A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

Resumo

Este protocolo descreve a intravital imagem de ratos transgênicos expressando marcadores fluorescentes específicos de célula. Intravital imagem fornece um método não-invasivo para observações de alta resolução em animais vivos usando windows implantáveis, através do qual a visualização microscópica de processos é possível. Este método é especialmente útil para estudar processos longitudinais.

Resumo

Tumor e desenvolvimento de vasos do tumor, bem como a resposta do tumor à terapêutica, é processos biológicos altamente dinâmicos. Histologia fornece informações estáticas e muitas vezes não é suficiente para uma interpretação correta. Intravital avaliação, em que um processo é seguido em tempo, fornece informações extras e muitas vezes inesperadas. Com a criação de animais transgénicos, expressando marcadores celulares específicos e marcadores de células vivas, melhorias de equipamentos de imagem e o desenvolvimento de várias câmaras de imagens, microscopia intravital tornou-se uma ferramenta importante para compreender melhor processos biológicos. Este artigo descreve um projeto experimental para a investigação do desenvolvimento de vasos do tumor e dos efeitos terapêuticos de forma espacial e temporal. Usando esta configuração, o estágio de desenvolvimento do navio, formação de células e lúmen ponta, fluxo sanguíneo, extravasamento, uma cama vascular estabelecida e destruição vascular pode ser visualizado e seguido. Além disso, efeitos terapêuticos, intratumoral de destino e a localização de compostos quimioterápicos também podem ser seguidos.

Introdução

Enquanto em vitro estudos permitem alta resolução de imagem cinética de processos, experimentação em vitro não permite avaliação no contexto adequado. Por exemplo, a interação das células tumorais com compartimentos do estroma ou entrega de drogas e distribuição dentro de um tumor não pode ser estudada em uma placa de cultura. Modelos animais são usados, portanto, para imitar a fisiologia humana e patologia. No entanto, a imagem longitudinal dos processos, especialmente em uma resolução subcellular, é um desafio. Molecular, métodos de imagem, tais como ressonância magnética (MRI), emissão de fóton único calculado tomografia computadorizada (SPECT) e tomografia por emissão de pósitrons (PET), tem profundidades de penetração boa mas falta resolução ou falharem ilustrar as estruturas anatômicas. Optical imaging oferece alta resolução e permite a geração de imagens de estruturas, mas é acompanhado por pobres a penetração mínima¹. A aplicação da microscopia intravital em combinação com janela de câmara tecnologias, tais como um dorsal dobras cutâneas ou janela abdominal, permite alta resolução de imagem em vivo^2,3,4. Esta tecnologia tem vantagens distintas, pois permite imagem longitudinal durante horas e até dias, para a imagem latente de processos no contexto adequado (por exemplo, interações célula-célula no tecido imagem) e de resolução nos limites da ópticas de microscópios confocal e do multiphoton avançados.

A introdução de animais transgénicos com etiquetas fluorescentes de célula ou proteína específica abre uma infinidade de possibilidades de experimentos in vivo e ex vivo . Para instância, interações célula-célula, a produção de proteínas e a resposta a manipulação ou terapia podem ser estudados na vivo usando estes modelos^5,6,7,8. Importante, coloque no lugar e tempo podem ser determinados com o equipamento de imagem adequado e metodologia. Aqui, a microscopia intravital de animais expressando um marcador endotelial em combinação com agentes injetáveis em um tumor implantado em uma modificada que dorsal dobras cutâneas câmara janela é apresentada.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram feitos em conformidade com a lei holandesa, e protocolos foram aprovados pela Comissão de Experimentação Animal de Erasmus MC, Rotterdam, Holanda.

1. destinatário Mouse

1. Quando os ratos transgénicos nascem, tela os animais para o genótipo apropriado usando procedimentos padrão⁹.
   Nota: Neste manuscrito, são apresentados dados obtidos a partir de uma linha eNOStag-GFP⁹ desenvolvido internamente e uma linha de¹⁰ ROSA-mTmG (estoque 007676) adquirida.
2. Use os ratos que são 12 semanas de idade ou mais e que estão acima de 20g.

2. o doador Mouse

Nota: Um fragmento do tumor para implantação na janela dorsal é obtido de um animal doador não-transgênicos. Dependendo do tipo de tumor, normal (com tumores syngeneic) ou camundongos imunodeficientes (xenografts) são utilizados.

1. Crescem as células do tumor em um meio com os suplementos adequados em frascos de cultura em 37 ° C e 5% de CO₂.
2. Remover o meio dos frascos de célula, lave uma vez com PBS 1x e separar as células usando a tripsina 0,25%.
3. Inativar a tripsina pela adição de meio de cultura celular. Coletar as células, spin para baixo a 1.200 x g por 5 min e resuspenda o pellet em 5 mL de PBS.
4. Dilua 20 µ l de suspensão de células com 20 µ l de trypan azul, que manchas de células mortas. Contar o número de células vivas e mortas, usando um hemocytometer; o número de células mortas não deve exceder 10%.
5. Girar as células novamente a 1.200 x g, durante 5 min e ressuspender as células em PBS gelado, rendendo 1 milhão células por 100 µ l. transportam as células no gelo para a sala de cirurgia.
6. Anestesia o animal com isoflurano/O₂. Ativar o oxigênio e ajustar o fluxo de 0,5 mL/min. Ajuste o vaporizador de isoflurano para 3%. Depois de alguns minutos, coloque o mouse na câmara de anestesia.
   Nota: Prefill da câmara para garantir que está pronto para uso minimizar o estresse.
7. Quando o mouse está sedado, trazer o animal para a mesa de operações do aquecimento, mantida a 37 ° C e coloque o focinho do cone de nariz de anestesia.
   1. Nota: O animal está sedado corretamente quando nenhuma reação a uma pitada de Whitney é notável.
8. Raspe o mouse para visualizar melhor o local da injeção. Inocular utilizando uma seringa de insulina de 0,5 mL; injetar o flanco do mouse 100 µ l de células e permitem que um tumor desenvolver.
9. Eutanásia do animal por deslocamento cervical sob anestesia como aprovada pela sua Comissão de uso e cuidado institucional do Animal.  Usando micro tesoura e pinça, aberto a pele no local do tumor e dissecar o tumor. Colocar o tumor em uma placa de Petri com PBS. Usando micro tesoura e pinça, corte o tumor em fragmentos de aproximadamente 1 mm³ (figura 1A-a).
   Nota: O tumor do mouse doador deve ser grande o suficiente para dar material suficiente, mas devem ser evitadas grandes tumores necróticos. Para a maioria dos tumores, diâmetro médio de 10 mm é suficiente.

3. a implantação da câmara de janela

1. Execute todos os procedimentos sob condições assépticas. Autoclave a instrumentos cirúrgicos (figura 1A) e materiais de câmara (figura 1B).
   Nota: Câmara de janela, usado aqui, com um peso total de 1,1 g, feita de poli éter-cetona (PEEK), um material leve, sintético MRI compatível. PEEK é 3.4-fold mais leve que o titânio, que é comumente usado na literatura para estas janelas. Ele é resistente à maioria dos produtos químicos, é inerte, não provocar reações imunes e é resistente. Esta janela também é menor em design comparado com windows previamente publicados. Ratos equipados com esse show de janela plena capacidade de movimento, podem subir e ganho de peso comparativamente aos ratos sem uma câmara de janela. Porque o animal pode morder na janela, o windows sintéticos podem durar um pouco mais curtos em relação ao windows de titânio; no entanto, eles são fáceis de fazer e são baratos. Estas janelas particulares são feitas em casa e podem ser adquiridas mediante solicitação.
2. Sede o mouse destinatário usando anestésicos por inalação (i.e., isoflurano/O₂) em uma câmara de anestesia. Trazer o rato para a mesa de operação aquecida mantida a 37 ° C e colocar o focinho do cone de nariz de anestesia (ver passo 2.6). Aplica a pomada para evitar ressecamento.
3. Remova o cabelo de toda a volta pelo barbear e aplicar gel de remoção de cabelo. Cuide-se que todo o gel é removido enxaguando o animal cuidadosamente com água da torneira quente mão. Seque o animal e limpar a pele com álcool 70%.
   Nota: O procedimento de barbear também pode ser feito no dia antes da implantação da janela. O creme precisa ser removido completamente com água morna de mão, pois isso pode causar irritação da pele.
4. Marca a linha de centro na espinha do mouse com um marcador para garantir o posicionamento simétrico da câmara. Reposicionar o mouse, puxar a pele em uma aba usando a linha de centro como uma posição de dobramento e agarrar no meio da aleta. Posicione a janela tal que o topo do quadro é pelo menos 2 mm abaixo da linha central e o círculo, a área de exibição da janela na pele com um marcador.
5. Usando um tamanho de titular/lâmina de bisturi 15 e micro tesoura, retire a pele ao longo da linha circular desenhada. Tenha cuidado para não danificar a fáscia subjacente.
   Observação: Isso cria a área de exibição da janela da câmara em que o tumor é transplantado.
6. Puxe as dobras cutâneas e use um furador de orelha para fazer buracos de 1 mm de diâmetro através da pele, um de cada lado da área de exibição (figura 1A-b).
   Nota: Estes são buracos para dois parafusos fixar os caixilhos juntos.
7. Coloque o quadro feito por câmara frontal com parafusos (Figuras 1B-a, 1B-c) e posicionar o quadro de volta (figura 1B-b) sobre os parafusos. Coloque o quadro de volta sobre os parafusos porcas (figura 1B-d).
   Nota: Estes parafusos são usados para corrigir as câmaras juntos contra as dobras cutâneas e depois são usados para imobilizar a câmara durante a avaliação sob o microscópio.
8. Puxe a pele 2-3 mm acima do topo dos quadros e certifique-se que a área de exibição de janela para transplante corresponde a área da câmara. Lugar de 23 G agulhas através dos dois orifícios de pequena sutura (figura 1B, seta preta) na parte superior do quadro. Aperte as porcas sobre os parafusos com uma chave de fenda micro (figura 1A-c) e uma fixação da agulha para imobilizar as porcas.
   Nota: Tome precauções para garantir que a pele não vire os parafusos e não aperte demasiado.
9. Substitua as agulhas com suturas, começando na parte superior, para corrigir os frames contra a pele. Faça isso por 5 pares de buracos de sutura (figura 1B, seta branca) no quadro.
10. Vire o mouse para revelar a parte traseira da câmara de janela. Coloque um pedaço grosso de vidro de enchimento com um diâmetro de 10 mm e uma espessura de 0,55 mm (figura 1B-e) e, em seguida, um vidro de tampa padrão de 12 mm (figura 1B-f). Secure-estas com um anel de retenção (figura 1B-g) na área traseira da câmara.
    Nota: O copo de enchimento impede o espaço para abrir entre a fáscia e a janela na parte frontal, que é usado para tratamento de imagens.
11. Hidratar a área de exibição de janela em que o tumor será inserido preenchendo uma seringa de 1 mL com estéril 0,9% NaCl. Permitir que algumas gotas a cair sobre esta área de exibição. Remova o excesso soro fisiológico com uma ponta de algodão estéril.
12. Na fáscia, crie um bolso grande o suficiente para manter o 1 mm³ tumor fragmento (figura 1A-a) usando uma agulha 25g com sua ponta é dobrado em um ângulo de 90 ° (figura 1A-d). Usando uma agulha ou pinça Kelly, inserir o fragmento de tumor no meio da área de exibição de janela para transplante no bolso.
13. Feche a área de exibição de janela com um vidro de tampa padrão de 12 mm e um anel de retenção.
    Nota: Pode dar forma a uma bolha de ar, mas desaparecerá dentro de horas.

4. pré e pós-tratamento do Animal

1. Administre drogas para alívio da dor (ou seja, a buprenorfina 0,05 mg/kg) por via subcutânea como aprovada pela sua Comissão de uso e cuidado institucional do Animal. Permitir que o mouse para recuperar da anestesia sob uma lâmpada de aquecimento.
2. Coloque a janela-rolamento ratos individualmente em uma gaiola e em uma sala climatizada, definir a 32 ° C e acima de 50% de umidade. Certifique-se que as garrafas de água está à temperatura ambiente antes de colocá-los na gaiola para evitar fugas. Use gaiolas e enriquecimento que permitem movimento desobstruído e acesso à comida e água.
   Nota: Como esta câmara de janela é muito bem tolerada, ratos mostram comportamento normal. Habitação individual evita danos à câmara janela causada por outros ratos, e a alta temperatura/umidade impede a refrigerar para baixo e desidratação da dobras cutâneas.
3. Verifique se o mouse regularmente para suturas mastigado-fora, parafusos e porcas soltas ou vidro quebrado. Imediatamente, reparar e substituir quando isso acontece. Uma tampa feita de material leve pode ser usada para proteger a janela.

5. intravital imagem

Nota: Neste procedimento, um microscópio do multiphoton e o software de controle apropriados são usados. Aqui, os pacotes de software que foram fornecidos com microscópios são usados. Em princípio, qualquer pacote de software que vem com um microscópio e destina-se para o controle do microscópio e para a captura de imagens será suíte esta finalidade.

1. Ligue o sistema: PC/microscópio, unidade de controle confocal, poder do laser e de emissão de laser. Por exemplo, com este software, inicie o software e inicializar a tabela de microscópio (Figura 1E-a e 1E-c) clicando em "inicializar tabela." Ligue o sistema e configurá-lo para o modo permite o PC controlar o microscópio, mesa xy, z-posicionamento e captura de imagem.
2. Ligue a luz fluorescente (Figura 1E-b).
   Nota: Isto é usado para avaliar imagens de fluorescência através da ocular, juntamente com campo claro.
3. Ligue a plataforma sob medida, de controlo de temperatura (Figura 1 C-c; descrito na discussão mais detalhadamente) definir a 37 ° C.
4. Liga o aparelho de anestesia com isoflurano/O₂ (Figura 1E-d). Monte o tubo de anestesia no palco microscópio (Figura 1-C-e). Instale um grampo no xy-palco para consertar o pedaço de focinho de anestesia.
5. Avaliar previamente o animal para estabelecer o estágio de desenvolvimento do navio de tumor; Isso depende da velocidade de crescimento do tumor, mas pode variar entre ratos individuais.
   1. Sedar o mouse usando anestésicos por inalação (isoflurano/O₂) em uma câmara de anestesia (ver passo 2.6).
   2. Coloque o animal na plataforma climatizada montada no palco microscópio; Isso impede que o arrefecimento do animal quando ele está anestesiado. Certifique-se de que o focinho do rato está localizado no cone da anestesia e aplicar a pomada, se a avaliação vai demorar mais do que 5 min.
      Nota: Para uma avaliação mais de 1h, reduza o fluxo de isoflurano para 2%.
   3. Use os parafusos da câmara para corrigir (Figura 1-C-b, seta cheia) a câmara em um suporte de câmara sob medida (Figura 1-C-a). Dane-se este suporte (Figura 1-C-d, seta tracejada) para a plataforma aquecida (Figura 1 C-c).
      Nota: Esta combinação evita artefatos de movimento na área de exibição de janela enquanto ainda permitindo o animal respirar livremente.
   4. Certifique-se de limpar o vidro da área de exibição de janela com uma ponta de algodão embebida em água para evitar uma imagem borrada e interferências provenientes de detritos do lado de fora do vidro. Coloque a plataforma e o mouse no palco microscópio (Figura 1).
      Nota: tenha cuidado que a cauda não ficar preso entre a plataforma e o estágio de microscópio.
   5. Verifique visualmente o estágio de desenvolvimento de tumor navio usando um 10 X lente objetiva campo claro e luz fluorescente.
      Nota: Os navios fluorescentes devem estar em foco e o fluxo de sangue deve ser visível usando campo brilhante. Quando o sistema vascular é visto claramente, avalie o estágio de desenvolvimento do navio de tumor. Por exemplo, determine se existem angiogénese precoce com o crescimento de células de ponta ou uma vasculatura já estabelecidas para a entrega da droga. O mesmo animal pode ser avaliado novamente, e como tumor desenvolvimento é um processo contínuo. Vários estágios podem ser observados em um tumor único, ao mesmo tempo.
      1. Quando não é possível focar a vasculatura, retire o animal do palco, deixe-o recuperar do mouse e lugar para o animal de volta em um espaço climatizado. Vejam novamente mais tarde. Quando o mouse está pronto para avaliação, continue com o processo descrito abaixo.
6. Ligue o laser confocal e painel de controle clicando em "Laser" e "Painel de Ctrl" na guia de configuração
   Nota: Recomenda-se definir a potência do laser baixa, particularmente para o laser de argônio, para evitar o branqueamento, o aquecimento do tecido e Fotodano. O painel de controle pode ser definido como preferências pessoais. Para intravital imagem usando vários fluorophores recomenda-se aplicar as seguintes configurações: "inteligente ganho, 100 V, por sua vez," inteligente"deslocamento, 10%, por sua vez," ", médio,""X posição do zoom, média," "posição Y, médio," e "Posição Z, 100 µm por vez." Antes da imagem, ajuste o deslocamento para minimizar o ruído e otimizar a relação sinal-ruído. A função zoom confocal permite uma maior ampliação sem mudar as lentes objetivas. X, Y e Z controle é necessário para localizar os campos de interesse. Para microscopia intravital, Z-posicionamento deve ser cerca de 100 µm por turno como tecido de carrapato é avaliado.
7. Clique em "Aquisição" no guia de adquirir e altere a configuração para: "Modo de aquisição XYZ ou XYZT," "Formato (512 x 512 ou 1024 x 1024)" e "Velocidade (400 Hz ou 200Hz)." Clique em "Pinhole" e defina-o como 1 unidade arejada. Clique no "X bidirecional".
   Nota: Para otimizar as imagens, um equilíbrio entre o poder do laser, ganho e pinhole deve ser atingido, que é mencionado na discussão.
8. Ao avaliar múltiplos fluorophores, selecione "varredura sequencial" e "entre quadros" para evitar infiltração, que é mencionado na discussão.  Escolha "Linha média 4" para obter uma boa redução do ruído.
   Nota: Dependendo da fluorescência intrínseca presente no animal transgénico, outros marcadores fluorescentes, como dextranos, Hoechst, FITC-BSA, chemotherapeutics fluorescente, ou nanopartículas diluídas para a concentração desejada em 0,9% NaCl pode ser administrados e avaliados no tumor. Estes são injetados através da cauda ou da veia peniana.
9. Clique em "Experiência" no guia de adquirir e selecione "New" para fazer um novos dados de base.
10. Avaliar o uso de animais, dependendo da questão de investigação, 10x, 20x ou 40 objetivo X lentes. Através da ocular, encontre uma posição para avaliar.
    Nota: É melhor usar lentes secas com um nd tão alto quanto possíveis, secas como lentes têm um trabalho relativamente longo distância e líquido de imersão não necessidade de fazer. Na discussão, é mencionado o uso de lentes objetivas de imersão de água.
11. Use um scan rápido ao vivo para encontrar o ganho adequado e o deslocamento para evitar a superexposição e otimizar a relação sinal-ruído. Também, manter as mesmas configurações de imagem durante e entre as experiências se comparação quantitativa é necessária.
    Nota: Considerações adicionais para a imagem latente ideal são mencionadas na discussão. A posição de XYZ e o zoom podem ser finalizados durante a verificação ao vivo usando o painel de controle.
12. Para fazer um Z-pilha, selecione "Z-pilha" no guia de adquirir faça um Z-scan rápido usando o Z-posição no painel de controle e definir o início e o final da verificação, clicando em "Begin µm" e "Final µm." Defina o tamanho de Z-passo relacionado com o tamanho do pinhole.
13. Capturar as imagens, clicando em "Iniciar".
    Nota: Como a microscopia intravital é tudo sobre cinética e processos dinâmicos, portanto, são observados, um compromisso entre o tempo necessário para adquirir uma imagem e a velocidade dos processos biológicos deve ser feita. Em geral, quanto maior a resolução, os canais mais fluorescentes são digitalizados e quanto maior a verificação de campo, os mais pixels por imagem. Z-pilhas mais grossos tradução para um tempo mais de imagem. Uma vez mais a imagem aumenta a chance de artefatos de movimento e pode causar danos no tecido cuja imagem. Também, estar ciente de que certas etiquetas fluorescentes de digitalização causa descoramento e toxicidade, que é afetada pelo poder do laser e a concentração do corante acumulada.
14. Após a digitalização da Z-pilha pode ser avaliada rapidamente clicando em "projeção máxima". Z-pilha é automaticamente guardada na base de dados e pode ser renomeada.

6. análise de dados

1. Dependendo da pergunta de pesquisa original, use um dos vários programas de software, tais como o ImageJ⁵, Matlab¹¹ou Amira, para análise de dados. Análise correta é crucial.

Resultados

O principal atributo de intravital imagem é a visualização longitudinal de processos celulares sem intervenção invasiva. Por isso, são utilizados animais transgénicos, expressando um marcador fluorescente constitutivo ou inducible nas células de interesse. A Figura 2 ilustra a expressão de etiquetas fluorescentes em proteína de eNOStag-verde fluorescente (GFP)⁹ e Rosa-mTmG rato linhas¹⁰. O eNOStag-GFP é uma linha de rato que foi produzida internamente usando um gene eNOS truncado como uma marca para as boas práticas agrícolas. Importante, eNOS é altamente expressa em células endoteliais, e o sinal GFP é claramente visto em th eGolgi e membrana celular (Figura 2A). Rosa-mTmG os ratos têm um alelo de repórter do Cre de membrana-alvo fluorescência de duas cores. Esta linha expressa mTomato de fluorescência em células generalizadas e mGFP em células de Cre recombinase-expressando e é vastamente usada para rastreamento de linhagem. Um pedaço do tumor é transplantado de um doador não-transgênicos, fluorescência vermelha é predominantemente expressa por partes do estroma no tumor (por exemplo, na membrana das células vasculares, circulantes de células, infiltrado de células do sangue e tumor-associados fibroblastos (Figura 2B)).

Formação de vasos é fortemente regulamentada, e um excelente modelo para estudar isto é o desenvolvimento retina^12,13. Também, o crescimento do tumor navio é um processo cinético que é similar em princípio ao desenvolvimento de vasos da retina. No entanto, os vasos do tumor faltam de organização e, como um tumor é continuamente remodelação, assim é a vascularização do tumor-associado. Isso pode ter suas vantagens ao usar o tumor como um modelo de angiogênico, como todas as fases do desenvolvimento de navios podem ser encontradas no mesmo tumor ao mesmo tempo. Estes incluem uma frente de brotos endotelial crescendo em uma parte não-vascularizada do tumor (Figura 2); navios danificados (Figura 2D); e uma cama vascular estabelecida (Figura 2E-eu) com maduro, ramificada vasos (Figura 2E-II). No entanto, as células endoteliais angiogênico também podem ser encontradas nestas áreas. Quando estimulado pelo estímulo angiogênico, uma célula endotelial se projeta filopodia (Figura 2E-III) e pode avançar em uma célula de ponta, usando estes filopodia para migração de digitalização e direcional (Figura 2E-IV). Esta célula de ponta migra para o interstício do tumor e é seguida por dividindo pilhas de haste. Uma célula única dica endotelial tem vários filopodia expandindo, retraindo e renovando a qualquer momento e pode ser controlada usando microscopia intravital (Figura 2F).

Em segundo lugar, a microscopia intravital pode ser usada para determinar a formação do lúmen em uma frente de angiogênico, fluxo em todo o tumor e extravasamento de sangue. Dependendo já-presente intrínsecos sinais fluorescentes no animal, diferentes compostos fluorescentes podem ser administrados. Extravasamento e fluxo de sangue podem ser visualizados usando Hoechst, dextranos fluorescentes ou FITC-BSA. Para estudos estendidos no extravasamento de fluxo e partículas de sangue, longa circulação fluorescente etiquetado peguilado nanopartículas de 100 nm pode ser usado. Para detalhes sobre a preparação dessas nanopartículas, consulte um de publicação anterior⁵. O emprego destes compostos é demonstrado na Figura 3. As células endoteliais de ponta em um rato Rosa-mTmG podem ser vistas claramente invadindo o tecido do tumor. Fluxo sanguíneo funcional é demonstrado pela fluorescência roxa de nanopartículas sistemicamente injetadas no lúmen dos tubos vasculares (Figura 3A-eu). Nanopartículas de perto atingem células endoteliais ilustrando a formação de um lúmen na área de pilha de haste (Figura 3A-II). A entrega do chemotherapeutics sistemicamente administrado depende uma vasculatura funcional para atingir o interstício do tumor, e conforme mostrado na Figura 3B, agentes injetáveis, independentes do seu tamanho, não penetrar áreas com navios destruídos, comprimido navios e embarcações com estase de sangue.

Na maioria dos órgãos, o revestimento endotelial forma uma barreira funcional entre o sangue e o tecido subjacente, e a passagem das moléculas é fortemente regulamentada. Vascularização do tumor-associado, no entanto, é conhecida por ser furado, e limite de tamanho de poro depende grandemente do tipo de tumor¹⁴. Dextranos conjugado fluorescente com tamanhos diferentes podem ser injetados para avaliar o fluxo sanguíneo, permeabilidade e extravasamento. Hoechst (615 Da) difunde-se rapidamente no tecido do tumor e é retomada por células circundantes (Figura 3-eu). Logo após a injeção, dextrano de 10 KDa (figura 3CII) e MDa 2 (Figura 3 C-III) são encontrados no sangue. No entanto, dextrano que kDa 10 também é visto no interstício do tumor, indicando a permeabilidade do revestimento endotelial para moléculas menores, que é uma característica atribuída aos navios de tumor. 40 min após injeção (Figura 3 C-IV), dextrano KDa 10 está desmarcados o fluxo de sangue (Figura 3 C-V) e a intensidade fluorescente de dextrano 2MDa é também diminuída (Figura 3 C-VI). No entanto, dextranos grandes não são encontrados no interstício do tumor, demonstrando uma falta de permeabilidade para as grandes moléculas dentro deste prazo.

Fisiopatologia do tumor, com suas áreas altamente proliferando, necróticas e un-vascularizadas, pode ser bastante informativa quando usando o tumor como um modelo de angiogênico. No entanto, isto apresenta um problema para uma terapia eficaz e investigação. A heterogeneidade da vasculatura associada a tumor provoca uma distribuição heterogênea de drogas administradas, deixando de¹⁵áreas inteiras sem drogas. Para melhorar a entrega de drogas, várias estratégias podem ser aplicadas^15,16,,¹⁷, e progressão terapêutica pode ser examinado usando esse projeto intravital. Vasculatura tumor-associados pode ser manipulada usando agentes vasoativas para melhorar a entrega de drogas¹⁷. Os resultados da manipulação de navio de tumor usando alfa de necrose de tumor (TNF) como um agente vasoativas em combinação com Doxil, formulação lipossomal encapsulada de doxorrubicina, como um agente quimioterapêutico são apresentados neste manuscrito^{5, 18 , 19}. em contraste com dextranos, peguilado nanopartículas são feitas para circular por várias horas, senão dias, a circulação de sangue²⁰.

Como mencionado anteriormente, a área do tumor pode ser pre-digitalizada para identificar as áreas de tumor correto dependendo a pergunta de pesquisa. Destino da droga pode ser avaliado em áreas com uma vasculatura funcional versus áreas com uma cama vascular já danificada (dados não mostrados). Para investigar o destino de agentes quimioterápicos sem interferência citotóxico, nanopartículas com a mesma composição que o agente terapêutico podem ser usadas como uma droga de modelo. Um animal de eNOStag-GFP foi tratada i.v. com essas nanopartículas e fotografada 24 horas mais tarde. Nanopartículas estiveram ainda presentes na vasculatura, com mínima extravasamento para o interstício do tumor (Figura 4A-eu). No entanto, quando nanopartículas foram administradas em combinação com TNF, extravasamento observou-se do fluxo de sangue para o interstício do tumor (Figura 4A-II), aumentando a entrega de drogas intratumoral. Usando lentes de objetivas de alta resolução, a localização intracelular de um composto pode ser reconhecida, como mostrado aqui pela localização nuclear da Hoechst em verdes células endoteliais e células do interstício do tumor (Figura 4B). Além disso, como muitos agentes quimioterápicos, como doxorrubicina, intercalam-se com o DNA, a localização destes compostos pode ser avaliada. Doxorrubicina tem propriedades fluorescentes vermelhas, e o nanocarreador pode ser rotulado com, por exemplo, tetramethylindotricarbocyanine perclorato (DiD). Um animal de eNOStag-GFP foi injetado i.v. com Doxil-fez em combinação com TNF, e imagens foram tiradas 24 h após o tratamento. DOXIL-extravasado fora dos vasos sanguíneos e foi tirada por tumor tecido circundante up (Figura 4-eu). Uma avaliação mais detalhada das células individuais (Figura 4 C-II) mostrou que o portador pode ser encontrado no citoplasma, enquanto lançada doxorrubicina observou-se no núcleo celular.

Figura 1: instrumentos, dorsais câmara de dobras cutâneas e instalação de equipamentos necessários para o procedimento. (A) fragmentos de Tumor (um) e instrumentos cirúrgicos necessários para a implantação. Instrumentos padronizados são um furador de orelha (b), um motorista de micro parafuso (c) e uma agulha torta (d). Dorsal (B) câmara de janela de dobras cutâneas. Dianteiro (a) e (b) janela de volta (seta: furos para suturas; seta: furos para parafusos), 2 parafusos (c), 2 porcas (d), 1 enchimento de vidro (e), 2 vidros de tampa (f) e 2 mantendo anéis (g). Além disso, reter anéis sem ganchos (seta branca) pode ser usado quando necessário. Da plataforma de controle de temperatura (C) câmara feito por titular (A), parafusos para o suporte de câmara-de-câmara (b), (c), os parafusos para fixar o suporte de câmara para a plataforma (d), e o titular com a anestesia do tubo (e). (D) Animal montado no suporte de câmara na plataforma. Um tumor de B16BL6 (seta) é visível na área de exibição de janela. (E) equipamento necessário para a avaliação intravital. Computador com imagem e microscópio controle software (um), padrão fluorescente luz (b) e o microscópio. Um multiphoton confocal foi usado (c) com uma unidade de anestesia (d). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: fluorescência intrínseca de animais transgénicos. Todas as imagens mostradas aqui são projeções de Z-pilha entre 50 e 70 µm de espessura. (A) na linha de eNOSGFP-tag, GFP é expressa na membrana celular (seta) de células endoteliais e Golgi (asterisco). Barra de escala = 100 µm. (B) Intratumoral expressão de mTomato na linha Rosa-mTmG é predominantemente encontrada na membrana celular de células vasculares (seta) e as células do sangue (asterisco). Barra de escala = 100 µm. (C) A projeção de crescimento angiogênico fachada em tumor não-vascularizada. Barra de escala = 100 µm. (D) A projeção de uma parte do tumor com vasos danificados e estabelecidos (asterisco). (E) uma projeção da vasculatura tumor estabelecida (EI) mostrando maduro carrapato navios (EII); angiogênico células endoteliais com filopodia (EIII, ponta da seta); e um navio maduro, do qual uma única célula endotelial estende um filopodium (EIV, ponta de seta) para o interstício. Barra de escala = 100 µm. (F) circulação do filopodia, seguido por 1h. Cada 15 minutos, um Z-pilha foi tirada; uma projeção máxima é aqui apresentada. O filopodia estão estendendo (seta branca), estagnação (=), retracção (seta vermelha), ou até mesmo completamente desaparecendo (-). Barra de escala = 25 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: administração de injetáveis rótulos para ilustrar o extravasamento e fluxo sanguíneo. Rato de mTmG (A), A Rosa foi injetado com nanopartículas fluorescentes roxas, e uma Z-pilha de uma frente de célula invasora dica foi tirada 10 min mais tarde (AI). Uma projeção mostrando que brotos endoteliais mais tem um lúmen funcional (tudo, seta). Só raramente brotos endoteliais podem ser vistos sem fluxo (AII, ponta de seta). Barra de escala = 250 µm. (B) esta projeção Z-pilha mostra uma área vascular do tumor destruído em um animal de eNOStag-GFP antes do tratamento (BI). O animal foi injetado com nanopartículas (roxo, BII) e Hoechst (azul, Bill). Nanopartículas e Hoechst não atingem áreas destruídas, indicadas por detritos celulares granulado ainda expressando GFP. Barra de escala = 250 µm. (C) um rato eNOStag-GFP foi injetado com duas dextranos de tamanhos diferentes (vermelho = dextrano 2 MDa; roxo = dextran 10 KDa) e Hoechst (azul = 615 Da), e imagens do único-avião são apresentadas aqui. 10 min após a injeção, a presença no sangue e extravasamento são vistos na mesma imagem. Hoechst extravasates quase que imediatamente fora dos vasos sanguíneos e é retomada pelas células circundantes (CI). Dextran 10 KDa (CII) pode ser visto nos vasos e no interstício do tumor. Dextrano 2 MDa (CIII) pode ser encontrada nos vasos. 40 min após a injeção (CIV), dextrano 10 KDa desaparece do sangue (CV), e a intensidade fluorescente de dextrano 2 MDa também foi diminuída (CVI). Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: investigando o destino de agentes quimioterápicos. (A), um animal eNOStag-GFP foi tratada i.v. com nanopartículas e fotografada 24 horas mais tarde. Nanopartículas estão ainda presentes em vasos, com mínimo extravasamento no interstício do tumor (AI). Quando nanopartículas são combinadas com TNF, extravasamento é observado do fluxo de sangue para o interstício do tumor (todos). Barra de escala = 250 µm. (B) usando lentes de alta resolução, o citoplasma endotelial (verde) e núcleo (azul) de uma célula individual podem ser reconhecidos. Barra de escala = 50 µm. (C), um animal eNOStag-GFP foi injetado i.v. com Doxil-fez em combinação com TNF, e imagens foram tiradas 24 horas mais tarde. Aqui, o extravasamento de Doxil-fez fora dos vasos para o tumor interstício é óbvio (CI). Uma avaliação mais detalhada das células individuais (CII) mostra que a transportadora roxa pode ser encontrada no citoplasma (seta), enquanto a doxorrubicina lançada (vermelha) é observada no núcleo celular (seta). Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Como tumor e desenvolvimento de vasos do tumor, bem como efeitos terapêuticos do tumor, processos altamente dinâmicos, avaliação intravital é uma ferramenta elegante para fazer uma correta avaliação destes processos de forma e espaciais-dependente do tempo. Com a crescente disponibilidade de marcadores de células vivas, a criação de animais transgénicos e o avanço das modalidades de imagem, intravital imagem está se tornando cada vez mais popular. Apesar de histologia é ainda rotineiramente utilizada, e uma infinidade de marcadores pode ser usada para identificar as células e estruturas, seccionamento de tecido tem desvantagens ao investigar processos dinâmicos. Dissecção de tecidos é necessária, fornecendo apenas informações estáticas; fixação afeta a qualidade do tecido; e fatiar danifica interacções celulares. Além disso, ao investigar processos dinâmicos, dissecção de tecidos nos pontos de tempo diferentes e muitas vezes presume-se, requer uma grande quantidade de animais. Com intravital imagem latente, as dimensões espaciais XYZ e a dimensão extra do tempo podem ser avaliadas no mesmo animal, possibilitando o posicionamento adequado dos jogadores diferentes no espaço e no tempo. Portanto, pontos de tempo ideal não são perdidos, e o número de animais utilizado por experiência é significativamente reduzido. Em segundo lugar, a janela de tempo estabelecida com avaliação intravital pode ser extrapolada para otimizar a extração de tecido. Em terceiro lugar, o estágio desejado do crescimento dos vasos pode ser identificado intravitally e manchado como um tecido de toda a montagem.

O projeto intravital mencionado neste manuscrito usa uma combinação de animais transgénicos, expressando uma etiqueta fluorescente em células endoteliais, um modificado dorsal modelo de câmara de dobras cutâneas e um microscópio confocal-multiphoton dedicado.

Células endoteliais passam por uma série de etapas^21,22 durante a angiogênese, e estes estágios muitas vezes podem ser vistos simultaneamente em um tumor. Usando a linha de rato eNOSTag-GFP, células endoteliais individuais podem ser seguidas, e mesmo filopodia dinâmica pode ser rastreada. É, portanto, um bom modelo para estudar o desenvolvimento do navio intravitally. Dependendo dos rótulos intrínsecos já-presente, agentes fluorescentes injetáveis podem ser usados para avaliar a formação do lúmen, fluxo sanguíneo, extravasamento e liberação de sangue. O mouse é fotografado continuamente para até 5 h. A avaliação a longo prazo, de um animal é viável quando várias precauções em relação a anestesia do animal, que tem sido descrito anteriormente²³. Como esta pesquisa está focada em câncer, tumores de tecidos ou células foram implantadas. No entanto, também experimentamos com metatarsos e pulmões embrionários. No entanto, a taxa de crescimento do tecido sob estudo é limitante, como depois de algumas semanas, a pele começa a crescer novamente, que pode ser um problema com tumores de crescimento lento ou tecidos.

Durante a fase de validação, o dorsal dobras cutâneas câmara janela foi modificada consideravelmente em comparação com o modelo clássico de⁴. Os quadros são construídos de material sintético autoclaváveis e são leves e pequenas, com uma área de janela-vista grande. O gancho do anel de retenção (figura 1Bg, seta branca) é usado somente para a fácil remoção do anel. Anéis de retenção sem ganchos podem ser usados quando estas interferem com a imagem. A pele não é esticada demais, afrouxamento não ocorre neste modelo, e infecções são raramente vistas. Essas modificações reduzem o desconforto do animal e aperfeiçoar o procedimento animal significativamente. Além disso, as partes de metal podem ser facilmente removidas quando o tumor usando MRI²⁴de imagem.

Qualquer microscópio pode ser adotado para intravitally imagem dorsal câmaras de dobras cutâneas. O principal requisito é o espaço disponível entre o palco do microscópio e a lente objetiva. Um aspecto importante que afeta a imagem latente é movimento. Para evitar os artefatos de movimento, uma plataforma que se encaixa na tabela de microscópio (após a remoção de todas as inserções) e suporta o mouse deve ser usada. Não é necessário conter o mouse quando está sob anestesia, e é melhor deixar o hálito do mouse livremente. No entanto, a janela é aparafusada à plataforma, dando fixação ideal do campo de visão (ou seja, o tumor é visível através da câmara de janela). A plataforma é aquecida usando uma almofada de aquecimento eletrônico, como usado para o aquecimento de animais. Esta plataforma foi feita in-house, e detalhes podem ser obtidos mediante solicitação. Uma lente objetiva de alta resolução é uma necessidade, ao avaliar processos intracelulares e torna possível discriminar entre o núcleo e o citoplasma. O uso de lentes de cônico com uma boa resolução óptica (NA alta) mas um relativamente longa distância de trabalho (de preferência de 2 mm ou acima) é recomendado. A limitação na imagem é a profundidade de penetração e a intensidade fluorescente dos rótulos. Além disso, o fotobranqueamento, fototoxicidade e saturação devem ser evitados durante a imagem latente.

Aqui, foram utilizados um confocal-multiphoton integrado e um microscópio confocal. O multiphoton é vertical, enquanto o confocal é um microscópio invertido. A vantagem de um microscópio vertical é a fácil utilização das lentes de imersão de água. Essas lentes têm um alto at e uma longa distância de trabalho, mesmo em uma ampliação alta (por exemplo, 20 ou 40 X). Especificamente, recomenda-se obter uma lente de imersão de água 20 X at 1.0, que é vendido por várias empresas. Esteja ciente de que, quando são utilizadas lentes de imersão, a lente objetiva e o líquido de imersão precisam ser aquecido a 37 ° C. Para as melhores imagens, recomenda-se usar configurações ideais confocal (i.e., pinhole 1 unidade arejado, laser poder tão baixo quanto possível, ganho não muito alto (especialmente se o ganho introduz ruído), linha velocidade no máximo e não uma média de exames). Superexposição, saturação e diferença de intensidades entre imagens comprometem a qualidade dos dados. É recomendável para evitar a saturação e a superexposição. Isto pode ser contornado através da aquisição de imagens em configurações diferentes de ganho. Alterar o ganho é a maneira mais fácil de alterar o brilho da imagem. Se necessário, a potência do laser pode ser ajustada. Para padronizar a qualidade de imagem, slides com uma intensidade de fluorescência fixo podem ser usados. Se deve ter em mente que mesmo quando o microscópio é definido de forma otimizada, qualidade da imagem é determinada em grande medida pela qualidade da câmara de janela e tecido

Ao digitalizar vários marcadores fluorescentes simultaneamente, infiltração, em que um fluoróforo é detectado no canal do outro, deve ser evitado. Evite infiltração usando uma combinação de fluorophores com espectros de sobreposição mínimos e sequencial de varredura entre os quadros. As imagens apresentadas aqui foram digitalizadas usando 3 varreduras sequenciais (faixa 1: GFP, DID ou fluor647 com o laser 488 e 633; Track2: rodamina, Doxil ou mTomato com o laser 543; e faixa 3: Hoechst com o laser 405).

A possibilidade de avaliar vários estágios de desenvolvimento do navio de tumor, dinâmica celular de ponta, formação do lúmen, extravasamento e lesão vascular é mostrada aqui. Usando a linha de eNOStag-GFP, áreas do tumor com uma cama vascular destruída são facilmente detectadas pelo granulado restos celulares ainda expressando GFP. Nenhum agente injetável foi detectado nestas áreas, indicando a falta de fluxo. Isso significa que o administrados agentes quimioterápicos não atingirá também nestas áreas. No entanto, a destruição do navio também pode ser um resultado terapêutico. Pré-avaliação do tumor, para verificar a destruição do navio de pré-tratamento, é um pré-requisito para a exata avaliação terapêutica e pode ser facilmente executada usando esse projeto experimental.

Existe uma infinidade de possibilidades para que a microscopia intravital pode ser usada, e a discussão detalhada está além do escopo desta publicação. Para dar uma breve visão, possíveis aplicações incluem estudos sobre o acúmulo de chemotherapeutics no tecido do tumor, o desenvolvimento dos vasos (por exemplo, o número de navios, ramos e interseções) e fluxo de sangue, interações célula-célula, célula alvo e processamento intracelular, bem como exemplos acima mencionados e mostrado aqui. Como a análise é baseada em fluorescência, estar ciente das flutuações de intensidade devido à qualidade da janela ou tecido. Além disso, como o tecido do tumor é relativamente espesso, fluorescência de acima ou abaixo do plano de vista tem um impacto sobre o sinal na imagem. É melhor combinar a análise quantitativa de imagem com medições objetivas. Por exemplo, se estiver interessado em concentrações de droga, remover o tecido do tumor da janela depois de microscopia intravital e determinar a conteúdo usando com HPLC para comparar com as imagens confocal de drogas.

A avaliação da resposta do tumor pode ser executada como bem usando este modelo, mas com algumas precauções. Um deve perceber que tumores também crescem para o interior, na pele. Medições 3D podem ser feitas se a penetração que é profunda o suficiente para cobrir todo o tumor. Nesse caso, devem ser utilizados corantes far-red. A câmara de janela como descrito aqui lida com tumores em um ambiente de pele, e é importante salientar que a janela mantém uma temperatura ligeiramente inferior a temperatura de corpo normal do rato. Portanto, é melhor estudar tumores no cenário ambiental bem micro para confirmar estudos intravital com o dorsal dobras cutâneas câmara de janela. Importante, a dorsal dobras cutâneas câmara oferece uma visão sobre a cinética de processos e mecanismos, proporcionando uma base fundamental para a melhoria da terapia. Além disso, podem ser obtidas informações extras sobre a biodistribuição e farmacocinética. Classicamente, estes estudos de biodistribuição são realizados por tratar os animais de tumor-rolamento e dissecando tumores/órgãos para medir a absorção de drogas. Usando este modelo intravital, a localização de intratumoral de uma droga (ou seja, intravascular, intratumoral, intracelular ou nuclear) pode ser fornecida^5,25,26. Não só é a localização da droga revelada, mas também a tempo janela-de-oportunidade para a melhor absorção.

Usando o desenho experimental descrito neste artigo, uma vasta gama de parâmetros pode ser avaliada em uma configuração espacial e temporal. Especificamente, aqui nós mostramos que a microscopia intravital fornece importantes insights sobre a dinâmica do desenvolvimento de vasos do tumor e resposta terapêutica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Sigma	D1145	Suplementado com 10% de
FCS Tripsina-verseno (EDTA)	Lonza	BE17-161E	Faça uma solução a 0,1% em PBS, PBS
Caixilharia de janela	Feito sob medida
Vidro de enchimento 10 mm, 0,55 mm	Tecnologias
Vidro de cobertura 12mm, espessura	#1Thermo Scientific/VWR	631-0713
Gel de remoção de ouvido (veet)			para pele sensível
Pomada
Cloridrato			0,05 mg/kg
Unidade			de anestesia O2/Unidade de inalação de isoflurano com câmara e seringa de insulina de tubo + cone
0,5ml x 12,7mm 29g, verde	BD		Agulhas 324824
23G 1 1/4"	Agulhas 4657640
25G 5/8"	Suturas	Braun 4657853
silkan 0.7	Porcas 1134019
	Jeveka	934 A2 1
Parafusos	Jeveka	84 A2 1 10
0.9% NaCl
Microscópio + software			O espaço entre a mesa e a objetiva precisa ser amplo o suficiente para segurar o animal
Plataforma aquecida com temperatura controlada	Feito pela Costum
Suporte para janela	Costum feito
tetrametilrodamina 2.000.000 MW dextrano	Invitrogen	D7139	100 µ g/mouse
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextrano	Invitrogen	D22914	100 µ g/mouse
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	25 µ g/mouse
Nanopartículas			ref 5
Microscópio multifotônico LEICA TCS SP5	Leica
LAS AF Software	Leica