Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Resumo

Este é um método para criar uma estrutura de suporte de cultura de células 3-dimensional a partir da matriz extracelular pulmonar. pulmão intacto é transformado em hidrogéis que podem suportar o crescimento das células em três dimensões.

Resumo

Aqui é apresentado um método para o estabelecimento de múltiplos componentes hidrogéis de cultura de células para a cultura de células em pulmão in vitro. Começando com saudável en bloc tecido pulmonar de porcino, rato ou ratinho, o tecido é submergido perfundidos e em detergentes químicas subsequentes para remover os detritos celulares. Comparação histológica do tecido antes e depois do processamento confirma a remoção de mais de 95% de ADN de cadeia dupla coloração e alfa-galactosidase sugere a maioria dos detritos celulares são removidos. Após a descelularização, o tecido é, em seguida, liofilizado e cryomilled em um pó. O pó de matriz é digerido durante 48 horas numa solução de pepsina a digestão ácida e, em seguida, neutralizou-se para formar a solução Pregel. A gelificação da solução Pregel pode ser induzida através da incubação a 37 ° C e pode ser utilizada imediatamente após a neutralização ou armazenado a 4 ° C durante até duas semanas. Os revestimentos podem ser formados utilizando a solução Pregel sobre uma chapa não tratada para Capego ell. As células podem ser suspensas no Pregel antes de auto-montagem para alcançar uma cultura 3D, plaqueadas sobre a superfície de um gel formado a partir do qual as células podem migrar através do andaime, ou revestida sobre os revestimentos. Alterações à estratégia apresentada pode ter impacto na temperatura de gelificação, força ou tamanhos dos fragmentos de proteína. Além formação de hidrogel, o hidrogel de rigidez pode ser aumentada usando genipina.

Introdução

Traduzir resultados in vitro para a clínica é uma das questões mais desafiadoras enfrentadas pelos pesquisadores biomédicos. A pesquisa in vitro em plástico de cultura de tecidos é mais fácil, mais conveniente e mantém alta viabilidade celular. ¹ Essa abordagem é um ponto de partida razoável, mas os resultados têm tradução clínica limitada. Cada vez mais, os laboratórios estão incorporando construções tridimensionais para substituir os métodos bidimensionais tradicionais. As revisões estão disponíveis para muitos ambientes tridimensionais, desde andaimes biológicos até andaimes poliméricos. ^2,3

As est....

Protocolo

Solução	filtro esterilizado	Instruções
2 O DIH	sim	DIH 2 O; esterilizada por filtração
0,1% de solução de Triton X-100	sim	Sob hotte adicionar 100 uL de Triton X-100 a 100 ml solução DIH 2 O e agitar até à dissolução; filtro esterilizado.
2% de desoxicolato Solução	sim	Sob exaustor adicionar 2 g solução de desoxicolato de sódio por 100 ml DIH 2 O....

Resultados

Usando este método, temos produzido a partir de hidrogéis de porco normal, rato, e pulmões de ratinho (Figura 1). pulmões transformados fornecer um valor estimado de 5 mg, 40 mg, e 10 g de ECM em pó respectivamente. Uma visão geral do processo é mostrado na Figura 2. visualizações chave durante o processo incluem: aparência branca dos pulmões após a lavagem desoxicolato; após a formação Pregel, a solução deve ser opaco e a solução deve aparecer homogénea.......

Discussão

Um dos aspectos integrais da biologia é a auto-organização das moléculas em estruturas hierárquicas que executam uma tarefa específica. ¹³ No laboratório, a auto-montagem depende de numerosos factores tais como a concentração de sal, pH, e a duração de digestão. Como mostrado, uma auto-organização de formas de hidrogel quando as proteínas solubilizadas retornar a uma temperatura fisiológica. O hidrogel formado é capaz de promover a adesão celular e a proliferação in vitro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Use em capela de exaustão com proteção para os olhos e luvas.
Desoxicolato de Sódio	Sigma-Aldrich	D6750-100g	Use no capuz com proteção para os olhos e luvas.
Sulfato de magnésio	Sigma-Aldrich	M7506-500g	Nenhum
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C1016-500g	Nenhum
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU	Nenhum
HCl	Sigma-Aldrich	258148-500ML	Use com proteção para os olhos e luvas.
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G	Use em capela de exaustão com proteção para os olhos e luvas.
Hidróxido de Sódio	Fisher Scientific	BP359-500	Use com proteção para os olhos e luvas.
Genipin	Wako Chemicals	078-03021	Use em capela de exaustão com proteção para os olhos e luvas.
PBS 10x	Quality Biological	119-069-151	Nenhum
PBS	VWR	45000-448	Nenhum
Papel de Filtro	Whatman	8519	N/A
Bomba Manual	Fisher Scientific	10-239-1	N/A
Copo de Graduação	VitLab	445941	N/A
Cryomill	SPEX	6700	Use criogludas e olho proteção.
Liofilizador	FTS FlexiDry		Use luvas.
Reômetro	Discovery	HR-2	Use luvas e proteção para os olhos.