Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Resumo

Este é um método para criar uma estrutura de suporte de cultura de células 3-dimensional a partir da matriz extracelular pulmonar. pulmão intacto é transformado em hidrogéis que podem suportar o crescimento das células em três dimensões.

Resumo

Aqui é apresentado um método para o estabelecimento de múltiplos componentes hidrogéis de cultura de células para a cultura de células em pulmão in vitro. Começando com saudável en bloc tecido pulmonar de porcino, rato ou ratinho, o tecido é submergido perfundidos e em detergentes químicas subsequentes para remover os detritos celulares. Comparação histológica do tecido antes e depois do processamento confirma a remoção de mais de 95% de ADN de cadeia dupla coloração e alfa-galactosidase sugere a maioria dos detritos celulares são removidos. Após a descelularização, o tecido é, em seguida, liofilizado e cryomilled em um pó. O pó de matriz é digerido durante 48 horas numa solução de pepsina a digestão ácida e, em seguida, neutralizou-se para formar a solução Pregel. A gelificação da solução Pregel pode ser induzida através da incubação a 37 ° C e pode ser utilizada imediatamente após a neutralização ou armazenado a 4 ° C durante até duas semanas. Os revestimentos podem ser formados utilizando a solução Pregel sobre uma chapa não tratada para Capego ell. As células podem ser suspensas no Pregel antes de auto-montagem para alcançar uma cultura 3D, plaqueadas sobre a superfície de um gel formado a partir do qual as células podem migrar através do andaime, ou revestida sobre os revestimentos. Alterações à estratégia apresentada pode ter impacto na temperatura de gelificação, força ou tamanhos dos fragmentos de proteína. Além formação de hidrogel, o hidrogel de rigidez pode ser aumentada usando genipina.

Introdução

Traduzir resultados in vitro para a clínica é uma das questões mais desafiadoras enfrentadas pelos pesquisadores biomédicos. A pesquisa in vitro em plástico de cultura de tecidos é mais fácil, mais conveniente e mantém alta viabilidade celular. ¹ Essa abordagem é um ponto de partida razoável, mas os resultados têm tradução clínica limitada. Cada vez mais, os laboratórios estão incorporando construções tridimensionais para substituir os métodos bidimensionais tradicionais. As revisões estão disponíveis para muitos ambientes tridimensionais, desde andaimes biológicos até andaimes poliméricos. ^2,3

As estruturas biológicas podem imitar as características de ambientes in vivo, pois contêm muitos dos componentes proteicos e glicosaminoglicanos da matriz nativa e fornecem locais de ligação familiares para as células se ligarem e reconhecerem. Os materiais derivados da matriz extracelular (MEC) demonstraram ser scaffolds capazes de fixação e proliferação celular. ⁴ Um desafio que limita a aplicação de plataformas de hidrogel ECM decorre de suas propriedades mecânicas inerentemente fracas após a gelificação. O tecido nativo geralmente tem propriedades mecânicas que são magnitudes maiores do que os hidrogéis. Agentes de reticulação não tóxicos podem aumentar as propriedades mecânicas dos hidrogéis para melhor imitar o ambiente do tecido nativo. A genipina é um reticulador natural não tóxico derivado de plantas de gardênia com a capacidade de adaptar de perto as propriedades mecânicas da ECM com mudanças na concentração de genipina^5,6.

Quase todas as células do corpo existem e se organizam na ECM que produzem ou mantêm. O novo foco na importância universal da ECM na organização, condição e função em cada órgão ou sistema desencadeou a produção de plataformas baseadas em matrizes para investigação in vitro. A submucosa do intestino delgado suíno é o suporte de origem natural mais amplamente estudado e tem sido usado para regenerar tendões, ligamentos, músculo esquelético⁴ e até mesmo osso⁷. Matrizes de outros órgãos e espécies doadoras também demonstraram bom potencial de regeneração tecidual. O uso de componentes estranhos da ECM causa problemas mínimos com a imunomodulação. Após a eliminação da matéria celular do hospedeiro, a ECM restante será semelhante em conteúdo e organização de aminoácidos a todas as outras espécies de mamíferos⁸. Há uma linha de pensamento crescente de que a melhor maneira de examinar as interações célula-ECM in vitro é utilizar andaimes de ECM específicos de órgãos. Cada órgão fornece uma composição única de proteínas e proteoglicanos para criar nichos celulares. Os nichos fornecem a quebra estrutural, funcional e até enzimática da matriz extracelular, contribuindo para a sinalização biofísica. Para atingir um microambiente in vitro mais semelhante ao microambiente in vivo, o uso de ECM específico do tecido otimizaria os nichos celulares para pesquisa.

O objetivo deste protocolo é fornecer um método para estabelecer uma estrutura de hidrogel exclusiva para a ECM pulmonar. Este método fornece uma plataforma para pesquisa in vitro sobre as interações célula-MEC do pulmão.

Protocolo

Solução	filtro esterilizado	Instruções
2 O DIH	sim	DIH 2 O; esterilizada por filtração
0,1% de solução de Triton X-100	sim	Sob hotte adicionar 100 uL de Triton X-100 a 100 ml solução DIH 2 O e agitar até à dissolução; filtro esterilizado.
2% de desoxicolato Solução	sim	Sob exaustor adicionar 2 g solução de desoxicolato de sódio por 100 ml DIH 2 O e agitar até à dissolução; Filtrar em condições estéreis
1 M NaCl	sim	Adicionar 58,44 g de NaCl para 1 L de DIH 2 O; agitar até se dissolver; filtro esterilizado
solução de DNase	sim	Adicione 12.000unidades de ADNase a 1 L DIH 2 O; Adicionar 0,156 g MgSO4 (Anidro), e 0,222 g de CaCl 2; agitar até se dissolver; filtro esterilizado
PBS	sim	Combine 27,2 g de Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibico hepta-hidratado), 80 g de NaCl e 2 g de KCl com 10 L DIH 2 O; agitar até se dissolver; ajustar o pH para 7,4; filtro esterilizado

Tabela 1: soluções necessárias para Decelularização Tissue. Faça as soluções acima para o processo de descelularização. Armazenar a 4 ° C. Cerca de 2,5 L será necessário para um pulmão de porco.

1. Formação Hidrogel

1. Porcina Lung Decelularização (adaptado a partir de referências ^9,10)
   1. Obter, um en bloc pulmão de porco normal, de um matadouro, com coração e vasculature intacta.
   2. Use tesouras de tecidos ou um bisturi para dissecar afastado do coração, vasculatura tão próximo quanto possível do coração de corte, mantendo-se a vasculatura irá ser usado em passos posteriores para perfusão.
   3. Dissecar cuidadosamente afastado o tecido conjuntivo em torno da traqueia, brônquios e vasculatura utilizando um bisturi ou tesoura.
      NOTA: Determinar o melhor pulmão para usar para o resto do procedimento, escolhendo um pulmão sem grandes cortes ou perfurações através da pleura e grandes quantidades de atelectasia ou oclusão vascular que podem impedir a eficácia do processo de descelularização.
   4. Cortar o pulmão subóptima deixando tanto brônquio ligados à traqueia quanto possível (coração, o tecido conjuntivo e os lóbulos dos pulmões removidos podem ser eliminados). Deve haver um pulmão que continuem ligadas ao traqueia e vasculatura.
      NOTA: Manter seções para histologia, se desejar. ⁹
   5. Feche brônquios desconectados com grampos ou suturas para prevent excesso de refluxo.
   6. Preparar as soluções de decelularização e refrigerar a 4 ° C até serem necessárias (Tabela 1).
   7. Usando uma bomba manual canulada para se ajustar a artéria pulmonar, a perfusão do tecido pulmonar 3 vezes com água desionizada, tanto através da artéria pulmonar e traqueia. Perfundir vasculatura primeiro de cada vez. Comece com cerca de 1 L para a vasculatura e 1,5 L em cada traqueia para perfusão, mas como os detritos celulares são removidos mais líquido pode ser perfundido através do sistema.
   8. Perfundir tanto vasculatura e traquéia com Triton solução X-100.
   9. Submerge tecido pulmonar em solução de Triton X-100 durante 24 h a 4 ° C.
   10. Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar.
   11. Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de desoxicolato.
   12. Submergir as secções de tecido em desoxicolato durante 24 h a 4 ° C.
   13. Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar.
   14. Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de NaCl.
   15. Submergir o tecido em solução de NaCl filtrada durante 1 hora a 4 ° C.
   16. Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar.
   17. Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de DNase.
   18. Submergir o tecido em solução de ADNase filtrada durante 1 hora a 4 ° C.
   19. Perfundir tanto vasculatura e traqueia 5 vezes com PBS.
   20. Dissecar o tecido cartilaginoso perceptível, traqueia e todos os túbulos de 2 mm ou maior em diâmetro (encontrado principalmente em torno do hilo e porções mediais dos pulmões) de condução das vias aéreas, deixando apenas a zona respiratória (principalmente nas áreas periféricas).
   21. Dissecar tecido em 1 seções polegadas ou menores. Orientação do tecido não interessa para este passo.
   22. Deitar fora o excesso de tecido líquido e coloque em tubos de 50 ml cônico. Congelar o tecido a -80 ° C.
       NOTA: Manter seções para histologia para assegurar a remoção de células e debri celulars, se desejado. Usamos H & E, α-galactosidase, PicoGreen, hidroxiprolina, ninidrina, azul de alcian, SDS-PAGE e espectrometria de massa para caracterizar. ⁹
2. Lung Processing
   1. Retirar as tampas de tubos congelados contendo tecido pulmonar decelularizado.
   2. Coloque papel de filtro sobre a abertura do tubo e prenda com elástico.
      NOTA: Tubo e conteúdo ainda deve ser congelado qualquer outro modo, em -80 ° C até congelados.
   3. Liofilizar o tecido até que todo o excesso de líquido está desaparecido, usando um secador de gelo de acordo com as instruções do fabricante. Armazenar a -80 ° C até estar pronto para moinho.
   4. Antes de iniciar adicionar nitrogênio líquido para fábrica de freezer para esfriar isolamento e componentes internos às condições de trabalho.
   5. Retirar bar mill magnético do tubo moinho e adicionar o tecido para cobrir parte inferior.
   6. Substitua bar moinho e adicionar o tecido ligeiramente comprimido. O bar moinho ainda deve mover-se livremente.
   7. Fechar o tubo moinho e place no moinho congelador.
   8. Preencha nitrogênio líquido para linha de preenchimento máximo.
   9. Moinho congelador todo o tecido em pó fino (aproximadamente 5 min, taxa de compactação de ~ 600 ^min-1), em um cilindro de policarbonato com um pêndulo de aço inoxidável, bem como tampões de extremidade de aço inoxidável usando o moinho de congelador de acordo com as instruções do fabricante. Armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para uso.
3. A formação do gel micro-porosa (8 mg / ml) (adaptado a partir de referências ^9,11)
   1. Adicionar 1% (w / v) do pó descelularizado e 0,1% (w / v) de pepsina a HCl 0,01 M, sob agitação constante (deve ser capaz de ver o fluxo no nível superior do líquido), à temperatura ambiente, durante 48 hr.
      NOTA: O pó é estaticamente carregada, então a adição do HCl, depois do pó proporciona a oportunidade para lavar o excesso de fora das paredes do tubo.
   2. Após a digestão durante 48 h, e colocar a solução de reagentes em gelo durante 5 min.
   3. Usando refrigerado 10% (v / v) de NaOH 0,1 M, umad 11,11% (v / v) de PBS 10X (para trazer toda a solução de concentração 1x), levar a solução de proteína digerida a pH fisiológico de 7,4.
      NOTA: A solução pode agora ser armazenada a 4 ° C durante até uma semana. Execute cinética de gelificação utilizando reometria ⁹ se desejar.

2. Cross-ligando hidrogéis para melhorar a força mecânica

1. Soluções de 1%, 0,1%, e 0,01% w / v solução de genipina de reticulação foram preparadas por dissolução da quantidade necessária de pó de genipina em 10% de DMSO.
2. Vortex a solução cada 15 minutos durante 1 hr.
3. Adicionar solução genipina para cobrir hidrogéis ECM (100 uL para cada poço de uma placa de 96 poços) que foram previamente montados na parte 1.3.4.
4. Deixar cada hidrogel ECM para reticular durante 24 h a 37 ° C.
5. Lavar o hidrogel ECM 3 vezes com PBS até a solução de lavagem não é mais azul. Os hidrogéis reticulados então estará pronta para posterior caracterização e ceEstudos de cultura II.

3. Cultura de Células com microporosa Gel

1. Revestimento Bidimensional
   1. Usando a solução de 1.3.3, adicionar 20 ul de solução Pregel a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços não tratados.
   2. refrigere durante a noite a 4 ° C para permitir a adsorção de proteína à placa.
   3. solução Aspirar Pregel e enxaguar com PBS.
   4. Células de passagem ^9.
   5. Adicionar células 10.000 / cm ² a poços.
   6. Aumentar a mídia para 100 jil por poço e incubar a 37 ° C.
2. Três de cultura de células tridimensional ⁹
   1. Utilizando uma solução a partir de 1.3.3, ressuspender as células peletizadas a uma concentração de 1.000.000 células / ml de solução Pregel.
   2. dispensar rapidamente 16 ul de suspensão de células Pregel em cada poço de uma placa de 96 poços, de modo a formar um hidrogel de espessura ~ 500 um para a cultura de células em 3D.
   3. Incubar a 37 ° C durante 30min para o gel para formar.
   4. Adicionar 100 ul de meios de comunicação para o topo de hidrogeles formados e incubar a 37 ° C.
3. Três de cultura de células tridimensional em geles de rigidez variável
   1. Utilizando uma solução a partir de 1.3.3, pipeta 100 uL de solução Pregel em cada poço de uma placa de 96 poços.
   2. Incubar a 37 ° C durante 30 minutos para formar gel.
      Nota: Cross-ligando passos da parte 2 podem ser usados ​​aqui.
   3. Células de passagem ^9.
   4. Adicionar células 10.000 / cm ² a poços.
   5. Aumentar a mídia para 100 jil por poço e incubar a 37 ° C.

Resultados

Usando este método, temos produzido a partir de hidrogéis de porco normal, rato, e pulmões de ratinho (Figura 1). pulmões transformados fornecer um valor estimado de 5 mg, 40 mg, e 10 g de ECM em pó respectivamente. Uma visão geral do processo é mostrado na Figura 2. visualizações chave durante o processo incluem: aparência branca dos pulmões após a lavagem desoxicolato; após a formação Pregel, a solução deve ser opaco e a solução deve aparecer homogénea...

Discussão

Um dos aspectos integrais da biologia é a auto-organização das moléculas em estruturas hierárquicas que executam uma tarefa específica. ¹³ No laboratório, a auto-montagem depende de numerosos factores tais como a concentração de sal, pH, e a duração de digestão. Como mostrado, uma auto-organização de formas de hidrogel quando as proteínas solubilizadas retornar a uma temperatura fisiológica. O hidrogel formado é capaz de promover a adesão celular e a proliferação in vitro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Use em capela de exaustão com proteção para os olhos e luvas.
Desoxicolato de Sódio	Sigma-Aldrich	D6750-100g	Use no capuz com proteção para os olhos e luvas.
Sulfato de magnésio	Sigma-Aldrich	M7506-500g	Nenhum
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C1016-500g	Nenhum
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU	Nenhum
HCl	Sigma-Aldrich	258148-500ML	Use com proteção para os olhos e luvas.
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G	Use em capela de exaustão com proteção para os olhos e luvas.
Hidróxido de Sódio	Fisher Scientific	BP359-500	Use com proteção para os olhos e luvas.
Genipin	Wako Chemicals	078-03021	Use em capela de exaustão com proteção para os olhos e luvas.
PBS 10x	Quality Biological	119-069-151	Nenhum
PBS	VWR	45000-448	Nenhum
Papel de Filtro	Whatman	8519	N/A
Bomba Manual	Fisher Scientific	10-239-1	N/A
Copo de Graduação	VitLab	445941	N/A
Cryomill	SPEX	6700	Use criogludas e olho proteção.
Liofilizador	FTS FlexiDry		Use luvas.
Reômetro	Discovery	HR-2	Use luvas e proteção para os olhos.