Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos

Autophagy é uma via de degradação evolutivamente conservada, a qual é induzida em resposta a diversas condições de stress tais como hipoxia fome e ^{1, 2.} Durante a autofagia, vesículas de dupla membrana, chamada autofagossomas, incorporar componentes subcelulares desnecessários ou danificados e transportá-los para lisossomos para degradação ^3. Autofagia basal é essencial para a função celular e desenvolvimento organismo, e autofagia basal prejudicada está implicada em muitas doenças, incluindo a neurodegeneração, tumorigénese e diabetes ^{4, 5, 6} do tipo 2.

O indutor autofagia fisiológico mais conhecido é fome. No entanto, tem duas limitações principais. Em primeiro lugar, a fome leva um longo período para induzir eficazmente a autofagia em animais, por exemplo, 48 horas de restrição alimentar em ratosna maioria dos órgãos. Em segundo lugar, apenas induz inanição autofagia cérebro, devido a um fornecimento de nutrientes relativamente estável no cérebro. Na verdade, também é difícil de detectar indução autofagia por indutores de pequenas moléculas, como muitas drogas não pode passar a barreira hemato-encefálica. Assim, para analisar melhor a função de activação autofagia na patogênese da doença, descobrimos recentemente que o exercício é um método fisiológico mais potente para induzir autofagia num curto período de tempo de ^{7, 8, 9.} Em comparação com a fome, a autofagia é efetivamente induzido pela esteira correndo tão rápido quanto 30 min. Assim, o exercício é uma abordagem conveniente e potente fisiológico para estudar o mecanismo de autofagia na mediação de benefícios para a saúde e prevenção de doenças.

Existem vários marcadores proteicos para a detecção de actividade autofagia, incluindo LC3 e p62. LC3 (associada a microtúbulos de proteína 1A / 1B-luz cHain 3) é uma proteína citosólica (LC3-I formam) que é conjugado com PE (fosfatidiletanolamina) após indução autofagia. LC3 PE-lipidada (forma LC3-II) é recrutado para membranas autophagosomal e pode ser usado para visualizar autofagossomas quando marcado com GFP. A sua translocação para o citosol a partir de estruturas puntiformes de autofagossomas sob microscopia é uma indicação da indução autofagia. p62 é um receptor de carga para substratos autophagy (tais como proteínas de ubiquitinação), e é incorporado autofagossomas bem. Uma vez que a proteína é degradada em lisossomas, juntamente com autofagossomas, os seus níveis podem ser usadas para medir o fluxo de autofagia. Aqui nós mostramos como utilizar esses marcadores para quantificar a autofagia em diferentes tecidos de camundongos induzida por exercício aeróbico, incluindo exercício forçado (esteira) e exercício voluntário (rodas de correr). Os mesmos procedimentos podem também ser aplicados para a medição in vivo de autofagia após o tratamento de outros indutores.

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Northwestern (IACUC).

1. mouse Models

1. Use ratos 8-12 semanas de idade no treinamento físico. Para detectar autofagia induzida exercida in vivo, os ratinhos transgénicos usar GFP-LC3 (C57BL / 6, fundo) para estudos de imagiologia e murganhos C57BL / 6 para as análises bioquímicas.

2. Autophagy induzida pelo exercício

1. Configuração de esteira - exercício forçado
   1. Aclimatar e treinar os ratos em um 10 ° esteira aberta para cima por 2 dias. No dia 1, exercer a ratos durante 5 min a 8 m / min, e no dia 2, exercer os ratos durante 5 min a 8 m / min, seguido por mais 5 min a 10 m / min ^10. Incentivar os ratos para ser executado por cotovelada mão suave.
   2. No ^3º dia, deixou os ratos submetidos a uma única sessão de correr por 90 min no 10 ° subida esteira, starting a uma velocidade de 10 m / min. Após 40 minutos, aumente a velocidade da esteira a uma velocidade de 1 m / min a cada 10 min durante um total de 30 min, e em seguida aumentar a velocidade com a velocidade de 1 m / min a cada 5 minutos até atingir 17 m / min, para um total de 90 min de tempo de exercício e 1.070 metros de a distância de funcionamento.
   3. Defina o estímulo elétrico na faixa de baixa intensidade (1,2 Hz), e incentivar os ratos que correr para evitar choques repetidos pé.
   4. Para a coleta de tecidos, eutanásia os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocamento cervical imediatamente após o exercício. Outros métodos de eutanásia aprovados também podem ser utilizados, tais como CO2 ou injecção IP de outros anestésicos. O nível de autofagia não parece ser afectado por métodos de eutanásia.
2. Executar a instalação roda - exercício voluntário
   1. Coloque uma roda de execução do rato (11,4 cm de diâmetro) dentro de uma gaiola com um rato alojados individualmente.
   2. Verificar a capacidade corrente e com uma conta-quilómetros de bicicleta.Configure o parâmetro de roda [distância (em mm) por rotação completa da roda] em 358 (11,4 * π). Medir a distância percorrida após 24 horas.
   3. Deixe o mouse correr voluntariamente para 2 semanas com a roda de corrida. Para a coleta de tecidos, sacrificar o mouse na parte da manhã após o período de execução.

3. Autophagy Avaliação Flux

1. Para medir o fluxo autofágica sob repouso e exercício condições, tratar ratos com a cloroquina inibidor autofagia por três dias e compará-los com os ratinhos tratados com PBS.
   1. Dissolve-se cloroquina em PBS (5 mg / ml), e injectar cloroquina em ratinhos por via intraperitoneal na dose de 50 mg / kg / dia durante três dias consecutivos. Sacrificar os ratinhos e recolhem tecidos de 3 horas após a última injecção.
   2. Para ratinhos exercidas, o pré-tratamento com cloroquina-los durante dois dias consecutivos, a uma dose de 50 mg / kg / dia. No terceiro dia, injectar os ratinhos com a mesma concentração de cloroquina, e depois90 min deixá-los correr na esteira por mais 90 min.
   3. Eutanásia os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocação cervical. Recolhe tecidos imediatamente após a execução, de modo que o tempo total de incubação de cloroquina é o mesmo que o controlo (de repouso) ratinhos (3 h).
      NOTA: Como alternativa, usar uma única injecção de cloroquina para determinar o fluxo autofagia em tecidos de ratinho.

4. Tissue Colheita e Fixação

1. Antes da colheita de tecido preparar a solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fresco a 4% de paraformaldeído (PFA, cuidado: equipamentos de protecção pessoal necessário) em PBS a um pH final de 7,4. Armazenar ambas as soluções a 4 ° C.
2. Encher 30 ml de seringa com 15 - 20 ml de 4% de PFA (para ratinhos GFP-LC3). Ligar a seringa com uma agulha G 20 cateter.
3. Depois do exercício, sacrificar os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocação cervical.
4. Colocar o animal em uma superfície de trabalho limpa em seu back. Cortar e abrir a cavidade torácica, cortando o diafragma para expor o coração.
5. Fazer uma pequena incisão no fígado para permitir que o sangue sair, e injectar um total de 15 ml de 4% de PFA lentamente dentro do ventrículo direito do coração, através do cateter, até que o pulmão e fígado transformar completamente pálido. Perfundir o rato imediatamente após a sessão de exercício, usando uma bomba de seringa com um caudal constante de 90 ml / hr.
6. Após a perfusão, retire a agulha e recolher tecidos de interesse (por exemplo cerebrais ¹¹ e no músculo esquelético). Para o músculo esquelético, dissecar vasto lateral. Resumidamente, puxar a pele da perna para trás para expor a musculatura, localizar os quadríceps ^12, e dissecar vasto lateral, que é o músculo externo ligado à porção superior do osso femoral.
7. Para mais a fixação e a desidratação, colocar os tecidos de murganhos GFP-LC3 em PFA a 4% durante 24 h a 4 ° C, e, em seguida, transferi-los para 15%sacarose-PBS a 4 ° C durante a noite ou até que os tecidos tenham resolvido, e, em seguida, a 30% de sacarose-PBS a 4 ° C durante a noite ou durante mais tempo de armazenamento. Manter as amostras no escuro, tanto quanto possível uma vez que podem ser sensíveis a uma luz forte.
8. Para a análise Western Blot encaixe congelar os tecidos a partir de ratinhos C57BL / 6 directamente em azoto líquido, e armazená-las a -80 ° C.

5. Análise de Imagem de GFP-LC3 puncta

1. processo de tecido
   1. Pré-tratamento dos tecidos (previamente fixas em PFA e armazenados em 30% de sacarose) em forma de incorporação tais como "composto de temperatura óptima de corte" (OCT) durante alguns minutos numa pequena placa de petri rotulados.
   2. Transferir o tecido em um cryomold marcado contendo o suficiente fresco OCT para cobrir o tecido. Orient a superfície de corte para a parte inferior do cryomold (seção transversal para o músculo vasto lateral e corte sagital para o hemi-cérebro). Evitar a formação de bolhas.
   3. freeze as amostras colocando a cryomold para poucos minutos em um aplicador coberto de espuma cheio de gelo seco, até que a OCT torna-se branca. Enrole amostras individuais em chapas marcadas, selá-los em um saco plástico, e armazená-los a -80 ° C durante a noite ou mais.
   4. Use um criostato para cortar seções de amostra com uma espessura de 10 um, e montar as seções sobre os slides. Armazenar as lâminas a -20 ° C, e manter sempre as lâminas ao abrigo da luz, sempre que possível.
2. preparação da lâmina
   1. Retirar as lâminas do congelador e descongelar-los à temperatura ambiente. Cobrir a secção de tecido com uma gota de meio de montagem com DAPI. Coloque uma lamela de tamanho adequado no topo e evitar a formação de bolhas.
   2. Use unha polonês para selar as bordas da lamela, permitir que unha polonês para secar no escuro à temperatura ambiente, e, em seguida, armazenar as lâminas em um recipiente à prova de luz, a 4 ° C, ou prosseguir com captura de imagem de puncta GFP-LC3.
3. <strong> Quantificação da GFP - LC3 puncta por microscopia de fluorescência
   1. Execute microscopia de epifluorescência, capturando imagens na mesma condição (de exposição e ajustes) para todas as amostras. Para GFP, usar um comprimento de onda de emissão de 525 nm; para DAPI, utilizar 490 nm. Adquirir, pelo menos, dez imagens por exemplo utilizando uma objectiva de 60X para vasto lateral e a região do córtex frontal do cérebro.
   2. Quantificar o número de pontos lacrimais GFP-LC3 em uma área de tecido de 2,500 uM ² em cada imagem para análise estatística, cego para os grupos experimentais. Calcule o número médio de 10 imagens de cada amostra, utilizando a função de medição automática de "Contagem de Objetos". Definições para o músculo vasto lateral são: Limiar L = 10, H = 200; 2X suavizar; 1X limpo, e configurações para o córtex frontal do cérebro são: Limiar L = 11, H = 200; 2X suavizar; 1X limpo.

6. Ocidental Análise Blot em Autophagy Markers

1. <strong> processo Tissue
   1. Preparar o tampão de lise: Tris-HCl 50; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; 1% de Triton X-100; inibidor da protease e inibidores de fosfatase (recém-adicionado).
   2. Remover o tecido de murganhos C57BL / 6 a partir de -80 ° C de armazenamento. Cortar o tecido muscular em pequenos pedaços com uma lâmina de barbear antes com o seguinte processo. Adicionar 800 uL (por hemi-cérebro), ou 500 ul (para vasto lateral) de tampão de lise frio para a amostra. Homogeneizar a amostra a 4 ° C com um homogeneizador a uma velocidade média.
   3. Totalmente lisar a mistura homogeneizada durante mais 30 minutos a 1 hora a 4 ° C com rotação.
   4. Girar o homogenato a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C, descartar o sedimento, e recolher o sobrenadante num novo tubo.
2. análise de autofagia
   1. Determinar a concentração de proteína de lisados ​​de tecido, utilizando o kit de ensaio de BCA proteína de acordo com as especificações do fabricante. Normalizar cada amostraà mesma concentração.
   2. Combinar a amostra com o tampão de amostra 2x Laemmli numa proporção de 1: 1, ferver a 95 ° C durante 5 - 10 min, e prosseguir com a análise de Western blot em autofagia marcadores ^{13, 14,} tal como um anticorpo anti-p62 a p62 (, diluição de 1: 500) e anticorpo anti-LC3 LC3 (, diluição 1: 500). Ferver as amostras imediatamente após a adição do tampão de amostra, como mais tempo de incubação no gelo pode gerar múltiplas bandas degradadas de LC3.
   3. Quantificar p62 e LC3 bandas por análise de densitometria usando ImageJ, e normalizar o valor para a banda de actina correspondente.

Este protocolo descreve dois métodos diferentes para induzir a autofagia em tecidos de camundongos por exercício aeróbico: um total de 90 min de exercício forçado em uma esteira multi-lane passou por dois dias de aclimatação; ou duas semanas de exercício voluntário em uma roda de corrida usados ​​por camundongos alojados individualmente. Em cada protocolo de exercício, podemos medir o fluxo autofagia por microscopia de fluorescência e análise western blot em vários órgãos.

Nós usamos uma linha de rato transgénico expressando LC3 GFP como um sistema repórter para monitorizar a autofagia pelo exercício 1. Após a indução autofagia, LC3 transloca desde o citosol para o autophagosome em estruturas puntiformes. Depois de cortar, a formação de pontos lacrimais GFP-LC3 pode ser directamente visualizadas por microscopia de fluorescência (Figura 1A). Alternativamente, as estruturas podem ser também autophagosome imunocoradas por um anticorpo para a LC3imagiologia. De qualquer 90 min de exercício esteira ou 2 semanas de corrida voluntária aumentou o número de pontos lacrimais GFP-LC3 em ambos músculo esquelético (músculo vasto lateral) e córtex cerebral, em comparação à condição de repouso (Figura 1B). Deve notar-se que a região do córtex frontal tem sido a principal região no cérebro onde é claramente autofagia induzida por qualquer um dos métodos até agora. Exercício também induziu a conversão de LC3 a partir da forma citosólica (LC3-I) para a forma conjugados com lípidos (LC3-II), que pode ser detectada por análise de Western blot (Figura 1C).

incremento induzida pelo exercício de autofagossomas (representados por LC3-II e GFP-LC3 pontos lacrimais) é devido a um fluxo autophagic elevada, em vez de um bloco na degradação autophagosome, avaliada pelo uso de inibidores da degradação lisossomal, tal como a bafilomicina A1 ou cloroquina . Aqui nós medimos a degradação do p62 do receptor de carga autophagic como um examplo. Exercício (90 min de esteira) provocou uma degradação mais elevado de p62 no músculo esquelético do que a condição de repouso, o qual foi resgatada por injecção com cloroquina antes do exercício (Figura 2). Os resultados similares também são observados com exercício voluntário executando rodas. Assim, o exercício aeróbico por esteira ou rodas de correr induz a autofagia in vivo, medido pelo nível de estado estacionário de LC3 e a degradação da p62.

Figura 1. Exercício aeróbico Induz Autophagy no mouse tecidos. Imagens representativas (A) e quantificação (B) dos pontos lacrimais GFP-LC3 no músculo esquelético (músculo vasto lateral) e cérebro (córtex frontal) dos ratinhos transgénicos GFP-LC3 sob a condição de controle (em repouso), Após 90 min de exercício forçado (esteira ) ou após 2 semanas de exercício voluntário (roda). Resultados representam a média ± SEM de 10 fotos por mouse. N = 5 ratinhos. Foram utilizados os seguintes comprimentos de onda de emissão: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. (C) a detecção de Western blot de LC3 no músculo esquelético (vasto lateral) de camundongos descansado e exercitados (pela esteira). dados de quantificação representam o nível de LC3-II normalizado para actina (esquerda) e a proporção de LC3-II para LC3-I (direita). N = 3 ratos. Estatística é comparar cada valor para a amostra de controlo. Os resultados representam a média ± sem *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001, teste t. Barra de escala, 25 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. O exercício aumenta Autophagy Flux no mouse Skeletal Muscle. (A) Western blotdetecção de p62 no vasto lateral de ratos descansado e exercidas na presença ou ausência da cloroquina inibidores do lisossoma. (B) (esquerda) Quantificação da análise de p62 normalizada para a banda de actina correspondente. (Direita) O fluxo de p62 é determinada subtraindo-se o valor densitométrico normalizada de p62 tratado com PBS a partir de que p62 tratadas com cloroquina. Os resultados representam a média ± SEM n = 3 ratos. *, P <0,05, teste-t. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.