מ צלחות פטרי (NBCaCl 2 צלחות).
    2. הכן תרבות הלילה של N315 ב 5 מ"ל של NBCaCl 2 ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד; זה יכול להיות מוחלף עם תרבות השליטה המתוארת לעיל (שלב 2.1.3).
    3. הוסף 10 μl של תרבות הלילה לתוך 200 μl של NBCaCl 2 ובאופן שווה להפיץ אותו לצלחת 2 NBCaCl. עצור את ההתפשטות כאשר פני השטח שלהצלחת מכוסה בנוזל. תן יבש הצלחת.
    4. הכן דילול סדרתי 01:10 (מ 10 -5 -10 -10) של הפאג שהוכן קודם לכן (שלב 2.1.8) באמצעות המדיום NBCaCl 2.
    5. ספוט 3 μl של דילול כל הפאג לצלחת מכוסה חיידקים.
    6. דגירה את צלחת הלילה ב C 30 °.
    7. לספור את המספרים רובד לחשב כייל הפאג באמצעות המשוואה הבאה: יחידת פלאק ויוצרים (pfu) / מ"ל = מספר הפלאק x דילול גורם / נפח הבחין (3 x 10 -3 מ"ל)
  3. תמרת הפאג
    הערה: ברכת הפאג הערוכה בשלב הקודם (2.1.8) משמשת כדי לבדוק את התמרה של גן CFR לתוך זני S. aureus. בניסוי זה, זני N315, COL, או Mu50 משמש נמענים.
    1. הכן את תרבות הלילה של N315, COL, או Mu50 ב 5 מ"ל של NBCaCl 2 ב 37 ° C עם רועד (180 סל"ד).
    2. לדלל tהוא הפאג ב NBCaCl 2 עד ~ 10 9 pfu / מ"ל.
    3. בקבוקון זכוכית 50 מ"ל, לערבב 500 μl של תרבות לילה, 500 μl של טרי NBCaCl 2, ו 1 מ"ל של הפאג (~ 10 מ"ל 9 pfu /); ריבוי הזיהום הצפוי (משרד הפנים) לא יעלה על 1. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (100 סל"ד) למשך 30 דקות.
      הערה: עיבוד תרמי של תאי נמען רק לפני התוספת של הפאג (52 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי להשבית את אנזימי הגבלת endogeneous) עשוי להגביר את היעילות 12.
    4. הוסף 50 μl של 20% Na 3 -Citrate. המשך רעד עדין במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: Na 3 -Citrate משמש chelator מתונה של סידן.
    5. כן עירוי המוח-לב מומס (BHI) אגר בינוני (1.5% אגרו) ולשמור אותו באמבט מים ב 55 ° C.
    6. מעביר את התערובת הפאג-חיידק בבקבוק 100 מיליליטר, להוסיף 50 מיליליטר של אגר BHI החם בתוספת 32 מ"ג / L chloramphenicol, ומערבבים היטב. יוצקים את התערובת לתוך מנות 90 מ"מ פטרי.
      הערה: שיטה זו מאפשרת זיהוי של מספר קטן של מושבות גדלות (transductants המשוערת).
    7. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות.
    8. בהמשך לבדוק המושבות שנוצר (transductants) להתנגדות ידי העברת מושבות על צלחות אגר BHI חדשים בתוספת 32 מ"ג / L chloramphenicol. לאשר את קיומו של הגן CFR ידי המושבה 7 PCR.

3. שינוי טבעי

הערה: assay השינוי הטבעי S. aureus בוצע בעקבות השיטה המתוארת במחקר הקודם שלנו 2. נגזר N315, 2 N2-2.1, 7, שמש הנמען. בנימה זו, מוקד אנחה היה כפולות כדי להביע constitutively אנחה 2. לקבלת detנהלים שמציקים על איך לבודד גרסות יכולת להביע אנחה, מעיינים תיאור קודם 2. אם סמן התנגדות שיועברו אינו chloramphenicol, pRIT-אנחה (ס"מ R) שניתן להשתמש בהם כדי להביע אנחה, כפי שתואר לעיל 2. פלסמיד מטוהרים או תמצית ה- DNA שלם CFR -acquired S. aureus COL-45 7 משמש DNA התורם לטרנספורמציה.

  1. הכנת DNA התורם
    1. טפחו COL-45 לילה עם רועד ב 37 ° C בבקבוק 300 מ"ל המכיל 50 מ"ל של TSB בתוספת chloramphenicol 32 מ"ג / L. תרבות E. coli HST04 נושאת pHY300 פלסמיד (ט R) כדי לחלץ את הפלסמיד עבור הניסוי השליט.
      הערה: HST04 (סכר - / DCM -) חסרה את ה- DNA methylase גנים 13. זנים אחרים קונבנציונליים עם methylases DNA יכול להיות גם שימושד להכין תורם DNA, משום שמדינת מתילציה DNA אינה משפיעה על יעילות השינוי. לחלופין, פלסמיד pT181 מטוהרים מן זן S. aureus COL יכול לשמש גם כביקורת חיובית עבור assay טרנספורמציה 2.
    2. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה (8,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C).
    3. חלץ פלסמידים באמצעות ערכת חילוץ DNA פלסמיד או שיטה לטיהור DNA קונבנציונלית לטהר את ה- DNA כולו.
    4. לכמת את ה- DNA מטוהרים על ידי ספקטרומטר ולשמור אותו ב 4 ° C עד השימוש.
      הערה: השתמש ה- DNA הכנה טריה עבור assay טרנספורמציה, בדרך כלל פחות משבוע ישן. הכנות הישנות DNA להפחית את היעילות של טרנספורמציה.
  2. assay טרנספורמציה
    1. תרבות התא המקבל (N2-2.1) לילה ב 5 מ"ל של TSB על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
    2. העבר 0.5 מ"ל של תרבות הלילה לתוך צינור 1.5 מ"ל. Precipiטייט התאים על ידי צנטריפוגה (10,000 XG במשך 1 דקות ב 4 ° C).
    3. להשעות את התאים עם 10 מ"ל של מדיום CS2 בתוך שפופרת 50 מ"ל.
      הערה: בינוני CS2 הוא מדיום סינטטי מלא שגרם יכולת לשינוי טבעי S. aureus 2 (ראה הרכב הבינוני בטבלת החומר). תקשורת מעבדה סטנדרטית אחרת, כגון TSB או BHI, אינה מתאימה טרנספורמציה 2, 13.
    4. לגדל את החיידקים על 37 ° C עם רועד (180 סל"ד) עד לשלב מעריכים מאוחר (כ -8 שעות).
    5. קציר התאים על ידי צנטריפוגה (5,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C).
    6. Resuspend תאים 10 מיליליטר של מדיום CS2 טרי.
    7. הוסף 10 מיקרוגרם של פלסמיד מטוהרים או DNA בגנום (שלב 3.1.4) על השעיית התא. לנער על 37 מעלות צלזיוס ו 180 סל"ד במשך 2.5 שעות.
      הערה: פעמי דגירה קצרות יותר עם DNA (<2.5 שעות) לגרום transf הנמוךתדרי ormation.
    8. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה (5,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C).
    9. Resuspend התאים 10 מ"ל של מדיום BHI. מערבבים את ההשעיה תא עם 90 מ"ל של אגר BHI מומסת (55 מעלות צלזיוס) מוסף עם 32 מ"ג / chloramphenicol L (או 5 מ"ג / טטרציקלין L בניסוי שליטה). יוצקים את התערובת לתוך מנות 90 מ"מ פטרי. במהירות מגניבה ולתת אגרו לחזק.
    10. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
    11. לשכפל מושבות שנוצרו (transformants) על ידי העברת המושבות (באמצעות קיסמים) צלחות אגרו BHI חדשים המכילות את האנטיביוטיקה המתאימה כדי לאשר מאפייני התנגדותם. אשר את גן התנגדות רכש (CFR או tetM) על ידי מושבה 7 PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות יוצג כאן פורסמו בעבר (עיבוד התייחסות 7 באישורו של בעל האתר). למדנו את מסלולי שידור הפוטנציאל של גן CFR, הגורמת התנגדות linezolid ברמה הנמוכה לבין הביטוי של פנוטיפ PhLOPSA-התנגדות 14, 15 זני S. aureus, על ידי חקירת שלושה מנגנונים של HGT.

איור 1 מציג את התוצאות שהושגו מבחני conjugative. פרוטוקול הנטייה שימושי שידור בין-מינים (א) וכן שידור תוך-מינים (B), נותן תוצאות דומות תוך שימוש באותו הווקטור conjugative במספר תורמי conjugative שונים. היעילות של נטייה מחושבת כיחס בין Nº של transconjugants (יחידות מושבה יוצרי, או CFU / ml) / Nº של תאי נמען (CFU / ml). התדרים המתקבל נע בין 1 x 10 -6 עד 1 x 10 -5, עם ערכים דומים באמצעות epidermidis ס או S. aureus כפי התורם.

התוצאות מסוכמות CFR טבל 2. -acquired S. aureus הצליח נוסף להעביר את גן CFR זני S. aureus אחרים על ידי נטייה כמו גם על ידי תמרה הפאג. עם זאת, התוצאות הראו בהעדר השינוי הטבעי לשידור CFR, למרות שזה זוהה על סמן התנגדות שונה (גני tetM על פלסמיד pHY300).

איור 1
איור 1: ייצוג CFUs הנמען transconjugant שהושגו מבחני conjugative. הברים הברורים לייצג את זני הנמען כולל מבודדים לאחר18-24 שעות של תרבות תקשורת סלקטיבית עבור זני נמען. הברים מלאי מייצגי זני הכולל כפולים העמידים המתקבלים לאחר 18-24 שעות של תרבות תקשורת סלקטיבית עבור זני transconjugant. (א) אינטר-מיני assay conjugative. סטפילוקוקוס אפידרמידיס (SE45) שימש התורם CFR, ואת המתח N315 Staphylococcus aureus שימש הנמען. זן transconjugant N315-45 טיפח את הגן CFR הוכנס פלסמיד pSCFS7 דמוי. זן זה שימש כמקור CFR ב מבחני שידור MRSA-אל-MRSA. (ב) MRSA-אל-MRSA ניסויים conjugative. שהושגו בעבר N315-45 שימש התורם, ואת COL או זנים Mu50 שימשו הנמענים. הערכים הממוצעים של שני ניסויים בלתי תלויים מוצגים עם סטיית התקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסה של נתון זה.

שם זנים תאור מקור הפניה
זני חיידקים
SE45 ס epidermidis isolatated הקליני 7
N315 טרום MRSA, KMR, ErmR 9
COL MRSA, גן ההתנגדות טטרציקלין נושא על פלסמיד pT181 8
Mu50 MRSA, VISA 9
N315-45 נגזרת של N315, נושאת CFR הגן על פלסמיד pSCFS7 דמוי המתקבל ס epidermidis ידי נטיה 7
COL-45 דerivative של COL, נושאת CFR הגן על פלסמיד pSCFS7 דמוי המתקבל ס epidermidis ידי נטיה 7
RN4220-45 נגזרת של RN4220, נושאת CFR הגן על פלסמיד pSCFS7 דמוי המתקבל ס epidermidis ידי נטיה 7
N2-2.1 אנחת תא פעיל נגזר N315, המאפשר יכולת טבעית תא לטרנספורמציה 7
E. coli HST04 הסכרים / dcm- pHY300 E. coli HST04 הסכרים / dcm- (Takara) התנגדות טטרציקלין נושאת פלסמיד pHY300 11
bacteriophages
MR83a המשפחה Siphoviridae מניית מעבדה
MR83-45 הפאג MR83a אריזת פלסמיד דמוי pSCFS7 נושאת CFR גן לאחר להדביקיון לתוך N315-45 מחקר זה

טבלה 1: רשימת זנים המשמשים בעבודה זו.

HTG תוֹרֵם מְקַבֵּל תדירות
נְטִיָה N315-45 COL 1.00 x 10 -6
N315-45 MU50 1.29 x 10 -5
התמרה N315-45 COL 1.00 x 10 -11
N315-45 MU50 3.68 x 10 -10
N315-45 N315 6.88 x 10 -10
טרנספורמציה פלסמידים (COL-45) N2-2.1 ULD
DNA השלם (45-COL) N2-2.1 ULD
pHY300 (שליטה) N2-2.1 6.52 x 10 -10

טבלה 2: תדרי HTG של העברת גני CFR שהושגה MRSA-אל-MRSA ניסויים. שידור Conjugative הוערך באמצעות הנגזר N315 CFR -positive (N315-45) כמו התורם. תדירות השידור בניסויים אלו מבוטאת Nº של תאי transconjugants / נמען. התמרה הוערכה באמצעות MR83a הפאג transducing, מוגבר מן זן N315-45. תדירות התמרה חושבה Nº של transductants / pfu. Transforמבחני אינפור בוצעו באמצעות DNA המטוהר (פלסמיד או DNA הסלולר כולו) כתורמים. תדירות השינוי היה מחושב כיחס בין מספר תאי transformants / הנמען. ULD: תחת זיהוי הגבול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבודה זו מתארת שלוש השיטות העיקריות ללמוד את HGT של גורמים גנטיים ב S. aureus. למרות התמרה והזדווגות נחקרו במשך עשרות שנים, את קיומו של שינוי טבעי היה רק לאחרונה מוכר 2. לפיכך, S. aureus מצויד בכל אחד משלושה המצבים הגדולים של HGT, ובדיקת כולם נדרשה להבהיר את המסלולים הפצה האפשריים של גורמים גנטיים. מטרת העבודה היא להכין פרוטוקולים מלאים לספק מידע מעשי על מתודולוגיות בשימוש שפורסם בעבר עבודה 7. למרות פרוטוקולי נטיית התמרה זמינים, זהו העיתון הראשון שבו פרוטוקול שינוי מפורט מתואר.

הצמיד בשיטת מסנן-ההזדווגות היא טכניקה פשוטה והוא יכול להיות מיושם על המחקר של העברת conjugative במיני חיידקים שונים= "Xref"> 7, 10. באמצעות inocula הסטנדרטית, נמען סופר לאחר 18-24 שעות להגיע לערך של ~ 10 9 CFU / ml. ספירת Transconjugant משתנית, והערכים להראות זן-אל-זן תלות חזקה, אבל בדרך כלל, מגוון transconjugant מ -10 2 כדי 10 5 היה מתקבל כשתוצאות הנטייה היו חיוביות. באמצעות פרוטוקול המוצגים כאן, לגבול של זיהוי מושגת היה <10 transconjugants / מ"ל. מגבלה זו יכולה להיות מותאמת על ידי ריכוז ההשעיה המסננת.

פרוטוקול השינוי הטבעי המתואר כאן הוקם בשנת S. aureus זני N315-נגזר. השימוש בינוני CS2 הוא קריטי עבור טרנספורמציה, מאז השינוי הוא בלתי ניתן לגילוי במדיה מעבדה סטנדרטיים אחרים, כגון TSB ו BHI 13.

השימוש פלסמידים מאוחסנים לטווח ארוך (למשל, pT181 ו pHY300) כמו התורם הביא על 10 עד פי 50 תדירות מופחתות (מידע לא מוצג), טוען כי איכות DNA יכול להשפיע על תדירות השינוי. זה ידוע כי פלסמידים פצע אינם מתאימים שינוי טבעי B. subtilis 16.

DNA המתקבל הוא S. aureus ו- E קולית יכול לשמש תורם מבחני שינוי טבעיים, דבר המצביע על כך מחסום הגבלה לא לעכב את השינוי הטבעי. גם צפינו אותו תדר השינוי בין DNA שהוכן E. coli HST04 (סכר - / DCM -) חסר הדנ"א methylase גנים ומן JM109, תומכים ברעיון כי מצב מתילציה אינו משפיע על תדירות השינוי.

יצוין כי תדירות השינוי זוהתה על ידי שימוש בפרוטוקול זה הייתה נמוכה (~ 10 -9 -10 -10), ואת הזנים להמרה מוגבלים נגזרי N315class = "Xref"> 2. סביר להניח כי יעילות השינוי ב S. aureus יכול להיות זן ספציפי, כמו גם דווחה חיידקים להמרה אחרים 15, 16, 17. מחקרים נוספים נערכים כעת לשפר את יעילות השינוי; זה יתואר במקום אחר.

תמרת הפאג נראית את מנגנון HGT הנפוץ ביותר S. aureus בגלל מבודדים ביותר S. aureus הם lysogenized ידי bacteriophages 18. יכולת הזיהום של הפאג transducing תלוי רגישות מארח צריכה להיבדק על ידי assay פלאק. מגבלה נוספת של התמרה הפאג הוא בגודל של ה- DNA. DNA הקטן ניתן להעביר ביעילות, אלא גם דנ"א שברים גדולים מ -45 kb לא יכולים להיות ארוזי ראש הפאג staphylococcal 19. עם זאת, הפאג staphylococcal ענק הרומן יש לאחרונה בeen בודד מהסביבה, ואת itcould דעת תוכל להעביר קטעי דנ"א גדולים 20.

שיטת assay פלאק המתואר עבודה זה קלה יותר מאשר הפרוטוקול הקונבנציונלי, שם-אגר העליון משמש. עם זאת, השיטה הנהוגה כיום דורשת כי תאי חיידקיים מפוזרים באופן שווה על מנת לזהות לוחיות זעירות שנוצרו על פני השטח. כדי להשיג את אפילו לחלוטין מתפשט, אנו ממליצים הפצה מספיק הנפח של השעית החיידקים על המשטח אגר, לעצור כאשר הנוזל שווה מכסה את פני השטח אגר. לאחר מכן, לייבש את הצלחות-זרימת אוויר ספסל נקי. אם יש צורך, כדי למנוע את lysogenization של הפאג transducing, ריבוי נמוך של זיהום מומלץ (משרד הפנים לא יעלה על 1). תאי Lysogenized ניתן להבחין על ידי רגישות פחתה שלהם הפאג ב assay פלאק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)  Becton Dickinson  211825
Brain Heart Infusion (BHI) Becton Dickinson  211059
Nutrient Broth No. 2 Oxoid CM0067
Sheep blood agar Eiken Chemical Co.,Ltd. E-MR96 Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. 
Agar powder Wako Pure Chemical Industries 010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) Wako Pure Chemical Industries 191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter Merck Milipore HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit QIAGEN 12243

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
  2. Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
  3. Caryl, J. A., O'Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
  4. Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
  5. Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
  6. Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
  7. Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
  8. Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
  9. Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
  10. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
  11. Clinical Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , CLSI. Wayne, PA, USA. (2006).
  12. Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
  13. Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
  14. Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
  15. Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
  16. Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
  17. Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
  18. McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
  19. Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
  20. Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).

Tags

אימונולוגיה גיליון 121, העברת גנים אופקית נטייה תמרה טרנספורמציה עמידות לאנטיביוטיקה.
מתודולוגיה לחקר ההעברה האופקית ג&#39;ין<em&gt; Staphylococcus aureus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cafini, F., Thi Le Thuy, N.,… More

Cafini, F., Thi Le Thuy, N., Román, F., Prieto, J., Dubrac, S., Msadek, T., Morikawa, K. Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55087, doi:10.3791/55087 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter