Um sistema microfluídico com padrões de superfície para investigar bolha de cavitação (s) Interação -cell e os Efeitos Biológicos resultante no nível de célula única

Summary

Um chip microfluídico foi fabricado para produzir pares de pontos dourados para geração de bolhas em tandem e ilhas revestidas de fibronectina para padronização de célula única nas proximidades. O campo de fluxo resultante foi caracterizado por velocimetria de imagem de partículas e foi empregado para estudar vários bioefeitos, incluindo poração da membrana celular, deformação da membrana e resposta de cálcio intracelular.

Abstract

Neste artigo, vamos primeiro descrever o protocolo de fabricação de um chip microfluídico, com pontos de ouro e regiões revestidas com fibronectina no mesmo substrato de vidro, que controla com precisão a geração de bolhas em tandem e células individuais estampados nas proximidades, com locais e formas bem definidas. Nós, então, demonstrar a geração de bolhas em tandem usando dois lasers pulsados ​​iluminando um par de pontos do ouro com um atraso de poucos microssegundos. Nós visualizar a interação bolha-bolha e formação de jato de imagem de alta velocidade e caracterizar o campo de fluxo resultante utilizando velocimetria de imagem de partículas (PIV). Por fim, apresentamos algumas aplicações desta técnica para a análise de uma única célula, incluindo a formação de poros da membrana celular com a captação de macromolécula, deformação da membrana localizada determinada pelos deslocamentos de contas de ligação de integrina conectados e resposta de cálcio intracelular da imagem raciométrica. Nossos resultados mostram que um fluxo de jacto rápido e direcional é proproduzida pela interacção de bolha em tandem, o qual pode impor uma tensão de corte altamente localizada na superfície de uma célula cultivada em estreita proximidade. Além disso, diferentes efeitos biológicos podem ser induzida através da alteração da força do fluxo de jacto, ajustando a distância de afastamento a partir da célula para as bolhas em tandem.

Introduction

Há um reconhecimento crescente de que a heterogeneidade celular, resultante da expressão estocástica de genes, proteínas e metabolitos, existe dentro de uma população de células grandes e serve como um princípio fundamental na biologia para permitir a adaptação de células e ^uma evolução. Portanto, é muitas vezes imprecisas e pouco confiáveis ​​para se utilizar medidas a granel de base populacional para entender a função das células individuais e suas interações. O desenvolvimento de novas tecnologias para a análise de uma única célula é, portanto, de grande interesse na investigação farmacológica e biológica, e pode ser usado, por exemplo, para melhor compreender as principais vias de sinalização e processos em biologia das células estaminais e terapia do cancro ^2-4. Em anos recentes, o surgimento de plataformas de microfluidos tem grandemente facilitado a análise de uma única célula, em que o posicionamento, o tratamento, e da observação da resposta a partir de células individuais foram realizados com novas estratégias analíticas ^5.

Cavitação desempenha um papel importante numa grande variedade de aplicações biomédicas, incluindo o tratamento de cancros com correntes de alta intensidade ultra-som focalizado (HIFU) ^6, a fragmentação não-invasivo de pedras nos rins por litotripsia de onda de choque (SWL) ^7, a entrega de drogas ou gene por sonoporação ^8, e a destruição recentemente relatado de células ou tecidos por hidrodinâmico ^9,10 bolha de cavitação. Apesar disso, os processos dinâmicos de bolha (s) cavitação interacções com o tecido biológico e as células não foram bem compreendidas. Isto é devido a aleatoriedade na cavitação de iniciação e de bolhas produzidas pela dinâmica do ultra-som, as ondas de choque, e a pressão hidráulica local; Além disso, há uma falta de permitir técnicas para resolver as respostas inerentemente complexa e rápida de células biológicas, especialmente ao nível de uma única célula.

Devido a estes desafios, não é surpreendente que muito poucos estudos têm a abelhan relatado para investigar interacções célula-bolha, em condições experimentais bem controladas. Por exemplo, a formação de poros de membrana de células individuais em suspensão presas ¹¹ e a grande deformação impulsivo de células vermelhas do sangue humano ¹² foram demonstradas utilizando bolhas individuais gerado por laser em canais de microfluidos. A última técnica, no entanto, só pode produzir muito pequena deformação em células eucarióticas por causa da presença do núcleo ^13. Além disso, é difícil monitorizar os efeitos biológicos a jusante quando o tratamento de células em suspensão. Em outros estudos, o ultra-som de excitação de uma microbolha ligada à célula (ou agente de contraste de ultra-sons) para a produção de formação de poros da membrana e / ou respostas de cálcio intracelular em células aderentes individuais foi avaliado ^8. Membrana de formação de poros de células aderentes individuais também pode ser produzido utilizando bolhas em tandem gerado por laser com uma camada líquida fina contendo solução azul de Tripano de absorção de luz ^14, oupor uma bolha de gás oscilante gerado por pulsos de laser microssegundo irradiando através de um substrato opticamente absorvente em microchambers ^15. Quando comparados, o substrato opticamente absorvente tem uma vantagem sobre a solução de azul de tripano de absorção de laser, porque este último é tóxico para as células. Mais importante, bolhas gerado pelo laser são mais controlável em termos de tamanho da bolha e localização de bolhas acusticamente excitado. No entanto, em todos estes estudos anteriores, a forma celular, orientação e condições de adesão não foram controlados, o que pode influenciar substancialmente a resposta celular e bioeffects produzidos por tensões mecânicas ^16.

Para ultrapassar estas desvantagens em estudos anteriores, nós desenvolvemos recentemente um sistema experimental para a geração de bolhas, padronização de células, as interacções célula-bolha de espuma, e em tempo real bioensaios de resposta de células em um chip de microfluidos construído usando uma combinação única de Techn microfabricaçãoiques. Três características principais que distinguem o nosso sistema experimental de outros no campo são: 1) o padrão de pontos do ouro tamanho mícron-no substrato de vidro para permitir a absorção do laser localizada para geração de bolhas ^17; 2) o padrão de ilhas micronizadas de matriz extracelular (ECM) para a adesão de células no mesmo substrato para controlar tanto a localização e a geometria das células individuais; e 3) a compressão da dimensão do domínio de interacção de células de espuma de bolha de 3D para um espaço quase-2D para facilitar a visualização no plano de interacções bolha-bolha, jacto de campos de fluxo, deformação celular e efeitos biológicos, capturados em uma sequência de imagens aerodinâmico (Figura 1D).

Figura 1: O chip microfluídico e esquemas de ensaios diferentes. a) Um chip microfluídico montado com canais preenchidos com tinta azul para visualização. b) Uma região dentro do chip de microfluidos com células padronizadas e de pontos de ouro (a distância entre os dois pontos de ouro na proximidade é de 40 uM). Muitos pares de unidades de trabalho podem ser dispostas num canal. c) A imagem do Close-up de uma única unidade de trabalho constituído por um par de pontos do ouro e uma de células HeLa adere a região da célula-padronização. d) Esquema de funcionamento do dispositivo. Uma única célula adere a e se espalha sobre o "H" em forma de ilha revestido com fibronectina. Um par de bolhas de cavitação (bolha) em tandem com oscilação anti-fase são produzidos por iluminante raios laser pulsados sobre os pontos de ouro (ver Figura 4a), que conduz à geração de um jacto rápido e localizada avançar para a célula alvo próximo. A célula pode ser deformado, rado para a absorção de macromoléculas, e / ou estimulado com uma resposta de cálcio, dependendo da distância de afastamento (S _d) da célula para a bolha em tandem.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Esta plataforma pode ser ainda combinada com os ensaios de fluorescência e esferas funcionalizadas ligados à superfície da célula para os efeitos biológicos induzida por cavitação. Em particular, esta plataforma abre o caminho para ensaios de confiabilidade e quantificáveis ​​ao nível de uma única célula. Até agora, foi utilizado o dispositivo para a análise de deformação induzida por bolha em tandem da membrana celular, a formação de poros e absorção intracelular de células, viabilidade, apoptose e resposta de cálcio intracelular. No protocolo seguinte, descreve-se o processo de fabricação de chips e o procedimento para analisar os diversos efeitos biológicos mencionados acima. Além disso, também estão descritas as operações do chip.

Protocol

1. Microfabricação

Nota: Todos os procedimentos de microfabricação são realizadas em uma sala limpa. Uma máscara de cromo é concebido antes da microfabricação, ver Figura 2.

Figura 2: Representação esquemática da criação de canais no chip de microfluidos e as dimensões das unidades de trabalho. a) Projeto da máscara dos microcanais alinhados PDMS (verde) e os padrões sobre o substrato de vidro (azul e vermelho). b) imagem ampliada do projeto da máscara em uma seção representativa das matrizes de unidade de trabalho. c) Representação esquemática de uma unidade de trabalho que mostra um padrão de células (azul) e um par de pontos do ouro (vermelho). Todas as escalas de comprimento são mostradas na parte inferior direita. Por favor clique aqui para ver um larversão ger desta figura.

1. Padronização do ponto de ouro
   NOTA: A área de cada ponto de ouro é concebido para estar dentro de 25-30? M ^2, de modo que seja suficientemente grande para absorver a energia laser para a geração de bolhas, mas suficientemente pequena para evitar a células individuais que aderem a ele. Um diagrama esquemático para a fabricação de pontos de ouro é mostrado na Figura 3a.
   1. Lâmina de vidro de limpeza (em uma capa química)
      1. Lave a lâmina de vidro com acetona seguido de álcool isopropílico (IPA), e, em seguida, seque-o com _um fluxo de _N2.
      2. Embeber o slide em solução piranha (H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ = 4: 1) durante 10 min.
      3. Retire o slide, lave-o com água DI, em seguida, seque-o com _um fluxo de _N2.
      4. Cozer a lâmina de vidro numa placa de aquecimento a 120 ° C durante 10 min.
      5. Tratar o slide em uma Asher plasma a 100 W durante 90 s.
   2. Spin coating (hood spin-coating)
      1. Ligue a placa e esperar até que a temperatura é estável a 95 ° C.
      2. Siga o procedimento de revestimento:
         1000 rpm durante 5 s com um / s rampa 500 rpm;
         em seguida, 3.000 rpm durante 30 s com um / s rampa de 1.000 rpm.
      3. Fixar a lâmina de vidro limpa para o revestidor por rotação aplicação de um vácuo.
      4. Cobrir a superfície da lâmina com a P-20 e começar a receita de revestimento.
      5. Repetir o processo de revestimento para fotorresistente NFR-negativo.
      6. Asse o slide a 95 ° C durante 60 s e espere até que arrefeça à temperatura ambiente.
   3. Fotolitografia
      1. Monte a máscara de cromo para o alinhador de máscara e se certificar de que lado o padrão está voltada para baixo em direção ao slide.
      2. Definir a receita fotolitografia para o modo de exposição duro com 9 s de exposição aos raios UV e rapidamente alinhar o substrato de vidro com a máscara.
      3. Após a realização da exposição aos raios UV, cozer o slide a 956; C durante 1 min, e depois deixe esfriar à temperatura ambiente.
   4. Desenvolvimento
      1. Desenvolver o padrão no slide na solução reveladora por 60 s.
      2. Remova a lâmina do desenvolvedor, lave-o com água DI, e seque com _um fluxo de _N2.
      3. Verifique a geometria do padrão sob um microscópio e medir e registrar a dimensão do traço.
   5. Deposição do ouro (evaporação E-beam) e levante-off
      1. Asse o slide a 120 ° C por 5 min, e deixe esfriar à temperatura ambiente.
      2. Limpar a lâmina com plasma na máquina gravação iónica reactiva (RIE) durante 90 s a 500 Torr e 100 W.
      3. Depósito de 5 nm de Ti e 15 nm de Au sobre a lâmina utilizando um evaporador E-feixe ^17.
      4. Embeber a corrediça durante a noite em um copo de vidro contendo removedor fotorresistente solvente para remover o ouro repouso no topo da NFR resistir.
      5. Recuperar o slide, i rentet com acetona seguido de IPA, e secá-lo com _um fluxo de _N2.
      6. Seque o slide em uma placa quente a 115 ° C antes de limpá-lo na Asher plasma de oxigênio a 100 W durante 90 s.
2. Modelação molecular-montagem por lift-off (MAPL)
   Nota: A área de cada uma das ilhas revestidas com fibronectina é ajustado para estar dentro de 700-900 ^ M ^{de 2} a facilitar a propagação de células HeLa adequado numa região quadrado, enquanto minimiza as possibilidades de várias células de agregação na ilha. Um diagrama esquemático para a preparação de ilhas de células-padronização é mostrado na Figura 3b.
   1. Spin coating
      1. Repetir o passo 1.1.2, mas usar fotorresistente S1813-positiva e uma temperatura de 115 ° C.
   2. fotolitografia alinhados
      1. Monte a máscara de cromo para o alinhador de máscara e certificar-se de que o lado com o padrão está voltada para baixo para o slide com opontos do ouro.
      2. Definir a receita fotolitografia para o modo de exposição duro com 9 s de exposição aos raios UV.
      3. Alinhar a máscara de topo com a lâmina inferior, utilizando marcas de alinhamento, localizada em torno da borda da máscara, como uma referência espacial.
      4. Verifique a porção central da máscara e verificar que as características do padrão são alinhadas correctamente.
      5. Complete a exposição aos raios UV, sem um post-bake.
   3. Desenvolvimento
      1. Repita o passo 1.1.3, mas com 45 s de desenvolvimento antes de secar sobre uma placa quente e preservar no armazenamento _N2.
3. O tratamento químico
   1. Preparar a solução de passivação: 0,5 mg / mL de PLL-G-PEG em tampão HEPES 10 mM.
   2. Recuperar o slide do armazenamento N ₂ e limpá-lo usando RIE com a definição de parâmetro: 500 Torr de pressão, potência de 100 W e 90 s de duração.
   3. Pipeta uma gota de passivating solução sobre um pedaço de filme de parafina <./ Li>
   4. Sanduíche da solução com o filme eo slide, certificando-se de que o lado com o padrão de recursos é voltado para baixo para o filme; evitar a formação de bolhas.
   5. Espere por 45 minutos antes de remover a lâmina do filme.
   6. Embeber o slide consecutivamente no removedor de fotorresistente, removedor de fotorresistente e água desionizada (1: 1), e água desionizada, e agitá-lo num banho de ultra-sons durante 90 s para cada imersão.
   7. Seque o slide sobre uma placa quente para remover a umidade antes de selar-lo num exsicador e armazená-lo no frigorífico.
4. montagem Chip
   1. Repita os passos 1.1.1-1.1.4, mas com fotorresiste SU8-2025-negativo e a definição do parâmetro refere chamado de protocolo Microchem ^18, para preparar um molde de silicone com uma fotomáscara.
   2. Fabricar um microcanal PDMS (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x W x H) e uma pequena laje de PDMS (800 estrutura ranhura mm de largura), utilizando litografia macia.
   3. Perfurar o microchannel para portas de acesso de fluidos e limpe-o com fita adesiva e, em seguida, com o IPA.
   4. Proteger a área modelado do substrato de vidro com a laje de PDMS, e aplicar RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) para remover PLL-G-PEG a partir da zona periférica.
   5. Tratar o microcanal com uma dose reduzida de RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), e, em seguida, alinhá-lo para o substrato de vidro modelado (com a pequena placa de PDMS removidos); trazer o microcanal e o substrato de vidro modelado em contato conformado sob um estereoscópio.

Figura 3: diagramas esquemáticos para microfabricação e chip montagem. a) padrão de pontos de ouro no substrato de vidro. b) Preparação do substrato de vidro para padronização de células através da MAPL. c) O conjunto do canal microfluídico com ligação plasma. Consulte a Lista de Materiais para as definições of as abreviaturas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. fixação das células
   NOTA: As células HeLa são mantidas rotineiramente em DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de solução de antibiótico / anti-mitótico, numa incubadora de cultura de células. Um diagrama esquemático para o acessório de montagem de chips e de células é mostrada na Figura 3C.
   1. Primeiro o chip com PBS durante 30 min a 1 mL / min, e, em seguida, infundir solução de fibronectina (50 ug / mL em PBS, 1 mL / min) durante 45 min.
   2. Enquanto espera, trypsinize cultura de células com 0,25% de tripsina-EDTA, lavar em meio de cultura, as células individuais de centrífuga, e reconstituir a suspensão de células em meio de cultura pré-aquecido (37 ° C) a 5x10 ⁶ células / ml.
   3. Substituir a solução de fibronectina com PBS e lave o chip a 10 mL / min durante 5 min.
   4. Injetara suspensão de células preparada para o chip, parar o fluxo, fixar a tomada, e manter o chip numa incubadora de cultura de células durante 30 min.
   5. Libertar a saída de descarga e o chip com meio de cultura de células a 10 mL / min durante 5 min. Reduzir a taxa de fluxo de perfusão do meio de cultura a 0,75 mL / min e manter a cultura de células durante 2 horas na incubadora.

2. Geração de bolha and Flow Visualization

NOTA: Um esquema da montagem experimental é mostrado na Figura 4a para a geração de bolhas em tandem e a interacção com o fluxo resultante de uma única célula cultivada nas proximidades de um canal microfluídico.

1. Geração de conjunto bolhas com dois lasers e controle de tempo
   1. Colocar o chip de microfluidos com a fase de um microscópio invertido e alinhar os focos de dois pulsados ​​Nd: YAG (λ = 532 nm, 5-ns duração do pulso) sobre um par de pontos do ouro modeladas separadas By 40 uM.
   2. Usar um gerador de atraso digital para accionar os dois lasers com um atraso de tempo cerca de 2,5 mS para produzir duas bolhas iniciadas para os pontos de ouro.
   3. Ajustar a energia de saída do laser (~ 10 μJ) para produzir um diâmetro máximo das bolhas dentro de 50 ± 2 uM.
   4. Sincronizar uma câmera de alta velocidade (exposição de 200 ns e 2 milhões de quadros por segundo (fps)) para os lasers e capturar a dinâmica de expansão da bolha, colapso, a interação bolha-bolha, e formação de jato.
2. Quantificação da velocidade do jacto
   1. Grave a posição da ponta do jacto (J ₁₎ na extremidade proximal da primeira bolha (B ₁₎ e a extremidade distal de B _1, a partir da geração da segunda bolha (B ₂₎ e terminando com o touchdown de J ₁ para a extremidade distai de _um B; veja o esquema na Figura 5a.
   2. Linearmente encaixar o curso de tempo de posição para o both proximal (jet ponta) e as extremidades distais. Calcular o declive da posição da ponta versus a curva do tempo para a extremidade proximal para determinar a velocidade do jacto. A intersecção das duas linhas indica o tempo jet touchdown. Mais detalhes podem ser encontrados na referência 19.
3. A visualização do campo de escoamento induzido pela bolha em tandem
   1. Prepare 1 uM de poliestireno (PS) suspensão de pérolas em água Dl (2,6% w / v) e injectar os grânulos para o chip de microfluidos.
   2. Gerar bolhas em tandem, tal como descrito no passo 2.1.1-2.1.3.
   3. Grave a dinâmica de bolhas conjunto usando uma câmera de vídeo de alta velocidade com velocidades de registo de 5 M fps com um tempo de exposição de 100 ns.
   4. Faça o upload da sequência de imagens adquiridas em um software PIV comercial.
   5. Dividir cada imagem em janelas de interrogação mais pequenas de 16 x 16 pixels (px) com uma sobreposição de 75%.
   6. Aplicar iteração multi-pass e filtros regionais para reduzir os erros no cálculo campo de velocidade eoutput os resultados em um mapa vetor velocidade.

Figura 4: Representação esquemática da montagem experimental e gravação de imagem. a) a configuração experimental para geração de bolhas tandem. b) sequência de tempo utilizado para diferentes tipos de aquisições de imagem. FL: microscopia de fluorescência, BF: Campo brilhante, IFT: o tempo entre quadros. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. célula única análise e Efeitos Biológicos

NOTA: O conjunto de espuma é produzido junto às células alvo, e os efeitos biológicos resultantes são estudados de uma forma dependente da distância de afastamento. A sequência de tempo para diferentes tipos de aquisição de imagem está representado na Figura 4b.

1. Poração membrana e absorção de macromoléculas
   NOTA: A absorção de macromoléculas extracelulares para dentro da célula alvo é caracterizada pela progressiva difusão de iodeto de membrana impermeabilizante propídio (PI) através do local de formação de poros na membrana celular.
   1. Seguindo o passo 1.5, substituir o meio de cultura regular (por exemplo, DMEM) com uma solução de PI (100 ug / ml em DMEM) funcionando a uma taxa de fluxo de perfusão de 0,5 mL / min durante todo o experimento.
   2. Programar o software de controlo do microscópio para seleccionar automaticamente o cubo fluorescente PI na torre rotativa e sincronizar a velocidade da câmara CCD com a excitação de fluorescência de PI para capturar imagens de fluorescência com um tempo de exposição de 200 ms.
   3. Depois de os dois focos de laser são alinhados com um par de pontos do ouro ao lado de uma célula alvo, tanto ficha de campo claro (BF), e as imagens de fluorescência (FL) antes do tratamento bolha em tandem.
   4. Use software de controle de microscópio para imediatamenteiniciar um lapso de tempo de gravação de imagem de fluorescência da célula alvo logo após o passo 2.1 para capturar a história de absorção de PI.
2. deformação da membrana
   1. Prepare os grânulos 1-um (1% w / v, activados com carbodiimida solúvel em água) e funcionalizar-los com Péptido-2000 (100 ug / ml em PBS).
   2. A seguir ao passo 1,5, incubar as células ligadas com as esferas funcionalizadas com uma densidade de 1x10 ⁹ contas / ml a 37 ° C durante 30 min.
   3. Repita o passo 2.1 para produzir bolhas em tandem ao lado da célula alvo e gravar a deformação celular com uma câmera ultra-alta velocidade rodando a velocidades de registo de 5.000.000 fps.
   4. Identificar uma tríade de 3 esferas que permanecem sobre o plano de imagem ao longo da experiência e compilar as suas posições como (x _1, y ₁₎ (X _2, Y _2), e (X _3, Y ₃₎ no experimento de coordenadas.
   5. Calcula-se a área da tríade antes e afo ter que o tratamento bolha conjunto utilizando a fórmula:
      
   6. Calcula-se a estirpe como a área de:
      
   7. Com base nas coordenadas dos três vértices antes e após o tratamento bolha tandem, calcular a principal estirpe e área de tensão local na sequência de protocolos estabelecidos ^20,21.
3. Viabilidade e apoptose
   NOTA: FITC A anexina V rotula células, incluindo os apoptóticos, através da externalização de fosfatidilserina (fluorescência verde). PI rotula os núcleos de células necróticas (fluorescência vermelha). imagiologia campo brilhante é usada para documentar a morfologia das células e para ajudar na identificação da viabilidade celular e a apoptose.
   1. Gravar a posição de cada uma das células tratadas no canal microfluídico (facilitada pelas etiquetas de endereço no canal, ver Figura 2b
   2. Incubar as células tratadas, em meio de cultura de células durante mais 2 h antes de perfusão do chip com solução de FITC anexina V durante 15 min. As células positivas apresentam uma cor verde.
   3. Repetir o passo 3.3.2 em 24 h após o tratamento bolha tandem para estudar os efeitos biológicos de longo prazo nas células-alvo.
4. resposta de cálcio
   1. Misturar 3 uL de solução de Fura-2 AM (1 mg / ml em DMSO) com 3 mL de 10% w / v de Pluronic F-127 em 500 uL de meio de soro reduzido para preparar a solução de rotulagem final (6 uM).
   2. Seguindo o passo 1.5, substituir o meio de cultura de células com a solução de etiquetagem e incubar à temperatura ambiente no escuro durante 40 min (1 mL / min taxa de perfusão).
   3. Encha novamente o canal com o meio de soro reduzido (0,75 mL / taxa de perfusão min) antes de iniciar o experimento celular.
   4. Comece imagem proporcional (comprimento de onda: 340/380 nm, a exposição de 50 ms)da célula alvo, utilizando o sistema de PTI comercial.
   5. Após 10 s de imagiologia raciométrica da célula ao nível de repouso, produzem bolhas em tandem como no passo 2.1; primeira ficha com um tempo de interframe (IFT) de 0,1 s, durante 1 min, em seguida, aumentar a IFT a 1 s para outra min, e aumentar ainda mais a 5 s após 2 min.
   6. Usar o software PTI para calcular a relação R = F340 / F380 na região de interesse (ROI), que é proporcional à concentração de cálcio intracelular.

Results

A plataforma de microfluidos descrito neste trabalho pode ser utilizada para investigar interacções bolha de bolhas e analisar uma variedade de efeitos biológicos induzida por cavitação ao nível de uma única célula. Aqui, nós apresentamos vários exemplos para demonstrar uma variedade de estudos experimentais e bioensaios que podem ser realizados no nosso sistema experimental. Vamos primeiro ilustrar as interações transientes de bolhas em tandem com a formação jato, a visualização do camp...

Discussion

Análise de uma única célula, em combinação com imagens ao vivo de células, melhorou substancialmente a nossa compreensão dos processos dinâmicos e muitas vezes variáveis em células individuais, como o desenvolvimento fenótipo ea resposta imune ^23. Em contraste com a cultura de células em pratos convencional ou frascos, sistemas de microfluidos permita o controle preciso do microambiente, para baixo para o nível de uma única célula, em tempo real. Consequentemente, os avanços na tecnologia de microfluidos e té...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Materiais
75 mm x 38 mm Lâminas de microscópio simples	Corning	2947-75X38
Acetona	Sigma Aldrich, Co.	320110	Reagente ACS, ≥ 99,5%
Álcool isopropílico	Sigma Aldrich, Co.	W292907	≥ 99,7%, FCC, FG
Ácido sulfúrico	Sigma Aldrich, Co.	320501	reagente ACS, 95,0-98,0%
de peróxido de hidrogênio	Sigma Aldrich, Co.	216763	30% em peso em H2O
Primer P-20	Microchem	MCC Primer 80/20
NFR fotorresistente	JSR	NFR016D2
Fotomáscara	Photoplotstore	N/A	4x4 Máscara de gravação direta
MF-319 Revelador	Shipley (Rohm and Haas)	Microposit MF-319
1165 Removedor de fotorresistência	Dow Chemical, Co.	DEM-10018073	1-metil-2-pirrolidinona à base
fotorresistente S1813	Shipley (Rohm e Haas)	S1813
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
filme de parafina	HACH	251764
SU-2025 fotorresistente	Microchem	SU-2025
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0,5KG
Tubulação Microbore	Saint-Gobain PPL Corp.	S-54-HL
Pinos de metal	New England Small Tube	NE-1300-01	Cut Tube (reto), 0,025" OD x 0,017 " ID x 0,50 " Células HeLa longas
	Duke Cell Culture Facility	(307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS (1x) tampão	ThermoFisher Scientific	14190144
Meio de cultura DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065
Fibronectina Proteína Bovina, Plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
0,25% Tripsina-EDTA (1x)	ThermoFisher Scientific	25200056
Iodeto de Propídio	ThermoFisher Scientific	P21493
Microesferas de Carboxilato 1.00  μ m	Polysciences, Inc	08226-15
Microesferas de Carboxilato 2.00  μ m	Polysciences, Inc	18327-10
EDC (cloridrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida)	ThermoFisher Scientific	22980
Sulfo-NHS	Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)	24510
Peptite-2000	Advanced BioMatrix	5020-5MG
FITC Anexina V	ThermoFisher Scientific	A13199
Fura-2, AM	ThermoFisher Scientific	F1221
DMSO	Sigma Aldrich, Co.	D2650
F-127	invitrogen	P6866	0.2 µ m filtrado (Solução a 10% em Água)
Meio de soro reduzido	ThermoFisher Scientific	11058021
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento
Plasma asher	Emitech	K-1050X	O2 / Ar plasma cinzas de fotorresistente e outros materiais orgânicos
Alinhador de máscara	SUSS MicroTec	MA6/BA6
	Suss CHA Industries	CHA Industries Solution E-Beam
RIE	Trion Technology	Trion Technology Phantom II	(óxido / nitreto / polímero)
estereoscópio	AmScope	American Scope SM-4TZ-FRL	Microscópio estéreo
Bomba de seringa	Chemyx Inc	NanoJet
Incubadora de cultura de células	NuAire	AutoFlow NU-8500 Jaqueta de água CO2 < / sub>Incubadora
Cabines de segurança biológica	NuAire	NU-425-400
Banho-maria	VWR	1122s
Centrífuga	IEC	Centra CL2
Microscópio	Zeiss	Axio Observer Z1
Nd:YAG laser  (laser 1)	New Wave Research	Tempest
Nd:YAG laser  (laser 2)	Orion		da New Wave Research
	Berkeley Nucleonics	Lâmpada de flash BNC 565-8c
	de tubo de flash acoplada a fibra Dyna-Lite ML1000
		Câmera de alta velocidade Imacon 200
	Shimadzu	HPV-X
	Vision Research	Phantom V7.3
LaVision		DaVis 7.2
	Zeiss	AxioCam MRc 5
Sistema	Zeiss	AxioVision
PTI	Horiba	S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio software	Horiba	Easy Ratio Pro 2	versão 2.3.125.86
63&vezes; objetiva	Zeiss	LD Plan Neofluar