Artigo de método

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

DOI:

10.3791/55101

⸱

3 de janeiro de 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Houston, 3Delaware Biotechnology Institute

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve a implementação da degradação de hidrogel baseada em laser guiada por imagem para fabricar redes microfluídicas biomiméticas derivadas de vasculares incorporadas em hidrogéis de poli(etilenoglicol) diacrilato (PEGDA). Esses sistemas microfluídicos biomiméticos podem ser úteis para aplicações de engenharia de tecidos, geração de modelos de doenças in vitro e fabricação de dispositivos avançados "on-a-chip".

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalhado descreve a aplicação de guiada por imagem, a degradação do hidrogel à base de laser para a fabricação de redes de microfluidos derivada-vasculares incorporados em hidrogéis PEGDA. Aqui, descrevemos a criação de máscaras virtuais que permitem o controle do laser guiada por imagem; a fotopolimerização de um hidrogel PEGDA micromolded, adequadas ao fabrico de rede microfluídicos e fluxo orientado a cabeça de pressão; a instalação e utilização de um laser scanning microscópio confocal comercialmente disponível emparelhado com um pulsada Ti femtosecond: Laser S para induzir a degradação de hidrogel; ea imagem das redes microfluídicos fabricados com espécies fluorescentes e microscopia confocal. Grande parte do protocolo está focado na configuração adequada e implementação do software microscópio e microscópio macro, já que esses são passos fundamentais para usando um microscópio comercial para fins de fabricação microfluídicos que contêm uma série de complexidades. O componente guiada por imagem desta technique permite a implementação de pilhas de imagens 3D ou modelos 3D gerados pelo usuário, permitindo assim para o projeto microfluídico criativo e para a fabricação de sistemas microfluídicos complexos de praticamente qualquer configuração. Com um impacto esperado na engenharia de tecidos, os métodos descritos neste protocolo pode ajudar na fabricação de construções microtissue biomiméticos avançados para dispositivos zações e humanos-on-a-chip. Imitando a arquitectura complexa, tortuosidade, o tamanho e densidade dos vasos in vivo, os processos biológicos essenciais de transporte pode ser replicado nestas construções, levando a modelação mais precisa farmacocinética in vitro de droga e doença.

Introdução

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O sistema vascular, que consiste em ambos linfático e cardiovasculature, formas redes altamente densos que são essenciais para o transporte de nutrientes e de oxigénio e para a remoção de resíduos metabólicos. Por conseguinte, as células residentes nos tecidos vascularizados são nunca mais do que 50-100 uM de distância a partir de um recipiente 1. A capacidade de reproduzir in vivo arquitetura vascular in vitro é crítica para modelar com precisão in vivo de processos de transporte que utilizam construções de engenharia. Com uma movimentação recente para desenvolver dispositivos de órgãos-on-a-chip 2 para medicamentos de alto rendimento de triagem 3,4 e modelagem de doença 5,6, métodos para criar redes microfluídicos que recapitulam o transporte in vivo -como em hidrogéis sintéticos ou naturais são desenho interesse significativo. Para melhorar a biomimética de microtissues utilizados nestes dispositivos, desenvolvemos, um método de degradação do hidrogel à base de laser guiada por imagem que utiliza tridimensional ocapilhas l de imagem (3D) da vasculatura nativa como modelos para gerar redes microfluídicos derivados do vasculares embutidos em PEGDA hidrogéis 7. Este protocolo descreve o uso de um microscópio confocal de varrimento laser disponível comercialmente equipada com um laser pulsado femtosegundo para fabricar, redes de microfluidos biomiméticos derivada-vasculares em hidrogeles através da degradação da PEGDA guiada por imagem, à base de laser.

As abordagens atuais para fluidificar hidrogéis incluem a indução de vasculogenic 8-10 ou técnicas de automontagem 10-12 células endoteliais e microfabricação angiogénicos para criar canais pré-definidos para endotelização 13-16. Embora as redes de auto-montados recapitular a densidade e arquitetura complexa de microvasculatura, eles são muitas vezes mais permeável do que in vivo redes 11,17,18, o que pode ser problemático em transporte de modelagem para aplicações de rastreio de drogas. redes auto-organizadas consistem em physiologcamente relevante, vasos capilares porte-, mas eles podem ser difíceis de integrar com o fluxo de fluido em massa devido às limitações na geração de navios de porte arteríolas maiores. Como não há controle direto sobre o conjunto dessas redes, a arquitetura final pode variar de amostra para amostra, o que torna difícil para produzir repetidamente redes com as mesmas propriedades de fluxo e transporte de fluidos.

Para gerar 3D, redes microfluídicos embebidos em hidrogel com geometria repetível e arquitetura bem definida, uma série de técnicas de microfabricação foram desenvolvidas, incluindo a montagem modular 13, a impressão 3D de materiais sacrificiais 16, montagem e gravação direta 14 e impressão omnidirecional 15. Aplicando estes métodos, arquitetura microfluídico, e propriedades de fluxo e de transporte, portanto, fluidos, podem ser repetidamente fabricados através de muitas construções. Uma das principais limitações destas abordagens, no entanto, é a incapacidade de criar MICROFluidic redes capilares com características de tamanho, 4-a 10 uM 19. A maioria das técnicas de microfabricação são muitas vezes limitados a funcionalidades variando de 150 a 650 mícrons de diâmetro 13,16. Algumas técnicas existentes são capazes de gerar redes hierárquicos com canais em toda uma gama de diâmetros de largura e 10 a 300 um para a montagem e escrita directa 14, e 18 a 600 um para a impressão omnidireccional 15, mas eles são limitados na sua capacidade para gerar redes densas ou para produzir várias redes microfluídicos nas proximidades dentro de uma única construção 7.

Para superar algumas destas limitações, desenvolvemos, uma técnica de degradação hidrogel à base de laser guiada por imagem que permite a fabricação repetitiva de biomimética, redes microfluídicos hierárquicas que recapitulam a arquitetura da microcirculação in vivo. Para isso, a 790 nm, 140 femtossegundos (fs) laser pulsado operando a 80 MHz é digitalizada-raster in desejado locais 3D dentro de um hidrogel, tal como definido por imagens da vasculatura in vivo. Especula-se que o processo de degradação opera através do colapso induzido por laser óptico de água, a formação de plasma resultante, o subsequente expansão termoelástica rápida de água, e a degradação do local do hidrogel como a água se expande 20. Este mecanismo varia ligeiramente de degradação à base de laser de hidrogeles à base de proteína de 21-24. Ao contrário PEGDA, que tem uma secção transversal multifotônica baixo, proteínas, muitas vezes têm uma grande secção transversal multifotônica e, portanto, são degradados através de uma multifotônica induzida por absorção química ruptura 23. Para gerar redes de microfluidos guiada por imagem, o obturador de laser é controlado por máscaras virtuais derivado de imagem, que consistem de um mosaico de regiões de interesse 9 que definem a arquitectura de microfluidos. Usando essa abordagem, nós demonstramos a capacidade de fabricar MICROFLUID biomimético derivada-vascular 3Dredes ic, que recapitulam a arquitectura densa e tortuoso da vasculatura, in vivo, a fim de controlar localmente a porosidade de hidrogéis, alterando a quantidade de energia fornecida durante a degradação. Nós também foram capazes de gerar duas redes microfluídicos independentes que se entrelaçam na proximidade (15 mm), mas nunca se conectam diretamente 7. Nós também demonstraram a capacidade de endothelialize microcanais laser de pós degradada através de degradação funcionalização com a sequência do péptido de ligação de integrina, Arginina-Glicina-Ácido aspártico-serina (RGDS), para promover a adesão de células endoteliais e formação de lúmen 7.

Com este protocolo, a geração de redes complexas microfluídicos em hidrogéis PEGDA é possível através da degradação guiada por imagem, baseada em laser usando um microscópio disponível comercialmente acessível em muitos campi universitários. À medida que o processo de degradação é guiado por virtuais, máscaras digitais, esta Fabricação técnica é favorável para a criação de redes de microfluidos criativo, permitindo o seu uso numa grande variedade de aplicações. Prevemos que o método descrito aqui será mais vantajosa em projetar dispositivos zações e humanos-on-a-chip biomiméticos capazes de replicar processos de transporte biológicas importantes na modelagem de transporte da droga 2. Esta técnica de fabricação podem também ser de interesse para a geração de modelos de doenças in vitro, incluindo metástases do cancro 5,6 e modelos barreira hemato-encefálica 25. Como a degradação hidrogel à base de laser tenha sido previamente utilizado para criar faixas para a orientação de crescimento neuronal 21-23, a extensão guiada por imagem desta técnica poderia ser útil em estratégias avançadas de engenharia de tecidos para posicionar células em arranjos espaciais em 3D definidos pelo usuário.

Protocolo

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1. Geração de Máscaras virtuais

NOTA: Uma pilha de imagens 3D da microvasculatura do cérebro do rato foi escolhido como o modelo microfluídico para este protocolo, tendo sido abatidos a partir de um conjunto de dados muito maior que contém as imagens de toda uma microvasculatura do cérebro do rato. Imagens microvasculares foram adquiridos através de microscopia de varredura de lâmina de faca (KESM) 26, 2; dados microvasculares semelhantes são abertamente disponível através do Atlas KESM rato Cérebro 28.

  1. Abra a imagem do software de processamento 29 e aberto e cortar a pilha de imagens 3D TIF da vasculatura nativa para que a rede microfluídico desejado, a ser gerada dentro do hidrogel, se encaixa em um 450 mm x 450 mm x 1,5 mm (x por y por z) janela. Para fazer isso, desenhar um quadrado em torno da região desejada e clique em "Imagem" → "Cortar". Retire as fatias na direção z, clicando em "Imagem" → "Duplicate" e digite uma fatia desejadoalcance.
    NOTA: Isso garante que as características desejadas caber dentro do campo de visão (x por y) (531,2 x 531,2 mm quando se usa um 20X (NA1.0) objectiva de imersão em água com um tamanho de quadro de 2.884 x 2.884 pixels e um zoom de 0,8 com um laser de varredura microscópio confocal) ea distância de trabalho (z) de uma objectiva de imersão em água 20X (NA1.0). Se desconhecido, o campo de visão para outros sistemas pode ser determinada por aquisição de uma imagem com o objectivo pretendido e configurações.
  2. Gire a pilha de modo a que os recursos estão alinhados principalmente com a direção da digitalização raster, ou direção x, clicando em "Imagem" → "Transform" → "Girar". Isto diminui o tempo necessário para a fabricação.
  3. Dimensionar a pilha imagem recortada de modo que as partidas do tamanho do pixel ou exceder as configurações usadas para a degradação no microscópio confocal (0,184 mm / pixel ao usar um 20X (NA1.0) objectiva de imersão em água com um tamanho de quadro de 2.884 por 2.884 pixelse um zoom de 0,8). Para fazer isso, clique em "Imagem" → "Ajuste" → "Size" e digite "2446" para "Largura" (ou seja, 450 mm, ou o tamanho da imagem dividida por 0,184 mm / pixel).
  4. Threshold / binarize a pilha de imagens, digitando "Ctrl + Shift + T". Desmarque a opção "Background Dark" e clique em "aplicar" → "ok". Finalizar o processo clicando em "Image" → "tabelas de pesquisa" → "Invert LUT".
  5. Utilizando um algoritmo personalizado (código de fonte está disponível no material suplementar do manuscrito referenciado) no software de programação 9, encaixar o binarizada (branco) dispõe de um mosaico de quadriláteros único pixel de alta paralela à direcção de exploração raster (X -Direção) para gerar regiões de interesse (ROI) que orientam a posição do laser e do obturador 9, 7, 30, 31, 32.
    NOTA: O algoritmo personalizado 9 converte cada plano individual na pilha de TIF para um arquivo RLS.
  6. Alterar a extensão dos arquivos RLS arquivo para .OVL para uso durante a degradação.

2. Configurando o laser de varredura confocal Microscópio

NOTA: Enquanto outros microscópios de varredura a laser equipados com lasers pulsados ​​pode ser usado, as configurações e protocolo aqui descrever o uso de um microscópio de varredura a laser (LSM) em conjunto com o seu software.

  1. Com o microscópio confocal de varredura a laser, abra o software microscópio, e clique em "Start System". Selecione o objectivo de "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75 milímetros" na guia "manter".
  2. Definir a configuração "Hidrogel Visualization"
    1. Na aba "Aquisição", assegurar que a linha de laser (514 nm laser de argônio) é selecionado e sobre no windo "Laser"W. NOTA: Este canal é usado para a imagem do hidrogel através de fluorescência eosina Y para fins de orientação 7.
    2. Na janela "Configuração de imagem", defina o "Mode" para "Modo Channel", definir "Mudar acompanhar cada" para "Frame", e selecione "Track1".
    3. Na janela "Caminho de Luz", selecione apenas o detector fluorescente Ch1, com uma gama de 516-735 nm; um divisor de feixe principal (MBS) 458/514 filtro na linha de luz visível; e uma placa na linha de luz invisível. Desmarque o detector de tubo fotomultiplicador de campo claro, "T-PMT".
    4. Na janela "Modo de Aquisição", verifique se o objetivo correto está selecionado e definir o "Modo de digitalização" para "Frame", o "Frame Size" para "2884" em X e Y, a "Linha Passo" para "1" , o "Número média" para "1", o "Modo de média" para "Line", o "Método da média" para "média", o "Bit Depth "para" 16 Bit ", eo" Direction "para" <-> "para a digitalização bidirecional.
    5. Na janela "Modo de Aquisição", defina o "Speed", como desejado e ajuste "Corr X" e "Y" para "0,05" ou ajustar conforme necessário para o microscópio específico que está sendo usado. Desmarque a opção "HDR".
    6. Na janela "Modo de Aquisição", assegurar que a "Área de Digitalização" exibe um "Tamanho da imagem" de "531,2 mm x 531,2 mm" e um "Tamanho Pixel", de "0,18", com um "Zoom" definido como "0.8" ; definir todos os outros valores "Área de Digitalização" para zero.
    7. Na janela "Channels", selecione "Track1", como o detector fluorescente Ch1. Selecione a linha de laser "514", com uma potência por cento dos "10.0", uma "Pinhole" de "1AU", uma inicial "Ganho (Master)" de "800", a "Digital Offset" de "0" e um "Ganho digital" de4; 1 ".
      NOTA: Ajuste essas configurações como necessário para o microscópio específico que está sendo usado.
    8. Salvar essa configuração como "Hidrogel Visualization".
  3. Definir a configuração "Channel Formação"
    1. Na aba "Aquisição", assegurar que a linha de laser (790 nm 140 fs pulsadas Ti: S laser) é selecionado e na na janela "Laser". Defina "GDD Correction" para "4000" para a potência máxima de 790 nm.
    2. Definir a janela "Configuração de imagem", como descrito na etapa 2.2.2.
    3. Na janela "Caminho de Luz", garantir que nenhum detectores fluorescentes são selecionados, com um 458/514/561/633 filtro MBS na linha de luz visível e um 760+ filtro na linha de luz invisível MBS. Desmarque o detector de tubo fotomultiplicador de campo claro, "T-PMT".
    4. Na janela "Modo de Aquisição", verifique se o objetivo correto está listado. Defina o "Speed" para "3"E todas as outras configurações, conforme descrito no passo 2.2.4.
    5. Na janela "Channels", selecione "Track1", como o detector T-PMT. Selecione a linha de laser "790", com uma potência por cento dos "100,0", uma inicial "Ganho (Master)" de "800", a "Digital Offset" de "0", e um "Ganho Digital" de "1" .
    6. Na janela "Stage", zere o palco, clicando em "definir zero". Marcar o local, clicando em "Mark". Isto é crítico para fazer upload de máscaras virtuais para a macro microscópio na etapa 3.
    7. Na janela "Time Series", definir "ciclos", como "1" e "Intervalo" como "0".
    8. Na janela "Bleach", marque a opção "Iniciar Branqueamento # scans depois de" caixa de e configurá-lo para um valor de "0 de 1". Seleccione a "velocidade de digitalização diferente", com um valor de "3" (o que corresponde a um tempo de pixel de permanência de 8,96 uS / pixel). Selecione a opção "bl Segurocada para GaAsP ".
    9. Na seção de linha de laser da janela "Bleach", selecione a linha de laser 790 e definir o poder por cento para "100.0". Deixe todas as outras caixas na janela de lixívia não selecionadas. Salve as configurações de branqueamento na janela "Bleach".
    10. Salvar essa configuração como "Formação Channel".
      NOTA: O "Z-Stack", "Regiões", "Focus", e as janelas "palco" também são importantes para este protocolo, mas não precisa ser definido ou ajustado durante a configuração inicial.

3. Criação de uma receita e fazer upload de Máscaras virtuais ao Software Microscópio e Macro

  1. Com o microscópio de varredura a laser confocal ainda em execução e o software microscópio ainda ligado, selecione apenas o "Regiões" janela (ao lado do botão "Iniciar Experimento") na configuração "Formação Channel".
  2. Para garantir que as máscaras de carregar a macro microscópio corretaly, definir o poder por cento no "Channels" janela para "0.2" e "Speed" no "Modo de Aquisição" janela para "8", e clique em "Snap" no canto superior esquerdo da tela.
  3. Verifique se o tamanho da imagem ainda é "531,2 mm x 531,2 mm", com um tamanho de pixel de "0,18", na aba "Informações" da imagem. Se esses valores não estiverem corretas, marque a opção "Tamanho Frame" e valores "Zoom" novamente.
  4. CRÍTICA: Verifique se os locais X e Y na janela "Stage" são zerados e que a posição é marcada antes de abrir a macro microscópio. Consulte a etapa 2.3.6.
  5. Para abrir a macro microscópio, tipo "Alt + F8", clique em "Load" e selecione a versão correta. Veja detalhes na Lista de materiais específicos / Equipamentos. Uma longa lista de sub-macros será aberto na janela "Macro de Controle".
  6. Na janela "Macro de Controle", clique em "Executar" para abrir o microscope macro, e depois fechar a janela "Macro de Controle".
    NOTA: Alternativa versões do macro microscópio pode não ser compatível com a degradação do hidrogel à base de laser, usando este protocolo.
  7. Na aba "Saving" da macro microscópio, fornecer uma arbitrária "Nome do arquivo básico", selecione "Single Output File", e escolheu uma pasta "Temporary File". Defina "pasta Temp Abrir" para localização "1", selecione "Pasta de imagem temporário Single" e nomeie a receita em "Store / Aplicar Receita" com "lista de recall Locais" selecionado. Clique em "Store" para criar inicialmente a receita.
  8. Na aba "Aquisição" da macro microscópio, garantir que a "configuração de digitalização" corresponde ao nome dado à configuração de software microscópio definiu no passo 2.3. Defina o "não do Tempo pontos dentro do bloco" para "1", com um "intervalo" de "0". Certifique-se de que "Z Marked - Top of the Z StacK "é realçado em verde. Todas as outras configurações padrão estão bem como estão.
  9. Na aba "timing" da macro microscópio, garantir que "Espere Delay" é realçado em verde, defina "Repetições Experiment" e "Grupo Repetições" para "1" e "Espere intervalo antes Bloco at First Localização Only" para "0" . Todas as outras configurações padrão estão bem como estão.
    NOTA: O "Grupo Repetições" (e não os "Repetições experiência") de caixa é onde se pode definir o número de vezes que as varreduras a laser sobre uma região (ou seja, repetições da receita).
  10. Na aba "Z List" da macro microscópio, os planos de degradação em direção z são especificados. Definir o z-spacing ", dZ", com "1 mícron", com o "Número de posições" definido para coincidir com o número de máscaras virtuais para ser usado.
  11. Clique no botão "Criar Z Pilha" para fazer a "Lista Z" aparecem na lista suspensa "List de Locais "para a parte inferior da janela. Verifique se o número de locais e z-espaçamento estão corretos e que os locais X e Y são zerados.
    NOTA: Se não estiverem, não guarde a receita; fechar a macro microscópio e repita o passo 2.3.6 antes de voltar a abrir a macro microscópio e configurar a receita novamente.
    Nota: Em vez de ter 100 máscaras espaçadas por 1? M cada, por exemplo, pode ser vantajoso ter 50 máscaras, cada empregues duas vezes e espaçadas por 1 um, para obter uma estrutura de microfluidos equivalente, como o carregamento máscaras individuais para a macro microscópio pode ser demorado.
  12. Na aba "Bleach" da macro microscópio, todas as máscaras devem ser carregados e combinados com uma localização numerada específica na "Lista de Locais". Para começar, marque a caixa "Bleach" e garantir que "Configuração". corresponde ao nome das configurações de lixívia na janela "Bleach" na tela do software microscópio principal (consulte a etapa 2.3.8). SET "Espere Delay Após Bleach" para "0", desmarque "spot", e deixar o "ROI" vazio.
  13. Não altere nada no "Local", "Azulejo", "Grid", "Foco automático", "blocos" e "Opções" abas das configurações padrão.
  14. Para carregar máscaras para a macro microscópio, selecionar apenas o "Regiões" janela no software microscópio e abra a guia "Bleach" da macro microscópio. Na janela "Regiões", clique em "Load" e selecione o arquivo .OVL para a máscara na parte inferior do z-stack sendo degradados.
    NOTA: A primeira localização na "lista Z" é a parte inferior do z-stack, eo macro microscópio trabalha o seu caminho até o topo do z-stack, ou hidrogel.
  15. Uma vez que a lista de ROIs aparece na janela "Regiões", clique no botão de seta para ver as ROIs da máscara dentro do campo de visão (na imagem estalou no passo 3.2). Verifique se as ROIs caber dentroo campo de visão.
  16. Para salvar a máscara carregada na macro microscópio, dar a máscara de um nome e número na caixa "Adicionar Região atual à lista de ROI" na aba "Bleach", e em seguida, clique no botão "Adicionar Região atual à lista de ROI". O nome eo número aparece na lista suspensa "ROI", com quaisquer outras máscaras (incluindo máscaras de outras receitas criados anteriormente). Excluir a máscara no "Regiões" janela no software microscópio.
  17. Repita os passos de 3.14 e 3.16 para carregar e salvar todas as máscaras para a macro microscópio.
  18. Para atribuir máscaras enviados para cada Z-location, destacar a posição 1 na lista suspensa "Lista de Locais". Selecione o ROI adequado a partir da lista suspensa "ROI". Certifique-se de que a caixa de "Bleach" é selecionado na parte superior da guia "Bleach" na macro microscópio.
  19. Repita o passo 3,18 para todas as posições na lista suspensa "Lista de Locais" e clique em "Store" na &# 34; Saving "guia para salvar a receita em sua forma final.

4. Photopolymerizing um PEGDA Hidrogel

  1. Tornando estéril salina tamponada com HEPES (HBS) com Triethanolamine (TEOA)
    1. Em um 1-L copo, adicione 500 ml de DI H 2 O. Com uma barra de agitação, misture 2,922 g de cloreto de sódio, 1,196 g de HEPES e 7,5 mL de TEOA em um exaustor.
    2. Ajustar a pH 8,3 com solução de hidróxido de sódio 1 N, adicionando gota a gota com uma pipeta de Pasteur.
    3. filtro estéril a solução através de um vácuo copo de filtração de 0,2 mícrons em um frasco de vidro media autoclavado 500 mL. Alíquotas e armazenar a 4 ° C.
  2. Anexar um anel de adesivo dupla face com o apoio de uma empresa especializada prato de 60 mm Petri com um buraco cortado de 20 mm para fora do fundo. Deixando o apoio no anel adesivo, pressione as bolhas de ar de entre a placa de Petri e do adesivo.
  3. Prepare os materiais. Traga a 33 sintetizado 3.4 kDa PEGDA fora da -80 ° C congelador e deixe-a atingir a temperatura ambiente. Ligar a fonte de luz branca, pelo menos, 15 min antes photopolymerizing hidrogéis.
  4. Em um exaustor, adicione 1 ml de HBS com TEOA a um, 2-mL tubo de âmbar centrífuga coberta de alumínio (usado para evitar a exposição à luz do fotoiniciador, eosina Y). Adicionar 10 ul de 1 mM de eosina Y sal dissódico em DI H 2 O.
  5. Numa hotte, extrair um pequeno volume de 1-vinil-2-pirrolidinona (NVP) para uma proveta de vidro com uma pipeta de Pasteur. A partir deste volume, pipeta 3,5 mL de NVP para dentro do tubo de centrifugação com a âmbar HBS, TEOA, e eosina Y.
  6. Numa segunda, 2 mL de tubo de centrífuga âmbar coberto de folha (utilizada para impedir a fotoactivação errante da solução de pré-polímero), adicionar 10 mg de 3.4kDa PEGDA. Adicionar 0,2 mL de HBS, TEOA, eosina Y, NVP solução de 5% w / v de solução de pré-polímero PEGDA. Vortex até que o PEGDA está totalmente dissolvido. Utilizando um medidor de energia e detector de varinha, ajustar a intensidade da li brancofonte ght a 95 mW.
  7. Construindo um poli (dimetilsiloxano) (PDMS) Mold
    1. Construir um molde PDMS 7 sobre uma superfície maior (vidro, polistireno para cultura de tecidos prato) para facilidade de manuseamento e montar os moldes de modo a que os hidrogeles moldadas caber dentro de um círculo de 20 mm de diâmetro.
    2. Para gerar um hidrogel de forma rectangular com uma espessura de 500 um, colocar dois PDMS espaçadores de 500 um de espessura para uma superfície de PDMS para criar duas arestas definidas hidrogel.
    3. Incluir um PDMS espaçador 300 mícrons para conferir um poço 300 | iM de profundidade na superfície do hidrogel, o que é útil para a introdução de fluidos.
  8. Pipetar 60 ul de 5% w / v de solução de pré-polímero para o molde PEGDA PDMS. Tenha cuidado para não introduzir quaisquer bolhas durante a pipetagem.
  9. Centro e colocar uma [3- (metacriloiloxi) propil] trimetoxisilano (TMPSA) funcionalizado 7, 40-mm de diâmetro, # 1,5 lamela de vidro na parte superior da solução. Certifique-se de que o coverslIP repousa sobre os espaçadores PDMS-500 uM. O hidrogel irá ligar-se a lamela metacrilado e impedir que o hidrogel de flutuar na solução.
  10. Coloque o PDMS, solução de pré-polímero e PEGDA lamela o conjunto sob a fonte de luz branca durante 3 min.
  11. Fluxo DI H2O entre o molde e a lamela para separar o hidrogel a partir dos PDMS. Lavar o hidrogel com DI H 2 O. Seca-se as arestas da lamela com o tecido laboratório. Tenha cuidado para não tocar ou água pavio do hidrogel.
  12. Depois de retirar a protecção do adesivo, aderir a lamela para o prato preparado Petri e retire cuidadosamente as bolhas de ar entre o adesivo eo vidro. Submergir o hidrogel na placa de Petri com DI H 2 O.
    NOTA: O molde PDMS pode ser reutilizado para fazer hidrogéis adicionais, se enxaguou com DI H 2 O, secou-se com azoto, e mantido livre de poeiras.

5. Fabricating Vascular derivado Rede microfluídicoss via Degradação à base de laser

  1. Com o microscópio confocal de varredura a laser e software microscópio, seleccione o objetivo "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75 milímetros" na guia "manter". Na aba "Aquisição", certifique-se as linhas necessárias laser (514 nm laser de argônio e 790 nm 140 fs pulsadas Ti: S laser) estão em e aquecido.
  2. Configurando o hidrogel para formar um canal de entrada
    1. Montar o hidrogel e uma placa de Petri sobre o inserto fase e colocar o inserto fase na platina do microscópio. Encha o prato de Petri com pelo menos 5 ml de DI H 2 O. Centro as características de hidrogel e assim por olho antes de abaixar o objetivo de imersão em água para o DI H 2 O.
      NOTA: Não esmagar o hidrogel com o objectivo de os dois nunca devem tocar!
    2. Para encontrar o hidrogel, alternar para a configuração "Hidrogel Visualização" a partir do passo 2.2. Clique em "Live" para ligar a linha de laser e traga thE objectivo mais perto do hidrogel até que o sinal de eosina Y (detectado pelo detector fluorescente CH1) da parte superior do hidrogel pode ser visto.
      NOTA: Para encontrar o hidrogel facilmente, a potência pode ser aumentada por cento ou o orifício pode ser aberto. Uma vez que o objectivo é focado sobre o hidrogel, no entanto, deixar cair o poder por cento, para proteger o detector fluorescente e diminuir o orifício de volta para 1AU para evitar supersaturação do detector e para localizar com precisão a superfície do hidrogel.
    3. Na janela "Etapa", marcar os locais da parte superior e inferior do hidrogel e do fundo do poço.
      NOTA: O Z-valores aqui vai ajudar na determinação da espessura do hidrogel e a profundidade do poço.
    4. Use o joystick para mover-se em X e Y para encontrar o bordo de um poço. Colocar o hidrogel à direita da tela, com o poço no lado esquerdo, ou vice-versa. Permitir que o hidrogel para preencher não mais do que dois terços do campo de visão.
    5. Largar o plane de foco para baixo de 150 mm no hidrogel, definindo o "Tamanho do Passo" para "150" na janela "Focus" e clicando na seta para baixo ao lado da caixa "Z-Position". Repita o passo 5.2.4, se necessário.
      NOTA: O X, Y, Z e a posição da entrada depende unicamente da projectar as máscaras virtuais.
    6. CRÍTICA: Zero X e Y local na janela "Stage", elimine todos os outros locais marcados, e marcar apenas neste local.
      NOTA: Se essa etapa não é executada, a macro microscópio não irá restaurar adequadamente os locais na receita salvo anteriormente, e o hidrogel não será degradada no local desejado.
  3. Formando um canal de entrada
    1. "Snap" uma imagem e desenhe uma região retangular que será a entrada para a rede vascular utilizando o botão retângulo na janela "Regiões".
      NOTA: Faça parte certeza da região se estende para fora do poço para garantir que the de entrada irá ligar o poço à rede vascular.
    2. Ao lado do ROI gerado na janela "Regiões", selecione "Aquisição" e desmarque "Bleach" e "Análise".
    3. Salve a configuração "Hidrogel Visualization", desmarque "Regiões", e mudar para a configuração "Formação Channel", criada no passo 2.3. Na configuração "Formação Channel", selecione "Regiões" novamente.
      NOTA: Ao alternar entre o "Hidrogel Visualization" e as configurações de "formação de canais", certifique-se de desmarcar regiões no canto superior esquerdo da tela. Às vezes, o dimensionamento das regiões pode mudar inesperadamente entre as configurações, se isso não for feito.
    4. Na configuração "Formação Channel", certifique-se de que apenas "Regiões" e "Z-Stack" são selecionados. Na janela "Z-Stack", clique no botão "Center" na parte superior e, em seguida, o "Centro" bundaem cima "offset" para definir o centro da pilha como Z-Z-posição actual. Dependendo do tamanho da entrada precisa ser, definir o número de "fatias" com um "intervalo" de "1". O tamanho da pilha-Z será apresentada por baixo "intervalo".
    5. Verifique se "Speed" na janela "Modo de Aquisição" é definido como "3" e que a "percentagem de energia" na janela "Channels" é definido como "100". Salve a configuração e clique no botão "Iniciar Experimento".
      NOTA: A macro microscópio não é necessária para a degradação da mesma forma simples em planos múltiplos, como aqui realizada para gerar um canal de entrada. A macro só é necessária quando se degradar diferentes regiões em cada plano individual, e é usado para armazenar as máscaras virtuais dentro de uma receita.
    6. Para visualizar o hidrogel durante a degradação, quer aumentar o "Ganho (Master)" na janela "Channels" se a região em tele campo de visão é preto, ou diminuir o "Ganho (Master)" se a região é branco.
      NOTA: a formação de bolhas aqui é uma indicação de degradação do hidrogel induzida por laser.
    7. Para degradar a entrada várias vezes, em vez de apenas uma vez, ajustar os "ciclos" na janela "Time Series".
    8. Na configuração "Hidrogel visualização", em "ao vivo" para garantir que a entrada foi formado.
  4. Configurando o Hidrogel para gerar a Rede microfluídicos
    1. Na janela "Regiões", carregar qualquer arquivo .OVL do z-stack de máscaras virtuais e clique no botão de seta para ver as ROIs no campo de visão.
    2. Clique em "Live" para viver verificar a configuração "Hidrogel Visualization" e use o joystick ou a janela "Stage" para posicionar o hidrogel em X e Y, de tal modo que a entrada se conecta para o local correto dentro da rede vascular.
      NOTA: Certifique-se aROIs da máscara Virtual sobrepõem ligeiramente com a entrada previamente formado.
    3. Largar o plano de foco para baixo 50 mm a partir do Z-localização centrada anterior, ou 200 mm a partir da superfície do hidrogel, usando o "Tamanho do Passo" na janela "Focus" e clicando na seta para baixo ao lado do "Z-Posição "caixa. Esta será a primeira posição na macro microscópio.
      NOTA: A distância real a se mover na direção z depende do projeto de rede. Assegure-se que a rede desejada não se estende para além da superfície de topo ou de fundo do hidrogel na direcção z.
    4. CRÍTICA: Zero os locais X e Y na janela "Stage", elimine todos os outros locais marcados, e marcar apenas neste local.
      NOTA: Este será o ponto de partida na macro microscópio. A receita irá trabalhar o seu caminho para trás em direcção à superfície do hidrogel.
    5. "Snap" uma imagem na configuração "Hidrogel Visualization", apagar e deselect "Regiões", e salvar a configuração.
  5. Gerando a Rede microfluídicos
    1. Alterar a configuração "Formação Channel", e só selecionar a opção "Séries Temporais" e janelas "branquear". Verifique se as configurações para o "Séries Temporais" e as janelas "branquear" são como eles foram inicialmente definido em passos 2.3.7 e 2.3.8.
    2. Defina o "Speed" na janela "Modo de Aquisição" para "8" e o poder por cento da linha de laser para "0,2" na janela "Channels". Salve a configuração.
    3. Abra a macro microscópio passo seguinte 3.5. Na guia "Saving" da macro, selecione a receita previamente feita a partir do passo 3 e clique em "Aplicar".
      NOTA: Não clique em "loja" ou a receita será substituído!
    4. Verifique as definições em todas as guias e verificar se as máscaras virtuais (arquivos .OVL) ainda são corretamente associado tele Z-locais na lista suspensa. Verifique também se o primeiro Z-location corresponde ao local marcado no "Stage" janela do software microscópio.
      NOTA: contraintuitivamente, a segunda localização na lista pendente será fisicamente acima da primeira posição, como a macro microscópio irá trabalhar o seu caminho a partir do fundo do hidrogel (mais afastada da objectiva) ao topo do hidrogel (mais próxima do objetivo).
    5. Salve a configuração "Formação Channel" novamente e clique em "Update" na macro microscópio. Clique em "Não" para "Substituir atual completa de estações?" E clique em "Iniciar" na macro microscópio para começar a receita.

6. Visualizando a rede microfluídicos

  1. Para visualizar o hidrogel e da rede microfluídicos formada após a degradação, feche a macro microscópio. Alternar para a configuração "Hidrogel Visualization" para ver a si eosina Ynal do hidrogel; a rede degradada aparece escuro.
    NOTA: A degradação hidrogel não pode ser visualizado enquanto a macro microscópio está em execução.
  2. Para visualizar a rede de microfluidos especificamente, utilizar a configuração "Hidrogel Visualização" com uma potência laser de baixa para permitir a imagiologia de fluoresceína introduzido (ITCF) marcado com dextrano, que tem um sinal mais brilhante do que o sinal de eosina Y nativo do hidrogel.
  3. Antes de introduzir dextrano marcado por fluorescência, pavio água do poço no hidrogel usando tecido de laboratório. Pipeta em 10 ul de 5 mg / ml 2000 kDa dextrano marcado com FITC em H2O DI (pré-filtrada através de um filtro de seringa de 0,2 uM).
    NOTA: Use qualquer dextrano dimensionado 2.000 kDa ou maior para evitar a difusão no gel. Se imagiologia por mais de 30 min, usar uma etapa incubadas com 60% de humidade (ou superior) para evitar a secagem do hidrogel e a evaporação de água a partir da solução de dextrano marcado com FITC.
  4. Remover o hidrogel umND placa de Petri a partir da fase e marque a placa de Petri para permitir a fácil localização da rede vascular formado durante a experimentação posterior.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para demonstrar a implementação do guiada por imagem, a degradação do hidrogel à base de laser para gerar uma rede de microfluidos 3D, vascular derivada, utilizamos uma pilha de 3D da vasculatura cerebral do rato, que foi adquirida através de microscopia de varredura de lâmina de faca (KESM) 26, 27 . Uma região 3D seleccionado do conjunto de dados maior microvascular foi convertida em uma série de máscaras virtuais para a formação da rede de microfluidos guiada por imagem, como descrito acima. Após a fabricação, a rede resultante de microfluidos foi perfundido com uma solução de FITC, 2000 kDa dextrano e fotografada através de microscopia confocal. A pilha de imagens da vasculatura in vivo que definida a arquitectura da rede (Figura 1A e C) e a rede de microfluidos fabricada (Figura 1B e D) foram usadas para gerar Z-saliências (Figura 1A e B) e de desenhos em 3D (Figura 1C e D in vivo. A técnica pode ser objecto de fabricação de redes que contêm uma vasta gama de diâmetros; dentro Figura 1, os canais que vão 3,3-28,8 um de diâmetro foram gerados. Note-se que a estrutura rectangular maior na parte superior esquerda da Figura 1B e no canto esquerdo da Figura 1D é o canal de entrada para introduzir o fluxo para a rede.

figure-results-1
Figura 1: Vascular-Derived Microfluidic rede. Uma série de máscaras virtuais, derivada a partir de uma pilha de imagens da vasculatura cerebral do rato (A e C), foram usadas para fabricate uma rede microfluídico biomimético 3D incorporado em um hidrogel PEGDA (B e D) via degradação guiada por imagem, baseada em laser. A rede de microfluidos foi perfundido com dextrano 2000 kDa marcado com FITC e visualizados por meio de microscopia confocal. Z-projeções (A e B) e desenhos em 3D (C e D) das duas redes de demonstrar a capacidade de gerar redes microfluídicos que recapitulam a densidade, organização e estrutura global da vasculatura in vivo. A seta (D) marca a entrada rectangular criado para introduzir o dextrano. A barra de escala representa 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nós implementamos dois métodos, cabeças de pressão e bombas de seringa, para iniciar fluido fbaixo nestas redes microfluídicos embutidos. Por exemplo, um canal rectangular 30 por 30 mm foi fabricado a conectar dois poços num hidrogel PEGDA micromolded (Figura 2A), com o fluxo de fluido conduzido através de uma cabeça de pressão 7. Gerado no bem da esquerda, a cabeça de pressão induzida fluxo através do microcanal e para o bem do lado direito. Na Figura 2A, uma frente inicial de tetramethylrhodamine (TRITC) marcado com, 70 kDa dextrano foi observado movimento através do canal usando microscopia de lapso de tempo. Mais tarde, na Figura 2B, uma esfera de poliestireno fluorescentes de 10 mícrons de diâmetro fluiu do poço à esquerda, através do canal, para o bem do lado direito. Com a duração de fluxo controlado pelo volume do fluido presente no poço micromolded na entrada, e a taxa de fluxo controlada pelo gradiente hidrostática gerada entre a entrada e a saída assim, o fluxo orientado a cabeça de pressão em hidrogéis micromolded fornece um método simples para o fluxo emdução, sem a necessidade de uma caixa externa ou uma bomba de seringa.

figure-results-2
Figura 2: Pressão do fluxo orientado a cabeça em um Micromolded PEGDA hidrogel. PEGDA foi micromolded para formar um hidrogel contendo duas cavidades conectadas por um microcanal incorporado. Uma cabeça de pressão foi gerado no poço para a esquerda para iniciar o fluxo de TRITC-rotulado, 70 kDa dextrano (A1-A3) e uma esfera de poliestireno de 10 uM (B1-B3) através de um 30 por 30 um canal rectangular a partir de um poço para o de outros. A barra de escala representa 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Alternativamente, para gerar fluxo de fluido constante dentro de redes microfluídicos, accionadas por bomba de seringa fbaixo pode ser iniciada por photopolymerizing do hidrogel dentro de um dispositivo de microfluidos secundário com orifícios de entrada e de saída para a interface bomba de seringa. Na Figura 3A, um dispositivo de microfluidos de pré-fabricada comercialmente disponível é mostrado com uma banda de 1 mm de hidrogel fotopolimerizado em toda a largura do dispositivo 7. degradação à base de laser foi aplicado para fabricar canais de microfluidos e redes em hidrogéis alojados utilizando o mesmo protocolo que se descreveu aqui para autoportante hidrogéis. Fluxo gerado por uma bomba de seringa pode ser visto na Figura 3B, em que um canal de diâmetro cilíndrico 20 mícrons foi fabricado num hidrogel alojado num dispositivo de microfluidos. Neste canal de 20 um de diâmetro, 2 mícrons esferas de poliestireno fluorescentes individuais são facilmente resolvida sem fluxo de fluido (Figura 3B1), ao passo que quando a / s Caudal de 5 uL é aplicada, as esferas se movem através do campo de visão, como evidenciado por estrias (Figura 3B2 </ Strong>). Esta mesma abordagem foi utilizada para induzir o fluxo através de uma rede 2D, derivada-vascular para monitorar o fluxo de TRITC-rotulado, dextrano 65 kDa através da rede e a difusão para dentro do hidrogel circundante (Figura 3C).

figure-results-3
Figura 3: Fluxo de Seringa accionadas por bomba em PEGDA hidrogéis Polymerized em caixas microfluídicos. Um dispositivo disponível comercialmente pré-fabricada de microfluidos (A) com um microcanal 17 x 3,8 x 0,53 milímetros (x, y, z) aloja um fotopolimerizável 1 x 3,8 x 0,53 milímetros (x, y, z) PEGDA hidrogel, indicado pela flecha Negra. Um canal cilíndrico de diâmetro de 20 um foi degradada através do hidrogel, e esferas de poliestireno de 2 ^ m foram bombeados através do dispositivo (B). As esferas são claramente resolvidos sem fluxo de fluido (B1), mas eles aparecem como estrias a um caudal de 5 ul / s(B2). Noutra hidrogel alojado, uma rede vascular 2D-derivado foi fabricado e TRITC-rotulado, dextrano 65 kDa foi bombeado através da rede (C). microscopia de lapso de tempo foi utilizado para monitorizar o dextrano fluorescente, uma vez que os canais cheios e se difunde para o hidrogel circundantes. Setas brancas em (B) e (C) indicam a direcção do fluxo de fluido. A barra de calibração em (C) indica a intensidade do dextrano fluorescente. As barras de escala representam 20 jiM em (B1) e (B2) e 50 uM de (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Crítica em substituir as funções padrão do software microscópio para permitir o uso de máscaras virtuais para a degradação guiada por imagem, baseada em laser, a macro microscópio deve ser configurado e manipulada com cuidado. Como as interfaces de software microscópio com a macro microscópio pode às vezes ser contra-intuitivo, e muito esforço foi investido em determinar os melhores ajustes em ambos os programas para desenvolver este método. A compreensão geral de laser de digitalização básica uso de microscópio confocal é recomendado, especialmente com o "Stage" e janelas "Focus" para encontrar e corretamente posicionando o hidrogel nos x, y, e z dimensões, antes de tentar a degradação à base de laser. Além disso, a fabricação de um canal de entrada é crítica para o protocolo; espécies fluorescentes suspenso deve ser capaz de entrar nos sistemas de microfluido para a imagiologia bem sucedida e caracterização de rede. É importante notar que este protocolo se aplica a uma específica Laser-digitalização microscópio confocal configurado com um laser pulsado femtosecond específico, executando versões específicas do software microscópio e a macro microscópio (ver detalhes na Lista de materiais específicos / Equipamentos). Nós descobrimos que as versões mais recentes do macro microscópio falta de controle e funcionalidade necessária necessária para controle do laser guiada por imagem. Enquanto outras plataformas de microscópio e fontes de laser pulsado pode ser usado, este protocolo aplica-se especificamente a este sistema e terá a modificação de acordo com a plataforma, fonte de laser e software implementado. Os princípios subjacentes a todo este protocolo ainda se aplicam, no entanto.

Uma modificação potencial para este protocolo envolve a alteração da composição de hidrogel. Aqui, utilizou-se 5% em peso, 3,4 hidrogéis PEGDA kDa, mas a degradação à base de laser (para fins de geração de lado da rede de microfluidos) foi implementada para degradar ambos os hidrogeles sintéticos e naturais, incluindo fibrina PEGuiladoog�io 21,22, proteína de seda hidrogéis 23, e colágeno 24. Ajuste da potência do laser, velocidade de digitalização, espaçamento entre Z-fatias, eo número de repetições ajudarão a determinar os parâmetros ótimos para fabricar redes microfluídicos em outras formulações de hidrogel.

Uma limitação de corrente da técnica é o volume total do hidrogel que pode ser degradado em uma quantidade de tempo possível. Para criar vazios abertos ou recursos microfluídicos dentro do hidrogel, o laser tempo de permanência deve ser igual ou superior a 8,96 uS / pixel (ou uma velocidade de digitalização de laser de 0,021 mm / ms) ao usar uma fluência do laser de 37,7 nJ / mm 2. Com estas definições, leva-se 1,4 h a degradar vasos dentro de um volume de 0,014 milímetros 3 (como visto na Figura 1). Usando um tempo de permanência de laser de 4,48 mS / pixel ou abaixo, a energia entregue não é suficiente para a completa degradação da formulação de hidrogel aqui utilizado. A implementação de um hidrogel diferentecomposição poderia superar essa limitação. O uso de géis fotolabilidade que contêm componentes sensíveis à luz 34-36 ou hidrogéis que têm grande multifotônica secções transversais 21-24 são boas opções que permitam a utilização de menos energia e resultaria em degradação mais rápida. No que diz respeito às limitações dimensionais, características têm sido fabricados até 1,5 mm de profundidade no hidrogel 7. O realizáveis profundidade é uma função da distância de trabalho do objectivo e pode ser aumentada usando objetivos distância de trabalho ultra-longos otimizados para imagiologia in vivo. O canal de medida menor 7 criado usando um 20X (NA1.0) objectiva de imersão em água tinha uma largura de 3,3 mm e profundidade de 8,9 mm, o que está a par com o tamanho das menores canais gerados na Figura 1. Enquanto outros laboratórios têm usado objetivos NA inferiores 21,23,24, prevemos que as redes microfluídicos com pequenos recursos podem ser gerados usando altaobjetivos er NA à custa de uma distância de trabalho reduzida. Em última análise, no entanto, a resolução da técnica é uma função da função de dispersão do feixe de laser focado, as propriedades de rastreio por laser, a quantidade de energia fornecida pelo laser, e as propriedades de absorção de laser do material a ser degradada.

Além disso, as propriedades de laser (velocidade, fluência, espaçamento entre máscaras virtuais e número de repetições) deve ser otimizado com base nas propriedades de hidrogel (densidade de ligações cruzadas, macrómero / peso molecular de monómeros, por cento em peso e tipo de hidrogel: à base de proteína sintética vs. ), uma vez que estes serão inerentemente alterar as interacções com o laser e, assim, a resolução final do processo. À medida que a energia fornecida é também influenciada pelo objectivo utilizado, a optimização adicional é necessário quando se alterna entre objectivos. No que diz respeito aos custos envolvidos, o acesso a um microscópio com um laser pulsado é necessário, e enquanto muitos objec diferentetivos podem ser utilizados, aqueles com uma elevada NA e longa distância de trabalho (por imagiologia in vivo) pode ser caro.

Para além do protocolo detalhado aqui, redes de microfluidos geradas utilizando esta técnica também pode ser funcionalizada com péptidos de células-adesivo pós-fabricação de canal para induzir a adesão de células endoteliais e formação de lúmen 7. Além disso, a incorporação de sequências de péptidos de células-degradável no material a granel 9 antes para canalizar degradação poderia permitir o estudo de migração celular para dentro e através do hidrogel. Para fluidização contínua da rede de microfluidos dentro do hidrogel, os hidrogéis são polimerizáveis em dispositivos fluídicos ou caixas maiores, como demonstrado nas Figuras 2 e 3 7.

A geração de redes vasculares via vasculogenic ou angiogênico auto-montagem 8-12 fornece uma abordagem simples para induzir vascularization ao longo de um volume relativamente grande de hidrogel. Embora esta abordagem resulta em redes fluídicos perfusable, é difícil de controlar diretamente o tamanho, tortuosidade, densidade e arquitetura de rede geral. Devido a esta limitação, o perfil de escoamento e as taxas de cisalhamento na vasculatura pode ser diferente entre as experiências. Alternativamente, técnicas de microfabricação 13-16 permitir controle direto sobre arquitetura de rede, mas são muitas vezes limitadas pela sua incapacidade para gerar canais pequenos, do tamanho de capilares ou a fabricação de redes densas que imitam na arquitetura vivo vascular. Embora a técnica degradação hidrogel à base de laser descrito aqui foi recentemente reaproveitado para a geração de microfluidos, simultaneamente supera tanto o controle arquitetônico e limitações à base de tamanho dos métodos de microfabricação existentes, permitindo a criação de 3D redes microfluídicos biomiméticos que recapitulam a densidade, tortuosidade, faixa de tamanho, e architectur gerale da vascularização in vivo. Além disso, várias redes de fluidos pode ser gerado num hidrogel, permitindo o estudo do transporte inter-rede 7. Para aplicações de engenharia de tecidos que se esforçam para replicar de forma mais estreita em processos de transporte in vivo, in vitro, as redes microfluídicos incorporado-hidrogel altamente resolvidas aqui descritos são adequados. Prevemos que este protocolo será útil no desenvolvimento de construções de tecido que o transporte de forma mais precisa imitar in vivo para uso como dispositivos de detecção de drogas e em modelos de doenças in vitro.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem ao Dr. Jeff Caplan e ao Sr. Michael Moore, do Centro de Bioimagem do Instituto de Biotecnologia de Delaware, por seu apoio à microscopia confocal. O acesso ao equipamento de microscopia foi apoiado pelos subsídios de instrumentação compartilhada do National Institutes of Health (NIH) (S10 RR0272773 e S10 OD016361) e pelo Programa Federal de Subsídios para Pesquisa e Desenvolvimento do Estado de Delaware (16A00471). Esta pesquisa foi apoiada por doações do Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH (P20GM103446), da American Cancer Society (14-251-07-IRG), da Fundação de Pesquisa da Universidade de Delaware (14A00778), do Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas (CPRIT) (RR140013) e da Biblioteca Nacional de Medicina do NIH (4 R00 LM011390-02).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MATLABMathworksR2015adenominado "software de programação" no protocolo; consulte a fonte 9 para obter detalhes sobre o algoritmo
FIJI (Fiji é Just Image J)NIHversão 1.51adenominado "software de processamento de imagem" no protocolo
LSM 780 Microscópio ConfocalZeissdenominado "microscópio confocal de varredura a laser" no protocolo; para hidrogel à base de laser degradação
Zen 2010B SP1Zeissversão 6.0denominada "software de microscópio" no protocolo; para uso na Zeiss LSM-780
Multitime, 2010Zeissv16.0denominada "macro de microscópio" no protocolo; para uso na Zeiss LSM-780 (em conjunto com Zen)
Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mmZeiss421452-9880-000para uso na Zeiss LSM-780
Chameleon Vision II Modelocked Ti:SLaser Coerentedenominado "laser pulsado de alta potência" no protocolo
Cloreto de sódioSigma-AldrichS5886-1KG
HEPESSigma-AldrichH3375-250G
Trietanolamina (TEOA)Sigma-Aldrich90279-100MLinflamável; irritante para a pele e os olhos; trabalhe com em um exaustor
Sódio Copos deSigma-AldrichS5881-500G
150 mL com 0.2 µ m Membrana PESVWR10040-460
PEGDAsintetizada internamenteconsulte a fonte 33 para métodos de síntese; armazenar sob argônio
Eosina Y sal dissódicoSigma-AldrichE6003-25G
1-vinil-2-pirrolidinona (NVP)Sigma-AldrichV3409-5Garmazenar sob argônio; cancerígeno; trabalhar com em um exaustor
Fita Dupla Face 3M, 9500PC, 6.0 milThomas Goldkamp37728
Flexmark 90 PFW LinerFLEXconFLX000620suporte para manuseio de fita dupla face
Modelo SC Plotter (cortador de adesivo)USCutterSC631Eusado para cortar adesivo em formas de anel para conectar lamínulas a placas
Petri 60 mm com furo de 20 mmMatTek CorporationP60-20-F-NON
Iluminador de Alta Intensidade (fonte de luz branca)Medidor de energia Fiber-Lite4715MS-12WB10
Newport1916-Rdetecta potência a 524 nm ao usar fonte de luz branca
Detector de varinha de perfil finoNewport918D-STpara uso com medidor de energia
Kit de elastômero de silicone Sylgard 184Dow Corning3097358-1004usado para fazer moldes PDMS; consulte a fonte 7 para métodos
TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Roundsintetizado internamenteconsulte a fonte 7 para métodos
Dextran, Fluoresceína, 2.000.000 MW, Aniônico, Lisina FixávelLife TechnologiesD7137pode usar dextrans marcado alternativo; 2.000 kDa não se difunde facilmente em uma seringa de 5% de 3,4 kDa PEGDA hidrogel
de 1 mL, Luer-LokBD309628
Filtro de Anel Acrodisc, 0.2 µ m Supor Membrana, Nuvem de Baixa Ligação a ProteínasPN 4602
sticky-Slide VI0.4  Ibidi80601dispositivos microfluídicos que podem ser usados para abrigar hidrogéis
Filtração a Vácuo de Hidróxido de

Referências

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