Ordenação temporal de Expressão Dynamic Data de expressão espacial mapas detalhados

Summary

O relógio de segmentação impulsiona a expressão gênica oscilatória através do mesoderma pré-somítico (PSM). A atividade de entalhe dinâmico é a chave para esse processo. Usamos imagens e análises computacionais para extrair a dinâmica temporal dos dados de expressão espacial para demonstrar que a expressão do ligante Delta e do receptor Notch oscila no PSM de vertebrados.

Abstract

Durante a somitogênese, pares de somitos epiteliais se formam de maneira progressiva, brotando da extremidade anterior do mesoderma pré-somítico (PSM) com uma periodicidade estrita específica da espécie. A periodicidade do processo é regulada por um oscilador molecular, conhecido como "relógio de segmentação", atuando nas células PSM. Este relógio aciona os padrões oscilatórios de expressão gênica através do PSM na direção póstero-anterior. Esses chamados genes do relógio são componentes-chave de três vias de sinalização: Wnt, Notch e fator de crescimento de fibroblastos (FGF). Além disso, a sinalização Notch é essencial para sincronizar as oscilações intracelulares nas células vizinhas. Recentemente, obtivemos uma visão de como isso pode ser mecanicamente regulado. Após a ativação do ligante, o receptor Notch é clivado, liberando o domínio intracelular (NICD), que se move para o núcleo e regula a expressão gênica. O NICD é altamente lábil e sua rotatividade dependente da fosforilação atua para restringir a sinalização Notch. O perfil de produção (e degradação) de NICD no PSM é conhecido por ser oscilatório e semelhante ao de um gene de relógio. Recentemente, relatamos que tanto o receptor Notch quanto o ligante Delta, que medeiam o acoplamento intercelular, exibem expressão dinâmica nos níveis de mRNA e proteína. Neste artigo, descrevemos os métodos de detecção sensível e as ferramentas detalhadas de análise de imagem que usamos, em combinação com a modelagem computacional que projetamos, para extrair e sobrepor dados de expressão de pontos distintos no ciclo de expressão. Isso nos permitiu construir uma imagem espaço-temporal do perfil de expressão dinâmica para os genes do receptor, do ligante e do relógio alvo Notch ao longo de um ciclo de oscilação. Aqui, descrevemos os protocolos usados para gerar e cultivar os explantes de PSM, bem como o procedimento de coloração para o mRNA ou proteína. Também explicamos como as imagens confocais foram posteriormente analisadas e ordenadas temporalmente computacionalmente para gerar sequências ordenadas de instantâneos de expressão de relógio, doravante definidos como "quimógrafos", para a visualização da expressão espaço-temporal de Delta-like1 (Dll1) e Notch1 em todo o PSM.

Introduction

Somitos são os primeiros segmentos formados no eixo do corpo em alongamento no desenvolvimento de espécies de vertebrados e são os precursores da coluna vertebral, costelas, e derme do tecido, bem como das células endoteliais e do músculo. Durante somitogenesis, somites epiteliais formam a partir da mesoderme unsegmented presomitic (PSM) (revisto em referência 1). Este processo é regulado pelo "relógio da segmentação", que consiste de uma rede de genes oscilatórias e proteínas, na maior parte pertencente à via de sinalização Notch. O relógio da segmentação consiste em vários loops de feedback negativo, que permitem a produção pulsátil da atividade Notch dentro de uma única célula ² (revisto em Referências 3-6). Enquanto o método intracelular de oscilação está bem caracterizada, é ainda em grande parte desconhecida como estas oscilações são coordenados através do tecido de PSM. Foi recentemente mostrado, através de ambos os estudos experimentais e teóricas, que estas oscilações são essênciaL para o processo de somitogénese e que a via de Notch desempenha um papel crucial no processo de segmentação e tanto a expressão do gene de oscilação ^{7, 8.} No entanto, tem sido amplamente divulgado que o receptor Notch 1 (Notch1) e do ligando Delta-like (DLL) -1 tem gradientes estáticos no PSM ^{9, 10, 11.}

Nossa hipótese é que oscilações dependentes de Notch do relógio PSM segmentação depende da ativação periódica do principal receptor via Notch e ligando, Notch1 e DLL1, respectivamente, em todo o PSM mouse. As conclusões de estudos anteriores que relataram um gradiente rostral-caudal estática destas proteínas eram devidos, prevemos, a uma falta de sensibilidade em técnicas de imunocoloração. Eles eram, portanto, incapaz de detectar flutuações de baixo nível de DLL1 e Notch1 no PSM caudal.

Nós temose desenvolveu um método para examinar mais de perto esses fatores, combinando dados experimentais com modelos matemáticos para prever um mecanismo pelo qual as oscilações das proteínas de componentes do relógio são coordenados através do PSM ^12.

O objetivo geral deste método consiste em detectar e quantificar de baixo nível, a expressão da proteína dinâmica do PSM e para mapear os perfis de proteínas de interesse de expressão de acordo com a expressão do gene do relógio conhecido, franja Lunatic (Lfng). Uma vez que um ciclo do relógio da segmentação no embrião de rato leva 2 h para completar, várias amostras são necessários para construir um perfil de espaço-temporais da expressão da proteína completa e DLL1 Notch1 durante uma oscilação Lfng no PSM. portanto, nós desenvolvemos este protocolo para permitir a detecção de alto rendimento de expressão de proteína de baixo nível no todo-mount, explantes PSM contralateral. No entanto, esta técnica pode também ser útil para estudos tchapéu visam caracterizar dinâmica de proteínas de baixo nível dentro de qualquer tecido embrionário que pode ser dividido em metades contralaterais.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados no âmbito do projecto número de licença 6004219 em estrita observância às Animais (procedimentos científicos) Act de 1986 e os códigos UK Home Office de Boas Práticas para o uso de animais em procedimentos científicos.

1. PSM Explant Dissection

1. Obter o tecido da cauda a partir de embriões produzidos pelo acoplamento temporizada do tipo selvagem (CD1) ¹³ ratinhos. Resumidamente, no dia embrionário (E) 10,5, eutanásia do camundongo doador grávida em uma câmara de dióxido de carbono. Colher o corno uterino e colocá-lo em solução de 1X solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS), em conformidade com os procedimentos de licença Home Office ou regras locais equivalentes. Transferir o corno uterino a um prato de cultura de tecidos contendo fresco, PBS estéril. Execute todas as etapas de dissecção subsequentes nesta solução.
2. Sob um microscópio estereoscópico, cortar a membrana muscular grossa do corno uterino utilizando tesoura curva e extrair cada embrião com cuidado usando uma pinça fina. Cuidarpara garantir que o tecido da cauda não é danificado durante este processo. Usando tesoura curva e uma pinça fina, dissecar afastado o saco amniótico de cada embrião, tomando cuidado para não danificar o embrião.
3. Use uma agulha cirúrgica ou tesoura curva para colher o tecido da cauda de cada embrião, cortando a posterior embrião para os brotos dos membros traseiros.
4. Equilibrar o tecido da cauda ventral do lado para baixo, usando ambos os fórceps e uma agulha. Gerar pares de explantes PSM de cada cauda embrionária dissecando o tecido da cauda em duas metades ao longo da linha média; executar um movimento de balanço suave com uma agulha. Certifique-se de que o tubo, notocorda, e tecido neural PSM são divididos igualmente entre os dois explantes.
5. Pipetar cada explante PSM contralateral sobre o lado inferior de uma tampa de placa de cultura de plástico de 35 mm em um pequeno volume de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura (DMEM-F12 + 0,1% de L-glutamina substituto suplementado com soro de vitelo fetal a 10% , 10 nM de bFGF humano, e 1% de penicilina / estreptomicina).
6. Colocar a cápsula no topo da tampa e rapidamente invertê-lo de modo que o tecido de PSM é suspenso a partir da tampa em uma "gota em suspensão" de meio. Cultura os explantes PSM numa câmara humidificada a 37 ° C durante 1 - 2 h.
7. pares de transferência de explantes PSM aos poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Incubar em paraformaldeído a 4% em PBS durante 1 h à temperatura ambiente (TA) ou a 4 ° C durante a noite (O / N). CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico, e devem ser tomadas medidas de segurança adequadas ao trabalhar com esta solução.
   NOTA: Executar todas as etapas de lavagem e posterior incubação em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.
8. Lavar os poços de amostras em PBS à temperatura ambiente numa plataforma oscilante, usando uma pipeta de Pasteur de plástico fino para trocar a solução de PBS nas amostras de PBS fresco de 3 - 4 vezes. Processar um explante de PSM de cada par usando imuno-histoquímica (passo 2) e o outro utilizando hibridização in situ fluorescente por um gene conhecido de relógio (rEP 3).

2. A imuno-histoquímica de explantes PSM

1. Lavar um explante de PSM de cada par embrionário gerado no passo 1 em 2% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente numa plataforma de agitação, e em seguida enxaguar as amostras brevemente em PBS. Substituir o PBS nas amostras com solução de bloqueio (albumina de 2% de soro de bovino (BSA) e soro de cabra normal a 10% (NGS) em PBS + 0,1% de Tween-20) e incubar O / N a 4 ° C numa plataforma oscilante.
   NOTA: Todas as lavagens subsequentes e as etapas de incubação desta seção devem ser realizados à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço, salvo indicação contrária. soluções de lavagem pode ser facilmente alterado através de um plástico ou de vidro Pasteur pipeta de ponta fina.
2. Dilui-se o anticorpo / anticorpos primários desejadas em tampão de trabalho (0,1% de BSA, 0,3% NGS, e 0,2% de Triton X-100 em PBS). Neste exemplo, os anticorpos diluir 1:25 DLL1 Notch1 e em tampão de trabalho.
   NOTA: Optimization serão necessários para determinar o fator de diluição adequada exigida nos this etapa se anticorpos alternativos são usados.
3. Incubar em explantes a solução de anticorpo durante 3 - 5 dias, a 4 ° C numa plataforma oscilante. Certifique-se de incluir algumas amostras com tampão de trabalho que não contém o anticorpo primário para atuar como controles de anticorpos secundários.
4. Recuperar a solução de anticorpo primário em um tubo de armazenamento de 1,5 ml usando uma pipeta e armazená-lo a 4 ° C.
   NOTA: Recuperado anticorpo primário pode ser utilizado várias vezes, dependendo do anticorpo usado.
5. Realizar 2 lavagens de amostras de 5 - 10 minutos cada em PBS, seguido de 3 lavagens de 10 minutos cada em 2% de Triton X-100 em PBS a RT numa plataforma oscilante.
6. Diluir anticorpo / anticorpos secundários marcados com fluorescência (epitopo-combinado com o anticorpo primário / anticorpos utilizados) em tampão de trabalho. Opcionalmente, adiciona-se 20 ug / ml Hoechst 33342 a esta solução para contracoloração os núcleos.
   NOTA: Optimização podem ser necessários para determinar o factor de diluição adequado necessário neste passo. Neste example, um factor de diluição de 1: 400 foi tipicamente utilizado.
7. Centrifugar a solução de anticorpo secundário durante 10 min a 16 xg para evitar a formação de agregados de anticorpos. Adicionar 250 - 500 ul da solução de anticorpo secundário em cada poço de amostra, tendo o cuidado de não usar os últimos poucos microlitros da solução, que pode conter agregados de anticorpos.
8. Cobrir a placa com folha de estanho amostra para minimizar a exposição à luz e incubar as amostras na solução de anticorpo secundário durante 3 - 5 dias a 4 ° C no escuro.
9. Antes da amostra de montagem, lavar as amostras duas vezes durante 10 minutos cada, em 0,1% de Tween-20 em PBS (PBST) e uma vez durante 5 min em PBS, à TA numa plataforma oscilante (ver passo 4).

3. fluorescente hibridação in situ (FISH) de PSM explantes

1. Se armazenado num vaso alternativa, transferir os explantes restantes PSM contralaterais aos poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.
2. Lavam-se as amostras para10 min em etanol a 50% em PBST, e, em seguida, executar 2 lavagens de 10 minutos cada em etanol a 100% numa plataforma de agitação à TA a desidratar o tecido.
   NOTA: Todas as lavagens subsequentes e as etapas de incubação desta seção devem ser realizados à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço, salvo indicação contrária.
3. Re-hidratar o tecido por lavagem durante 10 min em etanol a 50% em PBST, seguindo-se lavagem duas vezes durante 5 min cada em PBST.
   NOTA: Os passos 3.2 e 3.3 são passos de fixação necessários para este protocolo e não pode ser omitida.
4. Incubar as amostras com 10 ug / ml de proteinase K em 0,1% de Tween-20 em PBS (PBST) durante 5 minutos, sem agitação. remover rapidamente a proteinase K e lavar as amostras brevemente com PBST antes de pós-fixação do tecido durante 30 minutos em formaldeído 4% + 0,1% de glutaraldeído em PBST. ATENÇÃO: Tanto o formaldeído e glutaraldeído são tóxicos e devem ser tomadas medidas de segurança adequadas quando se trabalha com estas soluções.
   NOTA: A lavagem seguintee envolvendo os passos de incubação de 50% e 100% misturas de hibridação (passos 3,6-3,9) deve ser realizada sem agitação.
5. Após lavagem das amostras duas vezes durante 10 minutos cada em PBST, lavar as amostras de uma vez em 50% de mistura de hibridação (adequado para sondas intrónicas: 50% de formamida, 5x citrato de salina de sódio (SSC), 5 mM de EDTA, 50 ug / ml de ARNt, 0,2% de Tween-20, 0,1% de SDS, e 100 ug / mL de heparina) em PBST preparado à TA. Incubar as amostras nesta solução durante 10 min a 65 ° C sem agitação.
6. Lavar as amostras duas vezes com (65 ° C) mistura de hibridação pré-aquecido antes da incubação das amostras na mistura de hibridação de @ 2 h (até 48 h) a 65 ° C (tempos de incubação mais longos melhorar o contraste de sinal-para-ruído resultante) . Retirar a mistura de hibridação a partir do passo anterior, e substituí-la com 0,25-0,5 mL de pré-aquecido (65 ° C) uma mistura de hibridação contendo digoxigenina (DIG) marcado com sonda de RNA anti-sentido contra um componente de relógio da segmentação conhecido.
   NÃOE: Por exemplo, uma franja excêntrica intrónica (Lfng (i)) sonda foi utilizada a uma concentração de 20 uL / mL para detectar ARNm Lfng nascente. A diluição utilizado neste passo é dependente da sonda e irá requerer optimização.
7. Selar a placa usando fita adesiva para evitar a evaporação e incubar as amostras na solução de sonda para duas noites a 65 ° C.
8. Usando uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina, recuperar a sonda para a reutilização e armazená-lo em 20 ° C. Lavar as amostras duas vezes com pré-aquecido (65 ° C) mistura pós-hibridação (formamida a 50%, 0,2% de Tween-20, e 1x SSC) antes da lavagem das amostras mais duas vezes durante 20 minutos cada, a 65 ° C em pré- aquecido mix pós-hibridação.
9. Lavam-se as amostras durante 15 min a 65 ° C na mistura de hibridação pré-aquecida até 50% em 0,1% de Tween-20 em solução salina tamponada com Tris (TBST). Lavar as amostras duas vezes com TBST antes da lavagem durante 30 min à temperatura ambiente em TBST numa plataforma oscilante.
10. Pré-incubar os explantes em blosolução cking (TBST + 2% de reagente de bloqueio tampão (BBR) + soro de cabra tratado termicamente de 20%) por um período mínimo de 2 h. Substituir esta solução com solução de bloqueio fresco contendo uma diluição 1: 200 de peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo anti-digoxigenina. Incubar as amostras o / n a 4 ° C.
11. Após a incubação do anticorpo, lavar as amostras 3 vezes com TBST, à TA e transferi-los para poços individuais de uma nova placa de 24 poços de cultura de tecidos. Lavar os explantes com TBST 3 vezes durante 1 hora cada.
12. Neste ponto, transferir as amostras para tubos de 0,5 mL de armazenagem ou a poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços para reduzir o volume requerido de os reagentes de detecção de amplificação de sinal Tyramide (TSA) nos seguintes passos.
13. Incubar as amostras em tampão de amplificação de TSA (ver a lista de reagentes) à temperatura ambiente durante 1 min sem agitação utilizando como pequeno volume possível, assegurando que as amostras são totalmente imerso na solução.
14. Adiciona-se reagente TSA (ver alista de reagentes) para o tampão de amostra de amplificação, a uma diluição de 1:50. misturar rapidamente a solução até que o reagente de TSA está uniformemente distribuída, cobrir a placa de tubos ou em folha de alumínio, e incubar as amostras durante 60 - 90 min no escuro.
15. Remover a solução de amplificação TSA e lavar as amostras em TBST 3 vezes durante 5 minutos cada. Transferir os explantes de volta para uma placa de cultura de tecidos de 24 poços para aumentar o volume de lavagem e incubar as amostras em peróxido de hidrogénio a 1% em TBST durante 1 h. Lavam-se as amostras com TBST 3 vezes durante 5 min cada, e depois duas vezes durante 5 min cada com PBST antes da amostra de montagem (ver passo 4).

4. Preparação de Amostras for Imaging

1. Prepare uma corrediça adesão de vidro carregada para cada par de explante através da adição de 0,12 mm de espessura espaçadores de imagem, que impedem que as amostras de ser esmagado pela adição de uma lamela. Remover o revestimento adesivo de uma superfície de um espaçador e colocá-lo adesiva virada para baixo sobre uma lâmina de vidro, pressionando firmly para selar o espaçador para a corrediça.
   NOTA: Para as etapas restantes, se esforçar para manter as amostras em condições de pouca luz ou na escuridão para evitar a fotodegradação. Pipeta pares de explantes numa lâmina preparada utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro dentro do centro do espaçador, garantindo que o lado dissecado do explante está virado para a corrediça. Organizar pares contralateral do lado explantes a lado.
2. Remover o máximo de líquido possível a partir do slide usando uma pipeta Pasteur de vidro e pavio fora qualquer umidade residual em torno das amostras utilizando um pedaço de papel de seda low-lint dobrado.
3. Permitir que as amostras para aderir à lâmina de 45 - 60 s, até que o tecido começa a aparecer pegajosa e translúcida. Durante este tempo, remover o revestimento adesivo remanescente do espaçador usando uma pinça. Não permita que as amostras a secar.
4. Adicionar uma grande gota de montagem de dupla função e solução de limpeza (0,5% de p-fenilenodiamina e Tris 20 mM, pH 8,8, em 90% de glicerol) para as amostras dentro do centrodo espaçador. NOTA: Esta solução fica marrom / preta quando permitido para oxidar.
5. Com cuidado, coloque uma lamela circular (no. 1.5) através das amostras, assegurando que a montagem é distribuído uniformemente e que todas as bordas da lamela fazer contato com o espaçador. Coloque o slide escorregou-cover de cabeça para baixo em algum papel de tecido low-lint.
6. Pressionar firmemente para assegurar que a lamela adere totalmente ao espaçador e que qualquer excesso é removido para montagem. Repita até que não há manchas mais compostos para montagem do papel.
7. Limpo e rotular o slide (s) de forma adequada, e armazená-los no escuro até de imagem, a curto prazo a -20 ° C ou a longo prazo a -80 ° C. Depois de remover os slides de armazenamento, permitir-lhes para descongelar completamente antes de imagem.
8. Imagem as amostras montadas usando um microscópio confocal com a aquisição de azulejos e uma objectiva grande ampliação. Imagem dos pares de explantes usando uma objectiva de imersão em óleo de 40X em Z-intervalos de 4 ^ m usando 488 nm, 568 nm e 647 nm li a lasernes para excitar os verdes, vermelhas, e far-vermelhos fluoróforos, respectivamente, utilizados para proteínas e detecção de mRNA neste estudo ^12.
   NOTA: Telhado imagens foram costurados pós-aquisição para formar uma imagem única para análise.

5. Pós-aquisição Análise de Imagem

1. Use software de análise de imagem para definir uma região de interesse dentro do PSM de cada amostra experimental.
   1. Para quantificar os níveis de expressão, de fundo e de subtracção de imagens de limiar para o nível de uma amostra de controlo não-primária antes da quantificação subsequente. Definir uma origem, um eixo, e uma unidade de comprimento para cada amostra.
2. Calcula-se a intensidade de fluorescência como uma função da posição ao longo do eixo rostro-caudal normalizado para cada uma das amostras M ^12. Depois de normalizar as parcelas de intensidade, colocar lado a lado por perfis de intensidade e se obter uma matriz de intensidade f (i, j), que descreve a intensidade no i ^{j th amostra.}

6. ordenação temporal de Amostras

1. Para inferir ordenação temporal de um componente do relógio conhecido, definir a sua matriz de intensidade. Em seguida, reorganizar as colunas da matriz de intensidade, de modo a obter um padrão periódico temporalmente. Para fazer isso, definir a função
   
   em que A (f _j; k) representa a função de autocorrelação de ^ordem j a coluna de f e uma _t é uma função de autocorrelação alvo, escolhida para aplicar a periodicidade temporal do padrão, dada pela
   
2. Utilizar a Metropolis-Hastings (ou outro algoritmo de minimização) ¹² para identificar a ordem das amostras que minimizam a função g. Assim, determinar a ordem daM amostras que maximiza a periodicidade temporal de uma componente de relógio conhecido.
3. Usando a ordenação temporal inferida das amostras M, construir um quimógrafo encomendados para o padrão de expressão no canal partnered ^12.

Results

Este protocolo permite a visualização do perfil de espaço-temporal de uma proteína de interesse juntamente com a transcrição do gene de PSM relógio no rato ^12. Por exemplo, DLL1 (Figura 1A-C) e de Notch1 expressão da proteína (Figura 1D-F) são mostrados a oscilar para fora de sincronia com a transcrição do gene nascente relógio da segmentação regulada-Notch Lfng. Quantificação de DLL1, Notch1 e Lfng (I) a intensidade de sinal em relação ao eixo ântero-posterior (AP) do PSM (Figura 1G) revela claras dinâmica oscilatórios de expressão para estes alvos (Figura 1H-J). O perfil espaço-temporal da expressão da proteína DLL1 e Notch1 durante todo o ciclo de clock são claramente visualizada e quantificada utilizando este protocolo através da análise de imagens de pós-aquisição de alta resolução de dados de imagem de tecidos fixos.

Figura 1: Visualização espaço-temporal e Quantificação de DLL1 e Notch1 expressão da proteína Dynamics. (AF) a partir de explantes de pares de seis embriões E10.5 (AF), mostrando a distribuição espacial da proteína DLL1 (AC) ou proteína de Notch1 (DF), em uma metade ao lado da detecção de ARNm de pré-Lfng (Lfng (i)) nos metade contralateral de cada par correspondente. Os painéis estão dispostos de acordo com a Fase 1 (A e D), Fase 2 (B e E), e Fase 3 (C e F) do ciclo de relógio da segmentação, conforme determinado pelo perfil espacial da Lfng (i) expressão. A extensão dos domínios de expressão para DLL1 (verde), Notch1 (vermelho), e Lfng (i) (cinzento) ao longo do eixo ântero-posterior do PSM b têmeen demarcada por barras com código de cores. As linhas a tracejado as posições de demarcar a somito mais recentemente formada (s), as bordas exteriores do PSM, e o tecido neural adjacente (C e E). Barras de escala (canto inferior esquerdo de cada painel, AF) representam 100 mm. (G) Um exemplo trama intensidade que descreve a variação axial na intensidade do sinal entre o PSM. Os dados são representados graficamente a partir de dois pares de explantes que mostram Lfng pré-ARNm (linha hash preto) em um explante em comparação com a proteína de Notch1 (vermelho) no explante contralateral (embrião 1), bem como Lfng pré-ARNm (linha preta sólida) em outra explante em relação à proteína DLL1 (verde) no explante contralateral (Embryo 2). intensidade de sinal medida (eixo dos y) é representada graficamente contra a posição axial (eixo dos x; PSM anterior [A] para a direita e posterior PSM [P] para a esquerda). (H) Um quimógrafo que mostra a distribuição espacial da DLL1, Notch1 e Lfng (i) atravésnumerosos PSMs. Cada linha da quimógrafo representa a intensidade do sinal de um explante de PSM indivíduo. As linhas são dispostos em seqüência temporal de acordo com a distribuição espaço-temporal de Lfng pré-mRNA (I) A distribuição espaço-temporal de DLL1, Notch1, e Lfng (i) através de várias oscilações do relógio é simulada pela extensão periódica dos dados mostrados na (H) , destacando a natureza oscilatório dos DLL1 e Notch1 dinâmica de expressão. A expressão da proteína (J) pulsátil Notch1 no PSM caudal é realçada pela ampliação da região demarcada no quimógrafo virtual mostrado em (I). Modificado de Referência 12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Quantificação dos dinâmica espaço-temporal de DLL1 e Notch1 expressão da proteína. (A) Um gráfico de exemplo intensidade descreve a variação axial na intensidade do sinal em todo o PSM. Os dados representados graficamente a partir de dois pares de explantes mostrando Lfng pré-ARNm (linha hash preto) em um explante em comparação com a proteína de Notch1 (vermelho) na metade explante contralateral, bem como Lfng pré-ARNm (linha preta sólida) em um meio de explante a partir de uma segunda cauda em comparação com a proteína DLL1 (verde) na metade explante contralateral da segunda cauda. intensidades medidas (eixo y) em função da posição axial (eixo dos x; rostral [A] para a direita e caudal [P] para a esquerda). (BH) Kymographs mostram a distribuição espacial de Notch1, DLL1, NICD e Lfng (i) através de inúmeras PSMs. (B e C) NICD (B) e DLL1 (C) expressão em secções PSM; (D e E) Lfng (i) (D) e DLL1 ( E) ao meio de explantes contralateral; (F e G) Lfng (i) (F) e de Notch1 (L) em duas metades de explantes contralaterais. A partir de Referência 12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Passos críticos dentro do Protocolo

O presente protocolo descreve um método sensível para realizar a análise quantitativa da expressão de proteínas e oscilatórios dinâmica de baixo nível em explantes E10.5 rato PSM. Um protocolo robusto tanto para imuno-histoquímica e hibridação in situ fluorescente (FISH) é seguido pelo de alta resolução de toda a montagem de imagem confocal, e em seguida por análise de imagem e segmentação temporal da kymographs para gerar um mapa espaço-temporais da expressão de proteínas em todo o PSM. A alta relação sinal-ruído na detecção de proteínas e mRNA é essencial para garantir o sucesso desta técnica. Deve ser tomado cuidado para trocar completamente todas as soluções de forma eficaz durante os passos de lavagem e para manter a temperatura das lavagens de 65 ° C nas fases importantes do passo 3. É mais vantajoso tomar o tempo a fonte de anticorpos eficazes e sondas de ARN contra a alvos de interesse e testar estes reagentesexaustivamente em amostras inteiras de montagem antes de iniciar este protocolo.

Modificações e resolução de problemas

As principais questões que podem ser encontrados durante a execução deste protocolo surgir de má qualidade e resistência de detecção de sinal. Esta é em grande parte dependente da eficácia dos anticorpos ou sondas de RNA utilizados para os passos de imunohistoquímica ou pescar no protocolo, respectivamente. Um número de diferentes passos podem requerer optimização antes da detecção de sinal adequada é obtida. Uma causa comum para detecção de sinal fraco é a fixação imprópria; é imperativo que seja fresco PFA ou PFA armazenado a 4 ° C durante não mais de uma semana é usado para corrigir as amostras. O comprimento de fixação podem também requerer optimização, dependendo da sonda de anticorpo ou ARN utilizado. Para anticorpos, é aconselhável seguir as instruções do fabricante, sempre que possível, enquanto que para sondas de RNA, aconselhamos a consulta da literatura publicada.

Neste estudo, foi utilizada uma sonda de RNA que detecta especificamente o pré-mRNA do gene do relógio Lfng. Devido à sua relativa falta de abundância, a detecção de ARNm de pré-Lfng requer um longo período de incubação com a sonda na mistura de hibridação contendo citrato de sódio salino-5x (SSC) para a detecção de sinal bom. As mesmas condições podem ser aplicadas a outras sondas que detectam mRNAs fracamente expressas, mas em nossa experiência, a detecção de alvos de mRNA mais estáveis pode exigir um passo mais curto hibridização da sonda e menores concentrações SSC na mistura de hibridação (por exemplo, 1,3x SSC). Para tanto imuno-histoquímica e peixe, o protocolo deve primeiro ser optimizados em todo o embrião, e a concentração óptima de anticorpo ou sonda deve ser determinada empiricamente.

Limitações da técnica

Como mencionado acima, o sucesso desta técnica é altamente dependente da qualidade da proteína e detecção de ARNm. We ter descrito várias sugestões quanto à forma como proteínas e detecção de ARNm pode ser melhorada, mas na ausência de detecção do sinal fluorescente de alta qualidade, não há nenhuma maneira a experiência pode prosseguir. O número de proteínas alvo que podem ser analisadas em cada amostra de tecido é limitado pela resolução espectral de microscópio confocal e por os epitopos dos anticorpos utilizados. Neste estudo, nós fomos capazes de utilizar até três epítopos para a detecção de proteínas ao lado de uma mancha de DNA em cada amostra ^12. Este protocolo só permite a detecção de um alvo de mRNA, embora métodos alternativos atuais podem ser utilizados para aumentar para até três alvos ^14.

Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos

O método descrito aqui fornece uma técnica sensível para detectar variações de proteína de baixo nível em explantes de todo-mount PSM. A quantificação destas dinâmicas épossível através da realização de FISH para um gene do relógio conhecido em explantes contralaterais correspondente. Uma biblioteca de kymographs é gerado que pode ser organizada ao longo de um ciclo de relógio da segmentação, destacando a dinâmica espaço-temporais de expressão de um alvo de interesse dentro deste prazo. Uma diferença fundamental nesta técnica sobre os outros é o uso de automação computacional de ordenar temporalmente grandes conjuntos de dados, o que permite a dinâmica de expressão espaço-temporais de novos componentes de clock para ser analisados ​​de forma imparcial. Por exemplo, esta técnica proporcionou uma visão sobre como as proteínas DLL1 e Notch1 e suas oscilações são co-regulados em todo o PSM. Métodos alternativos, neste contexto, também têm invocado imunocoloração, mas eles não detectar as pequenas flutuações nos níveis de proteína DLL1 e Notch1 no PSM caudal que eram evidentes utilizando este método. Em vez disso, eles relataram um gradiente constante de expressão que é mais forte na região rostral ^{9 , 10, 11. Isto pode ser devido ao facto de este protocolo tem um período de incubação mais longas anticorpo primário (3 - 5 dias, em oposição ao dia para o outro), o que pode ser requerido para detectar os níveis baixos de proteína. Como os níveis de DLL1 e expressão Notch1 são relativamente elevados no PSM rostral, isso pode ter influenciado os autores a imagem das amostras a uma menor exposição a criação do que seria necessário para detectar a expressão da proteína caudal. Uma outra diferença potencial surge da utilização de tecido não fixadas em estudo por Chapman et ai. , Em que a expressão transitória de DLL1 Notch1 e no caudal de PSM pode ter sido menos bem preservada 9.}

Aplicações futuras ou chegar após dominar a técnica

Uma vez que este protocolo foi dominada, a análise da expressão de elevado rendimento pode ser realizada por qualquer proteína de interesse no PSM.explantes PSM gerados a partir de várias ninhadas de ratinho podem ser processadas ao mesmo tempo para gerar o número elevado de amostras necessário para análise. Embora apenas se usaram embriões de tipo selvagem nestes estudos, é possível realizar esta análise utilizando embriões geneticamente modificados a fim de avaliar a importância de um ou mais fatores na dinâmica expressão da proteína. Além do PSM, este protocolo pode ser adaptado a outros sistemas que são constituídos por duas metades contralaterais e podem ser utilizados para detectar sensibilidade Protein Expression and oscilatórias dinâmicas de baixo nível. Um exemplo para os quais este protocolo poderia ser adaptado é o estudo da expressão da proteína dinâmica no tubo neural de rato, uma vez que as metades contralaterais poderia ser gerado e cultivadas, e a actividade Notch tem sido mostrado para ser ambos presentes e importante para padronização ^15. Nós encorajamos outros grupos para se adaptar este protocolo para outros sistemas e para fornecer feedback para melhorias futuras.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-F12	Gibco (ThermoFisher Scientific)	11320033
GlutaMAX™-1 (100x)	Gibco (ThermoFisher Scientific)	35050
Soro Fetal Bovino, qualificado, aprovado pela UE, origem da América do Sul	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10270106
Humano Recombinante FGF-básico (154 a.a.)	Peprotech	100-18B
Penicilina / Estreptomicina	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140122
anticorpo monoclonal Notch1 anti-camundongo ^	BD Pharmingen	552466
anticorpo policlonal Dll1 anti-rato ^ *	N / A	N / A
< em>Lfng< / em> sonda de RNA anti-sentido intrônica ^ *	N / A	N / A
16% paraformaldeído	Pierce (ThermoFischer Scientific)	PI28908
Proteinase K, recombinante, grau PCR	Roche (Sigma-Aldrich)	31158
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7.4	Feito em casa	N/A
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
Soro de cabra normal (NGS) (tratado termicamente)	Gibco (ThermoFisher Scientific)	16210072
Hoechst 33342	ThermoFischer Scientific	H3570
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Etanol	Sigma-Aldrich	46139
Glutaraldeído	Sigma-Aldrich	340855
Formamida	Sigma-Aldrich	F9037
Citrato de sódio salino (SSC)	Sigma-Aldrich	93017
EDTA	Sigma-Aldrich	798681
tRNA	Roche (Sigma-Aldrich)	101095
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149
Solução salina tamponada com Tris (TBS)	Fabricado em casa	N/A
Reagente de Bloqueio de Tampão	Roche (Sigma-Aldrich)	11096176001
anticorpo conjugado anti-DIG peroxidase de rábano (HRP)	Roche (Sigma-Aldrich)	11207733910
Kit de amplificação de sinal de tiramida (TSA)	Perkin Elmer	NEL744001KT
*O anticorpo Dll1 e a sonda de RNA usados neste estudo não estão disponíveis comercialmente. Por favor, veja os agradecimentos das fontes.
^Anticorpos / sondas de RNA devem ser fornecidos de forma aplicável aos interesses de pesquisa do leitor.