Um sistema microfluídico com padrões de superfície para investigar bolha de cavitação (s) Interação -cell e os Efeitos Biológicos resultante no nível de célula única

Fenfang Li; Fang Yuan; Georgy Sankin; Chen Yang; Pei Zhong

doi:10.3791/55106

Method Article

Um sistema microfluídico com padrões de superfície para investigar bolha de cavitação (s) Interação -cell e os Efeitos Biológicos resultante no nível de célula única

DOI:

10.3791/55106

⸱

January 10th, 2017

Fenfang Li¹ , Fang Yuan² , Georgy Sankin¹ , Chen Yang¹ , Pei Zhong¹

¹Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University, ²Huacells Corp

Summary

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Um chip microfluídico foi fabricado para produzir pares de pontos dourados para geração de bolhas em tandem e ilhas revestidas de fibronectina para padronização de célula única nas proximidades. O campo de fluxo resultante foi caracterizado por velocimetria de imagem de partículas e foi empregado para estudar vários bioefeitos, incluindo poração da membrana celular, deformação da membrana e resposta de cálcio intracelular.

Abstract

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Neste artigo, vamos primeiro descrever o protocolo de fabricação de um chip microfluídico, com pontos de ouro e regiões revestidas com fibronectina no mesmo substrato de vidro, que controla com precisão a geração de bolhas em tandem e células individuais estampados nas proximidades, com locais e formas bem definidas. Nós, então, demonstrar a geração de bolhas em tandem usando dois lasers pulsados iluminando um par de pontos do ouro com um atraso de poucos microssegundos. Nós visualizar a interação bolha-bolha e formação de jato de imagem de alta velocidade e caracterizar o campo de fluxo resultante utilizando velocimetria de imagem de partículas (PIV). Por fim, apresentamos algumas aplicações desta técnica para a análise de uma única célula, incluindo a formação de poros da membrana celular com a captação de macromolécula, deformação da membrana localizada determinada pelos deslocamentos de contas de ligação de integrina conectados e resposta de cálcio intracelular da imagem raciométrica. Nossos resultados mostram que um fluxo de jacto rápido e direcional é proproduzida pela interacção de bolha em tandem, o qual pode impor uma tensão de corte altamente localizada na superfície de uma célula cultivada em estreita proximidade. Além disso, diferentes efeitos biológicos podem ser induzida através da alteração da força do fluxo de jacto, ajustando a distância de afastamento a partir da célula para as bolhas em tandem.

Introduction

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Há um reconhecimento crescente de que a heterogeneidade celular, resultante da expressão estocástica de genes, proteínas e metabolitos, existe dentro de uma população de células grandes e serve como um princípio fundamental na biologia para permitir a adaptação de células e ^uma evolução. Portanto, é muitas vezes imprecisas e pouco confiáveis para se utilizar medidas a granel de base populacional para entender a função das células individuais e suas interações. O desenvolvimento de novas tecnologias para a análise de uma única célula é, portanto, de grande interesse na investigação farmacológica e biológica, e pode ser usado, por exemplo, para melhor comp....

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Protocol

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1. Microfabricação

Nota: Todos os procedimentos de microfabricação são realizadas em uma sala limpa. Uma máscara de cromo é concebido antes da microfabricação, ver Figura 2.

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Figura 2: Representação esquemática da criação de canais no chip de microfluidos e as dimensões das unidades de trabalho. a) Projeto da máscara dos microcanais alinhados PDMS (verde) e os padrões sobre o substrato de vidro (azul e vermelho). b) imagem amplia....

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Results

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A plataforma de microfluidos descrito neste trabalho pode ser utilizada para investigar interacções bolha de bolhas e analisar uma variedade de efeitos biológicos induzida por cavitação ao nível de uma única célula. Aqui, nós apresentamos vários exemplos para demonstrar uma variedade de estudos experimentais e bioensaios que podem ser realizados no nosso sistema experimental. Vamos primeiro ilustrar as interações transientes de bolhas em tandem com a formação jato, a visualização do camp.......

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Discussion

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Análise de uma única célula, em combinação com imagens ao vivo de células, melhorou substancialmente a nossa compreensão dos processos dinâmicos e muitas vezes variáveis em células individuais, como o desenvolvimento fenótipo ea resposta imune ^23. Em contraste com a cultura de células em pratos convencional ou frascos, sistemas de microfluidos permita o controle preciso do microambiente, para baixo para o nível de uma única célula, em tempo real. Consequentemente, os avanços na tecnologia de microfluidos e té.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

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Gostaríamos de reconhecer o uso da instalação de sala limpa SMIF na Duke University. Também queremos agradecer a Hao Qiang por sua ajuda na medição da velocidade do jato. Os autores agradecem a Todd Rumbaugh, da Hadland Imaging, por fornecer a câmera Shimadzu HPV-X usada neste estudo. O trabalho foi financiado em parte pelo NIH por meio de doações 5R03EB017886-02 e 4R37DK052985-20.

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Materiais
75 mm x 38 mm Lâminas de microscópio simples	Corning	2947-75X38
Acetona	Sigma Aldrich, Co.	320110	Reagente ACS, ≥ 99,5%
Álcool isopropílico	Sigma Aldrich, Co.	W292907	≥ 99,7%, FCC, FG
Ácido sulfúrico	Sigma Aldrich, Co.	320501	reagente ACS, 95,0-98,0%
de peróxido de hidrogênio	Sigma Aldrich, Co.	216763	30% em peso em H₂O
Primer P-20	Microchem	MCC Primer 80/20
NFR fotorresistente	JSR	NFR016D2
Fotomáscara	Photoplotstore	N/A	4x4 Máscara de gravação direta
MF-319 Revelador	Shipley (Rohm and Haas)	Microposit MF-319
1165 Removedor de fotorresistência	Dow Chemical, Co.	DEM-10018073	1-metil-2-pirrolidinona à base
fotorresistente S1813	Shipley (Rohm e Haas)	S1813
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
filme de parafina	HACH	251764
SU-2025 fotorresistente	Microchem	SU-2025
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0,5KG
Tubulação Microbore	Saint-Gobain PPL Corp.	S-54-HL
Pinos de metal	New England Small Tube	NE-1300-01	Cut Tube (reto), 0,025" OD x 0,017 " ID x 0,50 " Células HeLa longas
	Duke Cell Culture Facility	(307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS (1x) tampão	ThermoFisher Scientific	14190144
Meio de cultura DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065
Fibronectina Proteína Bovina, Plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
0,25% Tripsina-EDTA (1x)	ThermoFisher Scientific	25200056
Iodeto de Propídio	ThermoFisher Scientific	P21493
Microesferas de Carboxilato 1.00 μ m	Polysciences, Inc	08226-15
Microesferas de Carboxilato 2.00 μ m	Polysciences, Inc	18327-10
EDC (cloridrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida)	ThermoFisher Scientific	22980
Sulfo-NHS	Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)	24510
Peptite-2000	Advanced BioMatrix	5020-5MG
FITC Anexina V	ThermoFisher Scientific	A13199
Fura-2, AM	ThermoFisher Scientific	F1221
DMSO	Sigma Aldrich, Co.	D2650
F-127	invitrogen	P6866	0.2 µ m filtrado (Solução a 10% em Água)
Meio de soro reduzido	ThermoFisher Scientific	11058021
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento
Plasma asher	Emitech	K-1050X	O₂ / Ar plasma cinzas de fotorresistente e outros materiais orgânicos
Alinhador de máscara	SUSS MicroTec	MA6/BA6
	Suss CHA Industries	CHA Industries Solution E-Beam
RIE	Trion Technology	Trion Technology Phantom II	(óxido / nitreto / polímero)
estereoscópio	AmScope	American Scope SM-4TZ-FRL	Microscópio estéreo
Bomba de seringa	Chemyx Inc	NanoJet
Incubadora de cultura de células	NuAire	AutoFlow NU-8500 Jaqueta de água CO_{2 < / sub>Incubadora}
Cabines de segurança biológica	NuAire	NU-425-400
Banho-maria	VWR	1122s
Centrífuga	IEC	Centra CL2
Microscópio	Zeiss	Axio Observer Z1
Nd:YAG laser (laser 1)	New Wave Research	Tempest
Nd:YAG laser (laser 2)	Orion		da New Wave Research
	Berkeley Nucleonics	Lâmpada de flash BNC 565-8c
	de tubo de flash acoplada a fibra Dyna-Lite ML1000
		Câmera de alta velocidade Imacon 200
	Shimadzu	HPV-X
	Vision Research	Phantom V7.3
LaVision		DaVis 7.2
	Zeiss	AxioCam MRc 5
Sistema	Zeiss	AxioVision
PTI	Horiba	S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio software	Horiba	Easy Ratio Pro 2	versão 2.3.125.86
63&vezes; objetiva	Zeiss	LD Plan Neofluar

de Evaporador E-beam KarlGerador de atraso Câmera de alta velocidade DRS Hadland Câmera de alta velocidade Software PIV Câmera Software

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
Gossett,....

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