Autophagy activação é benéfico na prevenção de uma série de doenças. Uma das abordagens fisiológicas para induzir autofagia in vivo é o exercício físico. Aqui nós mostramos como ativar a autofagia pelo exercício aeróbico e medir os níveis de autofagia em camundongos.
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Artigo de método
Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A autofagia é uma via de degradação lisossômica essencial para a homeostase, função e diferenciação celular. Sob condições de estresse, a autofagia é induzida e tem como alvo várias cargas, como citosol a granel, organelas danificadas e proteínas mal dobradas, para degradação em lisossomos. As moléculas de nutrientes resultantes são recicladas de volta ao citosol para nova síntese de proteínas e produção de ATP. A regulação positiva da autofagia tem efeitos benéficos contra a patogênese de muitas doenças, e estratégias farmacológicas e fisiológicas para ativar a autofagia têm sido relatadas. O exercício aeróbico é recentemente identificado como um indutor de autofagia eficiente em vários órgãos em camundongos, incluindo músculos, fígado, coração e cérebro. Aqui mostramos procedimentos para induzir autofagia in vivo por meio de exercícios forçados em esteira ou corrida voluntária de rodas. Também demonstramos métodos microscópicos e bioquímicos para analisar quantitativamente os níveis de autofagia em tecidos de camundongos, usando as proteínas marcadoras LC3 e p62 que são transportadas e degradadas em lisossomos junto com autofagossomos.
Introdução
Autophagy é uma via de degradação evolutivamente conservada, a qual é induzida em resposta a diversas condições de stress tais como hipoxia fome e 1, 2. Durante a autofagia, vesículas de dupla membrana, chamada autofagossomas, incorporar componentes subcelulares desnecessários ou danificados e transportá-los para lisossomos para degradação 3. Autofagia basal é essencial para a função celular e desenvolvimento organismo, e autofagia basal prejudicada está implicada em muitas doenças, incluindo a neurodegeneração, tumorigénese e diabetes 4,
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Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Northwestern (IACUC).
1. mouse Models
- Use ratos 8-12 semanas de idade no treinamento físico. Para detectar autofagia induzida exercida in vivo, os ratinhos transgénicos usar GFP-LC3 (C57BL / 6, fundo) para estudos de imagiologia e murganhos C57BL / 6 para as análises bioquímicas.
2. Autophagy induzida pelo exercício
- Configuração de esteira - exercício forçado
- Aclimatar e treinar os ratos em um 10 ° esteira aberta p....
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Resultados
Este protocolo descreve dois métodos diferentes para induzir a autofagia em tecidos de camundongos por exercício aeróbico: um total de 90 min de exercício forçado em uma esteira multi-lane passou por dois dias de aclimatação; ou duas semanas de exercício voluntário em uma roda de corrida usados por camundongos alojados individualmente. Em cada protocolo de exercício, podemos medir o fluxo autofagia por microscopia de fluorescência e análise western blot em vários órgãos.
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Discussão
A autofagia é um processo catabólico que fornece energia e reduz a citotoxicidade pela degradação lisossomal de componentes citoplasma ou organelas danificadas. Estudar a autofagia é importante compreender a regulação da homeostase celular e os mecanismos de resposta ao estresse. Novos modelos e metodologias estão a surgir no domínio da investigação 15, para estudar como autofagia deficiente contribui para inúmeros processos patológicos 16, 17........
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos ao Laboratório de Histologia e Fenotipagem de Camundongos da Northwestern University pelo suporte e assistência técnica e a Noboru Mizushima (Universidade de Tóquio) por fornecer camundongos transgênicos GFP-LC3. A. R. e C. H. foram apoiados pelos fundos iniciais da Northwestern University e pela doação do National Institutes of Health (DK094980).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Esteira | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse roda de corrida | Super Pet | 100079365 | diâmetro 11,4 cm |
| Odômetro | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Bomba de seringa | KD Scientific | KDS100 | |
| Microscópio de fluorescência | Nikon | Modelo: microscópio invertido ECLIPSE | |
| Homogeneizador Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| IKA | 003737001 / Modelo: T10 Basic S1 | ||
| Cloroquina | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Equipamento de proteção individual necessário. Este produto pode liberar gás formaldeído, um produto químico conhecido por causar câncer. |
| Vector | Laboratories | H-1200 | |
| p62 anticorpo | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 anticorpo | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | Laboratories 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
Referências
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al.
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Reimpressões e permissões
