Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto Drosophila Brains

Resumo

O adulto de Drosophila cérebro é um sistema valioso para estudar circuitos neuronais, funções cerebrais superiores, e doenças complexas. Um método eficiente para dissecar tecido do cérebro inteiro do cabeça pequena mosca facilitará estudos baseados em cerebrais. Aqui nós descrevemos um de uma etapa simples protocolo, dissecação de cérebros adultos com morfologia bem preservada.

Resumo

Há um interesse crescente na utilização de Drosophila para modelar doenças degenerativas do cérebro humano, mapa circuitos neuronais em cérebros adultos, e estudar a base molecular e celular de funções cerebrais superiores. A preparação de toda a montagem dos cérebros adultos com morfologia bem preservado é fundamental para tais estudos baseadas no cérebro inteiro, mas pode ser tecnicamente desafiadora e demorada. Este protocolo descreve uma abordagem dissecção um passo fácil de aprender, de uma cabeça de mosca adulta em menos de 10 s, ao mesmo tempo manter o cérebro intacto ligado ao resto do corpo para facilitar os passos de processamento subsequentes. O procedimento ajuda a remover a maior parte dos tecidos do olho e da traqueia, normalmente associadas com o cérebro que pode interferir com a imagiologia passo posterior, e também reduz a procura da qualidade do fórceps de dissecação. Além disso, descreve-se um método simples que permite a inversão conveniente das amostras de cérebro montados sobre uma lamela, o que é importante para imagiologia de ambos os lados da bchuvas com intensidade de sinal semelhante e qualidade. Como um exemplo do protocolo, apresentamos uma análise de neurônios dopaminérgicos (DA) em cérebros adultos de WT (w ¹¹¹⁸⁾ voa. A elevada eficácia do método de dissecação torna-o particularmente útil para estudos baseados no cérebro adulto em larga escala em Drosophila.

Introdução

O organismo modelo Drosophila, vulgarmente conhecida como a mosca da fruta, tem sido valorizado por suas ferramentas genéticas elegantes, tempos reprodutivos curtos e altamente conservadas vias moleculares e celulares. A mosca da fruta tem sido empregue com sucesso para dissecar as vias de sinalização de base, os mecanismos de padronização de organismos multicelulares, bem como os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento neuronal, funções e doenças ^1,2. Com os recentes avanços em tecnologias de rotulagem de células e de imagem, o cérebro da mosca de fruta tornou-se especialmente poderosa in fine mapeamento dos circuitos neuronais e em dissecar a base molecular e celular das funções superiores do cérebro, tais como a aprendizagem ea memória, e ritmo circadiano ^{1,3, 4,5,6,7,8.}

Uma vantagem particular do sistema de Drosophila é o seu tamanho relativamente pequeno, permitindo que toda a montagem de preparação e análise do cérebro utilizando um composto regular ou microscópio confocal. This recurso permite análises detalhadas anatômicas e funcionais de circuitos neuronais, ou mesmo um único neurônio, em níveis celulares e subcelulares, no contexto de um tecido do cérebro inteiro, proporcionando assim uma visão holística do assunto estudado e sua geometria exata dentro do todo cérebro. No entanto, dado o tamanho diminuto em vez do cérebro, ela também apresenta um desafio técnico em dissecar de forma eficiente um tecido cerebral intacta fora do caso cabeça exoesqueleto de proteção em uma mosca adulta. Vários métodos de dissecação eficaz e relativamente simples têm sido descritos em pormenor, que geralmente envolvem cuidadosa e passo a passo de remoção do processo cabeça e os tecidos associados, incluindo os olhos, a traqueia, e gordura do cérebro correcta ^{9, 10.} Estes métodos de dissecação microcirúrgicos muitas vezes colocam exigências bastante rigorosas sobre a qualidade do fórceps de dissecação, contando com uma pinça com pontas bem alinhadas finos que podem ser facilmente danificados. Além disso, como os cérebros dissecados são muitas vezes separated do resto do corpo, o cérebro pode ser facilmente perdido durante os processos de coloração e lavagem subsequente, devido às suas pequenas dimensões e a sua transparência no tampão de processamento. Aqui, descrevemos um protocolo de dissecção de uma etapa relativamente simples e fácil de aprender, por cérebros adultos que mantém os cérebros dissecados anexados ao tronco. O processo de dissecção muitas vezes facilmente afasta a maioria dos tecidos associada ao cérebro, tais como o olho e traquéia e reduz a demanda por uma pinça de dissecação de boa qualidade.

Além disso, quando imagiologia do cérebro, ao microscópio composto fluorescente ou microscópio confocal, o lado do cérebro que está distante da fonte de luz fluorescente, muitas vezes produz um sinal mais fraco e menos imagens claras devido à espessura do cérebro inteiro de montagem. Aqui, nós também descrevem um método de montagem simples que permite um fácil inversão das amostras de cérebro, permitindo imagiologia conveniente de ambos os lados do cérebro com intensificação de sinal semelhantety e qualidade.

Como uma prova de conceito para a aplicação do presente método para estudar o cérebro adulto, examinámos ainda mais a presença de neurónios DA no cérebro de moscas W ^1118; um genótipo que é frequentemente utilizado como a linha parental para a geração de moscas transgénicas e o controlo de tipo selvagem, em muitos estudos de Drosophila.

Protocolo

1. soluções utilizadas para Brain Dissecção e imunofluorescência Coloração

1. Dissecar a mosca adulta cérebros em fluido cerebrospinal artificial (aCSF): NaCl 119 mM, 26,2 mM de _NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1 mM de NaH ₂ PO _4, 1,3 mM de MgCl _2, e 10 mM de glucose. Antes da utilização, o gás aCSF com 5% de CO _2/95% de O ₂ por 10 - 15 min e pico com 2,5 mM de _CaCl2. Esterilizar a solução por filtração através de aCSF de um filtro de membrana de 0,22 um.
   Nota: loja aCSF a 4 ° C para evitar a contaminação bacteriana. cérebros voo também pode ser dissecado em uma solução de fosfato tamponado salino (PBS), embora as comparações detalhadas dos efeitos das duas soluções de dissecação sobre a qualidade da imagem final dos cérebros dissecados não ter sido realizada.
2. Use paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS 1x preparada como a solução fixadora, que é normalmente dividido em alíquotas e armazenado a -20 ° C.
   caution: PFA é tóxico e corrosivo e deve ser manuseado com cuidado.
3. Use 1x PBS para lavar o PFA a partir de cérebros e depois da última etapa de lavagem, durante a coloração de imunofluorescência dos cérebros dissecados. Prepara-se o PBS 1x de PBS 10x solução de estoque (1,37 M de NaCl, KCl 27 mM, 100 mM de Na ₂ HPO _4, e 18 mM de KH ₂ PO _4).
4. Use Tween-20 a 0,3% em 1x PBS (1x PBT) para todos os passos de lavagem subsequentes durante a coloração de imunofluorescência dos cérebros dissecados.

2. microcirúrgica Dissection de Chefes mosca adulta

Nota: O procedimento de dissecção é ilustrado na Figura 1.

1. Anestesiar as moscas adultas com CO _2. Utilizando uma pinça, pegar uma mosca e brevemente dewax sua cutícula por imersão em etanol 70% para 3 - 5 s. Isso garante que não há bolhas aderem à cutícula mosca quando imerso na aCSF ou solução de dissecção 1X PBS.
2. Debaixo demicroscópio de dissecação com uma fonte de luz com um ângulo que não será bloqueado pelas mãos, definir a lente objectiva para obter uma vista clara da mosca (1,2X de ampliação). Use uma pinça com a mão não dominante para imobilizar o animal e mergulhe a mosca na solução de dissecção fria com seu abdômen virado para cima, como mostrado na Figura 1A.
3. Manter a pinça de cada 160 - 170 ° ângulo com respeito à placa de dissecação, enquanto exerce uma pequena força para o abdómen da mosca (ilustrados como setas na Figura 1A). Esta etapa irá imobilizar a mosca e forçá-lo a mover a cabeça para trás, até 15 de - 25 ° ao estender a tromba para cima. No processo, uma região macio e translúcido da cutícula, por baixo da tromba, deve tornar-se aparente. Aumentar a ampliação e ajustar o plano focal para esta região.
   Nota: Não segure a pinça com muita força, mas sim apenas o suficiente firme para estabilizaro voo. Demasiada força fará com que os órgãos dentro de ruptura para a solução.
4. Use a mão dominante para pressionar as pinças de dissecação de modo que suas pontas são fechadas, o que gerará uma força resistente leve nas pontas da pinça, de modo que a pinça vai saltar quando a pressão da mão de retenção é liberado. Posicionar a pinça perpendicularmente para a pinça que prende a mosca, como mostrado na Figura 1B.
   1. Pierce as pontas fechadas dos fórceps de dissecção através da região macio e translúcido da cutícula por baixo da tromba, como ilustrado pela seta vermelha na Figura 1B. É importante para não penetrar a pinça muito profundamente que ele toca o cérebro. O cérebro adequada deve tornar-se visível. Manter um aperto estável da mosca com a mão não-dominante.
5. Rapidamente, mas de forma constante, solte as pontas das pinças de dissecação por sua própria força e contar com o impulso a partir desta liberação para arrancar tele exoesqueleto em torno da cabeça da mosca. Um cérebro intacto adequado deve tornar-se visível (o tecido branco imediatamente acima da ponta da pinça inferior na Figura 1C) Siga uma linha imaginária para orientar a dinâmica das dicas fórceps liberados (ilustrado como as setas vermelhas para fora mostrado na Figura 1C). Isto irá remover suavemente o exoesqueleto e na maioria das ocular associada ao cérebro e traqueia do cérebro. A temporização adequada e força aplicada para abrir o exoesqueleto será dependente da experiência do investigador.
   Nota: Este é o passo mais crítico durante a dissecção. É importante contar com a força natural gerada a partir do movimento das pinças de abertura para remover o exosqueleto, deixando o cérebro exposta permanece ligado ao resto do corpo.
6. Use a pinça na mão dominante para remover cuidadosamente os tecidos acessórios remanescentes, como o traqueal que aparece como estruturas de fibras brancas remaining ligado ao cérebro. Tenha cuidado para não puxar ou danificar o cérebro adequada.

3. imunofluorescência coloração dos Brains

1. Fixar as amostras de cérebro dissecado com seus torsos associados em aproximadamente 1 mL de PFA 4% para 40 - 60 min.
   Nota: Para esta e as subsequentes etapas, manter os tubos ou placas com amostras em um nutator para misturar adequadamente as amostras na solução.
2. Enxágüe com 1 mL de 1x PBS pipetando a solução cima e para baixo 3 vezes. Tenha cuidado para não aspirar o cérebro de distância.
3. Lavar 5 vezes com 1x PBT durante 5 min cada. Manter as amostras no nutator durante a incubação.
4. Incubar com anticorpos primários na diluição adequada O / N a 4 ° C.
5. No dia seguinte, remove os anticorpos primários, e lava-se as amostras 5 vezes com 1x PBT. Deixar as amostras durante 5 - 10 min na solução 1x PBT entre cada lavagem. Manter as amostras no nutator durante a incubação.
6. Incubar a lavadaamostras em anticorpos secundários apropriados com a diluição e tempo de incubação sugeridas.
7. Lavam-se as amostras de seis vezes com 1x de PBT com uma incubação de 10 min entre cada lavagem.
   Este passo é crítico para a remoção de anticorpos secundários ligados de forma não específica a partir da amostra.
8. Incubar numa diluição de 1: 10000 de 1 mg / ml de 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em solução PBT 1x durante 30 min. DAPI é um corante de ADN que se liga às regiões AT de DNA e pode ser usado para revelar a morfologia global do cérebro.
9. Lavar três vezes com PBS 1x.
10. amostras de transferência para um prato de dissecação, e separar os cérebros dos corpos em um prato dissecção usando uma pinça.
11. Após os passos de lavagem e de coloração, montar os cérebros em entre duas lamelas e colocar as lamelas sobre uma corrediça de montagem. Deste modo, as amostras de tecido cerebral pode ser facilmente invertida de modo que ambos os lados do cérebro pode ser trabalhada com um sinal de intensidade semelhante.
    Nota: Montagem do cérebro sobre a lamela em vez de directamente sobre a lâmina de montagem permite a inversão da orientação do exemplo livremente. O processo de montagem é explicado em mais detalhe abaixo.
    1. Coloque uma lamela de 18 x 18 mm na parte superior de uma corrediça de montagem. Alargar a abertura de uma ponta de pipeta com uma lâmina e usá-lo para transferir o cérebro em solução de PBS 1x para a lamela de 18 x 18 mm.
    2. Colocar os cérebros no meio da lamela, remover o líquido em torno dos cérebros com uma ponta de pipeta fina, e em seguida, adicionar outro 20 - 40? L de meio de montagem anti-desvanecimento (0,2% (w v) de n-propil galato / em 99,5 % de glicerol, grau ACS) ao longo dos cérebros.
       Nota: A quantidade de meio de montagem adicionada depende do número de cérebros examinados.
    3. Delicadamente espalhar os miolos, enquanto deslocando o meio de montagem viscosa para fora. Colocar uma segunda lamela de 18 x 18 mm em cima dos cérebros baixando a corrediça a partir de um lado até que fique em contacto coma superfície de deslizamento de montagem, e em seguida, baixando lentamente o outro lado para minimizar o contacto do cérebro com bolhas de ar.
       Nota: Não há nenhuma necessidade de usar um espaçador entre as duas lamelas de cobertura, como o volume do meio de montagem e os cérebros deve proporcionar um espaço suficiente para separar as duas lamelas.
    4. Permitir que os slides para se estabelecer. Remover o líquido excessivo que saem dos lados dos talões com um tecido de laboratório.
    5. Para evitar que as lamelas com os cérebros montados de cair fora do slide de montagem durante o transporte, use um pequeno pedaço de fita para prender as lamelas para o slide de montagem.
       Nota: Os cérebros montado entre as lâminas podem ser visualizados de imediato ou conservadas a 4 ° C durante até uma semana sem perda significativa de sinal de fluorescência, sem a necessidade de utilizar qualquer selante para selar as lâminas. Para a conservação a longo prazo dos cérebros manchado, do lado das duas folhas pode ser selado Wom unha polonês e armazenados em um freezer -20 ° C, embora cérebros manchadas pode perder os seus sinais ao longo do tempo. Isto não é recomendado.
12. Use um microscópio composto fluorescente apropriado ou microscópio confocal para a imagem do cérebro.
    1. Em primeiro lugar, obter a imagem a partir do lado do cérebro mais próximo do objectivo, e em seguida virar cuidadosamente as lamelas de ter as amostras ensanduichada no meio. Este passo facilita a aquisição da imagem do outro lado do mesmo cérebro.
    2. Use um microscópio vertical composto fluorescente e uma lente objetiva de 20X para a imagem da totalidade do cérebro (exemplos na Figura 2) e uma objetiva de 40X a imagem menores regiões do cérebro, tais como neurónios DA na região do cluster do Emparelhados Anterior Medial (PAM) (exemplos na Figura 3).

Resultados

A Figura 1 ilustra os principais procedimentos de dissecação cérebro adulto, como descrito acima As Figuras 2 e 3 são imagens representativas de três dias de idade WT. (Genotipo: W ¹¹¹⁸⁾ mosca adulta cérebros que foram costained com um anticorpo contra a tirosina hidroxilase (TH , colorido a vermelho na Figura 2 e branco na Figura 3), um marcador comumente usado para rotular neurónios...

Discussão

Com um interesse crescente no uso adulto Drosophila cerebral para estudar doenças humanas cérebro, circuitos neuronais e as funções cerebrais superiores, é necessário o desenvolvimento de métodos simples e rápidos para obter cérebros da mosca intactas para as análises todo-mount, que é especialmente importante para grande- dimensionar telas baseadas no cérebro. Nosso método fornece uma maneira simples e fácil de aprender abordagem para dissecar uma cabeça mosca (muitas vezes em menos de 10 s com experiência) co...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
w*;   parqueΔ 21/TM3,  P{GAL4-Kr.C}DC2,  P{UAS-GFP. S65T}DC10,  Sb1	Bloomington Drosophila Stock Center	51652	O balanceador foi trocado para TM6B
PBac{WH}parkf01950	Exelixis na Harvard Medical School	f01950	O balanceador foi trocado para TM6C
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-003-990
Cloreto de Potássio (KCl)	Fisher Scientific	BP366-500
Fosfato de sódio, monobásico monohidratado (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-004-198
Cloreto de Magnésio (MgCl2)	Fisher Scientific	02-003-265
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G	Substitui glicose
Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
EMD Millipore  Filtros de Membrana PVDF Durapore: Hidrofílico: 0.22 µ m Tamanho dos poros	de formalina GVWP14250		Fisher
Scientific, 10% (histológico)	Fisher Scientific	SF98-20
Fosfato de potássio, dibásico, pó, biorreagente ultrapuro	Fisher Scientific	02-003-823
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Excelta Pinças de Precisão com Pontas Muito Finas	Fisher Scientific	17-456-055	O protocolo não requer pontos muito finos.
Anticorpo anti-tirosina hidroxilase	Pel-Freez Biologicals	P40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav	Os estudos de desenvolvimento Hybridoma Bank	Clone 7E8A10
Goat anti-Rat IgG (H + L) Anticorpo secundário, Alexa Fluor 647 conjugado	ThermoFisher Scientific	A-21247
Goat anti-Rabbit IgG (H + L) Anticorpo secundário, Alexa Fluor 594 conjugado	ThermoFisher Solução Scientific	A-11037
DAPI (1 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	62248
Pó de galato de propil	Sigma-Aldrich	P3130-100G
Reagente de glicerol ACS, ≥ 99,5%	Sigma-Aldrich	G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1	Zeiss	Citação
Zeiss Apotome.2	Zeiss	Citação
Zen lite software		Citação