Quantificação dos Quinase bacteriana Histidina Autofosforilação utilizando um ensaio de ligação de nitrocelulose

Resumo

Relatamos e demonstramos um ensaio otimizado de ligação à nitrocelulose que pode ser usado para quantificar a autofosforilação de histidina quinases bacterianas purificadas. Nosso método tem várias vantagens sobre as técnicas tradicionais baseadas em SDS-PAGE, fornecendo uma alternativa valiosa para caracterizar essas importantes proteínas.

Resumo

Demonstramos um método útil para quantificar a autofosforilação de histidina quinases bacterianas purificadas. As histidinas quinases são conhecidas por seu envolvimento na transdução de sinal de dois componentes, um sistema onipresente através do qual as bactérias sentem e respondem a estímulos ambientais. A sinalização de dois componentes apresenta a autofosforilação de uma histidina quinase, seguida de fosfotransferência para o domínio receptor de uma proteína reguladora de resposta, o que leva a uma resposta de saída. A autofosforilação da histidina quinase responde à presença de um estímulo ambiental cognato, dando assim às bactérias um meio de detectar e responder a mudanças no ambiente. Apesar de sua importância na biologia bacteriana, as histidinas quinases permanecem pouco compreendidas devido à labilidade inerente da fosfohistidina. Os métodos convencionais para estudar essas proteínas, como a autorradiografia SDS-PAGE, apresentam deficiências significativas. Desenvolvemos um ensaio de ligação à nitrocelulose que pode ser usado para caracterizar histidina quinases. O protocolo para este ensaio é simples e fácil de executar. Nosso método é de maior rendimento, menos demorado e oferece uma faixa dinâmica maior do que a autorradiografia SDS-PAGE.

Introdução

A resposta adaptativa é crucial para a sobrevivência das bactérias. A fim de detectar e responder a alterações ambientais, as bactérias utilizam um sistema de estimulo-resposta conhecido como sinalização de dois componentes. ^1,2 Em um sistema de dois componentes típica, a histidina quinase detecta um estímulo cognato, autophosphorylates seu resíduo histidina conservada, em seguida, transfere fosfato para um resíduo aspartato conservado no domínio receptor de uma proteína reguladora da resposta. ³ Este evento provoca uma alteração na actividade do regulador de resposta, que estimula um efeito a jusante. ^4,5 Assim, as bactérias são capazes de detectar e adaptar-se a mudanças no meio ambiente local. Alguns sistemas de sinalização de dois componentes afastem deste arquétipo. Em alguns casos, o domínio sensorial da histidina-quinase é uma proteína autónoma, que detecta directamente a entrada sensorial e modifica a actividade de cinase através de uma interacção proteína-proteína. ^6-8 No entanto, o fundoamental processo e o papel global do sistema continua a ser a mesma. sinalização de dois componentes é um sistema de estímulo e resposta ubíquo que é essencial para a sobrevivência das bactérias, e histidina-cinases desempenham um papel crucial na transdução do sinal. ⁹

Apesar da importância das cinases de histidina a biologia bacteriana, permanecem pouco caracterizados. Isto é devido à instabilidade inerente do fosfo-histidina, e a falta de um método prático para medir a autofosforilação. Fosfo-histidina é mais lábil do que o fosfo-serina, fosfotreonina, fosfotirosina e. ¹⁰ Assim, as técnicas que são comumente usados para analisar quinases Ser / Tre / Tir não são aplicáveis para cinases histidina. ¹¹ Os ensaios in vitro para estudar histidina-cinases têm sido largamente limitado a auto-radiograf ia de SDS-PAGE. ^12,13 Neste método, [γ- ³² P] -ATP é incubada com a quinase e fosforilação da cinase é analisada por Polelectroforese em gel de yacrylamide (PAGE) seguido por autorradiografia do gel. Este método pode ser utilizado para monitorizar a autofosforilação da quinase, bem como phosphotransfer da quinase a um regulador de resposta. No entanto, este método possui limitações notáveis. ensaios à base de página são baixo rendimento e demorado. Essas limitações não são conducentes a caracterização de uma proteína e determinar seus parâmetros cinéticos. Um método alternativo para o estudo de quinases de histidina que foi publicada recentemente utiliza anticorpos fosfo-histidina para detectar a autofosforilação. ¹⁴ Enquanto este método tem a vantagem de distinguir entre 1-fosfo-histidina e 3-fosfo-histidina, de acordo com a instrumentação utilizada para a detecção, este método não podem oferecer uma grande gama dinâmica alta ou limite superior de detecção. Assim, existe uma necessidade para um ensaio mais rápido e menos trabalhoso, e mais sensíveis que podem ser utilizados para estudar estas proteínas importantes.

Aqui, descrevemos e demonstrate um ensaio de ligação de nitrocelulose cuidadosamente desenvolvidas que podem ser usadas para quantificar a autofosforilação de histidina-cinases de bacterianas purificadas in vitro. Este ensaio é um maior rendimento e menos demorada do que ensaios baseados em PRINCIPAL. O método também utiliza radiação Cherenkov para quantificação fosfo-histidina, que proporciona um elevado limite superior de detecção e um grande alcance dinâmico. O ensaio pode ser usado para determinar os parâmetros cinéticos para a histidina-cinases.

Protocolo

Atenção: Este protocolo requer formação adequada na utilização e manuseamento de materiais radioativos. Por favor use o equipamento de protecção individual necessários ao realizar este ensaio, incluindo proteção contra radiações beta. Os resíduos radioactivos devem ser manuseados com cuidado, como grandes volumes de resíduos gerados durante a fase de lavagem do experimento. Garantir que os resíduos são armazenados em um recipiente na posição vertical, como um grande balde ou garrafa que não será facilmente derrubado ou derramado. Uma vez que o experimento é concluído, transferir cuidadosamente todos os resíduos líquidos para convenientemente marcados contentores de resíduos radioativos. Lidar com todos os materiais com cuidado, e manter um contador Geiger nas proximidades para monitorar o espaço de trabalho para a contaminação.

NOTA: Este protocolo é uma versão revisada de um ensaio relatado anteriormente pelo nosso grupo. ¹⁵ estabilidade fosfo-histidina em H ₃ PO ₄ deve ser testada por qualquer histidina quinase descaracterizada antes de usar este método. A fosfo stteste de capacidade foi descrito anteriormente. ¹⁵ Um controlo negativo que não contém quinase deve ser incluída. Isto é necessário de modo a subtrair o sinal de fundo a partir de cada amostra, e assegurar que [γ- ³² P] -ATP é suficientemente lavado da membrana.

1. Preparação dos Reagentes e Materiais

1. Purifica-se quinases de histidina a partir da cultura bacteriana antes de usar este ensaio.
   1. Purifica-se uma cinase de histidina (ID gene 1.189.383) a partir de Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802), para o desenvolvimento deste ensaio. Clone da quinase no vector de expressão pET-23aHis-TEV usando Ndel e os locais de restrição Xhol, e realizar a mutagénese dirigida ao local para produzir o mutante D499A construir Vp1876.
   2. Transformar o plasmídeo em E. coli BL21 (DE3) pLysS, e as células crescer em meio de TB a 37 ° C. culturas suplementadas com ampicilina (100 ug / ml) e cloranfenicol (34? g / mL), e crescem com agitação(250 rpm) para um OD ₆₀₀ de 0,6.
   3. Induzem a expressão de proteínas com IPTG a uma concentração final de 25 uM, e crescer culturas durante a noite a 16 ° C. Células colheita por centrifugação (5000 xg), lise por sonicação, e centrifugação para remover os detritos celulares (18000 xg).
   4. Purifica-se o quinase marcada com His usando agarose Ni-NTA. Confirmar a pureza por SDS-PAGE. Otimizar purificação para cada proteína, e confirmar a pureza antes de usar este ensaio.
2. Prepare o mM H solução de lavagem 25 ₃ PO _4. Para 1 l de água desionizada destilada, adicionar H ₃ PO ₄ a uma concentração final de 25 mM. O pH desta solução é de cerca de 2,0. Coloque 25 mM H ₃ PO ₄ no gelo.
3. Prepara-se uma solução 13x estoque de 325 mM _de H ₃ PO _4, para ser usado para extinguir reacção da quinase. O pH desta solução é de cerca de 1,5. Coloque 325 mM H ₃ PO ₄ no gelo.
   NOTA: H ₃ PO ₄ A uma concentração final de 25 mM sacia suficientemente a reacção, e também ajuda a bloquear o fosfato marcado radioactivamente que não se liga aos histidina de se ligar à membrana de nitrocelulose.
4. Prepara-se uma solução de reserva de tampão de reacção 4x contendo Tris-HCl 160 pH 8,0, KCl 600 mM, MgCl ₂ 16, e 40% de glicerol.
5. Quantificar concentração histidina cinase de proteína por meio de métodos estabelecidos de concentração (Bradford, UV-Vis, etc.). ^16,17 Prepara-se uma solução de histidina quinase com uma concentração que é 4 vezes a concentração final desejada. Para obter o sinal adequado, a concentração de proteína final na reacção deve idealmente ser de pelo menos 5 um.
6. Prepara-se uma radiomarcado 4x [γ- ³² P] -ATP solução com a concentração de 4x ATP não marcado apropriado de e marcado: não marcado razão para o experimento.
   NOTA: A quantidade de [γ- ³² P] -ATP que deve ser incluído nesta mistura é dependente de quanto [^7; - ³² P] -ATP acabará por ser manchado para cada reação. Obtivemos sinal adequada com concentrações finais variando entre 0,1-5 uCi por reacção. É importante que o marcado: não marcado razão ATP ser mantido constante para todas as reacções de uma dada experiência. diluições em série deve ser feita quando várias concentrações de ATP são desejados, pois isso também manter o marcado: não marcado constante relação de ATP em todas as concentrações. As concentrações finais de ATP variam tipicamente de 10 uM a pelo menos 1 mm, e cada concentração deve ser ensaiada em triplicado para obter dados cinéticos de confiança.
7. 96- Aparelho bem dot blot
   1. Corte de 8 cm x 12 centímetros pedaço de membrana de nitrocelulose (tamanho de poro de 0,2 um).
   2. Posição de nitrocelulose num aparelho de dot blot, assegurar que a membrana se ajusta de tal modo que o aparelho está fechado, e todas as cavidades ficam completamente cobertas pela membrana. Se montado corretamente, não deve haver fugas de ar quando o vácuo é applIED.
   3. Para recolher filtrado, conectar o aparelho a um frasco de braço lateral secundária. A partir da haste da válvula, ligar a tubagem adequada de tal modo que o aparelho pode ser usado confortavelmente sem bascular o balão secundário.
   4. Ligar o balão lateral-braço secundário a fonte de aspiração / aspiração.
   5. Testar o aparelho que é completamente selado por aplicação de vácuo ao aparelho. Se o aparelho está correctamente montada, um vácuo forte irá estar presente em todos os poços. Todas as conexões de tubos podem ser embrulhados em Parafilm ou Saran Wrap para garantir um selo apertado.
   6. Opcionalmente, para testar a vácuo, pipeta de 100 uL de tampão de reacção para um poço. O vácuo deve ser forte o suficiente para extrair todo o líquido através do poço e para a membrana.
   7. Desligue vácuo até que todas as amostras estão prontas para serem vistos na membrana.

2. Reação Iniciação e Têmpera

1. A mistura de componentes reaccionais
   1. Antes de initição, preparar todos os quatro componentes da reação como soluções de 4x: tampão de reação (ver secção 1.4), histidina quinase (1,5), [γ- ³² P] ATP (1,6), e DDH ₂ O.
   2. Mistura de volumes iguais de tampão de reacção, histidina quinase, e ddH ₂ O. Permitir que estes componentes de reacção para equilibrar à temperatura ambiente durante um curto espaço de tempo (10 min).
      NOTA: O volume final da reacção é dependente do facto de a experiência é, dependente da enzima, ou do tipo de substrato dependente do tempo. reacções dependentes do tempo deve ser maior, como alíquotas múltiplas são tomadas a partir da mesma reacção e extinguiu-se no ponto de tempo desejado. O volume de reacção vai depender do número de pontos de tempo desejados. O ensaio é optimizada para cada ponto sobre a membrana de nitrocelulose para conter 30 ul da reacção. Assim, se os pontos de tempo 10 são desejada, o volume de reacção deve ser de pelo menos 300 mL (um volume mais alto, tais como 330 uL seria preferível no caso de eventuais erros de pipetagem).A enzima e dependente de experiências de substrato necessitam de volumes de reacção pequenos. O volume de reacção para estas experiências podem ser tão pequenos como 30 uL, como este é o volume final, que será visto na membrana de nitrocelulose.
   3. Para iniciar a reacção, adicionar um volume de solução de [γ- ³² P] -ATP para a reacção e misturar por pipetagem para cima e para baixo. Controlar o tempo decorrido reacção com um temporizador e deixar a reacção prosseguir durante o tempo desejado.
   4. Para interromper a reacção, adicionar 1/13 do volume de reacção total de gelado mM H ₃ PO ₄ 325 à reacção e misturar por pipetagem para cima e para baixo. Alternativamente, adiciona-se uma alíquota da reacção para 325 mM H ₃ PO _4.
      NOTA: A concentração final de H ₃ PO ₄ deve ser de 25 mM a quench suficientemente a reacção. Por exemplo, adicionar 2,5 mL 325 mM H ₃ PO ₄ a 30 reação? L, ou adicionar 30 mL de reação para 2,5 mL mM H ₃ PO 325 4. O pH final da reacção é de cerca de 4,0. Esta concentração de H ₃ PO ₄ foi testado e confirmado para extinguir a reacção de cinase neste tampão sem degradar fosfo-histidina.
      1. Por exemplo, misturar 7,5 mL de tampão de reacção 4x, 7,5 ul 4x histidina quinase, e 7,5 mL ddH ₂ O. iniciar a reacção com 7,5 mL γ- ^[32 P] -ATP. Extingue-se a reacção com 2,5 mL de 325 mM _de H ₃ PO _4.
   5. Coloque imediatamente reações extintas no gelo até que todas as reacções foram terminadas.
      NOTA: Para maximizar a eficiência, é aconselhável para iniciar uma reacção a cada 15 ou 20 S, até que todas as reacções são iniciadas, e uma vez que o tempo de reacção desejado tenha passado, desactivar uma reacção a cada 15 ou 20 s até que todos estejam extinta. Para aqueles que são utilizando o ensaio pela primeira vez, um intervalo mais longo pode ser mais controlável.

3. Spotting oAs reacções f extinta de nitrocelulose

1. Iniciar em vácuo 96 bem aparelho de dot blot
   1. Colocar o aparelho de ponto de 96 poços pré-montados blot (secção 1.7) num recipiente secundário. Este recipiente deve ser suficientemente grande para que o aparelho seja facilmente desmontada, quando o aparelho e membrana será radioactiva após o uso.
   2. Aplicar vácuo para o aparelho de dot blot de 96 poços.
   3. Uma vez que o aparelho é sob vácuo, pipetar cuidadosamente a reacção extinguiu-se directamente sobre a membrana de nitrocelulose em cada poço. Repetir até que todas as reacções são carregados na membrana. Uma vez que a capacidade de ligação de nitrocelulose (75-110? G / cm ²⁾ é maior do que a quantidade de histidina quinase que é manchado, pode presumir-se que quase toda a quinase se liga à membrana quando carregadas correctamente.
      NOTA: Dependendo do aparelho utilizado, é preciso ter cuidado para não perfurar a nitrocelulose. Observa-se que toda a reacção fez contacto com the nitrocelulose. É fácil para alguns ou a totalidade da reacção para aderir às paredes do poço, e não atingem a nitrocelulose.
   4. Lavar os poços com 100 ul de gelo frio de 25 mM H ₃ PO _4. Isto irá permitir que qualquer volume de reacção que possa ter ficado preso no poço para atingir a membrana, assegurando o carregamento total de todas as reacções. Permitir que a totalidade do volume de fluxo através da membrana.
2. Aparelho de transferência de desmontagem e membrana de nitrocelulose
   1. Cuidadosamente desmontar o aparelho antes de desligar o vácuo. Ser avisados ​​de que tanto o aparelho de membrana de nitrocelulose e são radioactivos neste momento. Não remover quaisquer componentes do dispositivo a partir do recipiente secundário neste momento.
   2. Com uma pinça, transferir cuidadosamente a membrana de nitrocelulose a partir do aparelho para um recipiente de aproximadamente 200 ml de 25 mM arrefecido com gelo _de H ₃ PO _4. Coloque uma tampa sobre este contêiner, como a lavagem será radioactive. Nesta altura, o vácuo pode ser desligada.

4. Nitrocellulose Processing

1. lavagem de nitrocelulose
   1. Colocar o recipiente com a membrana de lavagem em um balancim. Permitir que a membrana para agitar suavemente durante 20 min.
   2. Após 20 min, decanta-se cuidadosamente a solução de lavagem utilizada num balde grande para ser usado para o armazenamento temporário dos resíduos. Adicionar 200 mL de gelo frio de 25 mM H ₃ PO ₄ para a membrana e de repetição.
      NOTA: Pelo menos três lavagens de 20 min são necessárias para remover o fundo [γ- ³² P] -ATP sinal a partir da membrana. Após a terceira lavagem, testar a solução de lavagem utilizado para a radiação com um contador Geiger. Continuar a lavagem da membrana, tal como descrito acima até que nenhum sinal está presente na solução de lavagem.
2. secagem de nitrocelulose
   1. Depois a membrana é suficientemente lavada, permitir que a membrana secar ao ar com brevidade. Isso normalmente leva 5 minutos ou menos.

5. A exposição a tela de armazenamento de fósforo

Nota: Esta seção é opcional. A exposição da membrana a um rastreio de fósforo é benéfico na medida em que permite a visualização da intensidade da cinase marcado radioactivamente em cada ponto sobre a membrana. A intensidade relativa destes pontos é directamente proporcional à quantidade de histidina quinase fosforilada em cada local. A intensidade pode ser quantificada com o software de processamento de imagem, e estes resultados podem ser comparados com os gerados a partir da secção 7. Além disso, este passo permite um controlo de qualidade. Anormalidades observadas neste digitalização pode explicar os resultados irregulares obtidos a partir de contagem de cintilação.

1. preparação tela de fósforo
   1. Antes de expor a membrana a ecrã de fósforo de armazenamento, expor a tela de fósforo a luz branca durante pelo menos 5 min. Isso garante que qualquer imagem residual que poderá ser mantido pela tela é apagada.
   2. Verifique se a tela é limpae seco. Se necessário, limpe cuidadosamente a tela com uma solução de limpeza tela de fósforo aprovado pelo fabricante da tela, e seque.
2. preparação de membrana de nitrocelulose
   1. Cuidadosamente enrole a membrana de nitrocelulose seco em um envoltório de plástico fino para evitar a umidade residual de danificar a tela de fósforo. Certifique-se de que não há rugas ou bolhas.
3. A exposição a tela de fósforo
   1. Colocar a membrana de nitrocelulose enrolada na cassete ecrã de fósforo de armazenamento, colocar a tela de face voltada para baixo sobre a membrana, e fechar a gaveta. Não abra a gaveta ou mover a membrana até que seja tempo de varredura de tela de fósforo, como deslocamento de membrana durante a exposição fará com que uma imagem dupla ou manchada a ser capturada.
   2. Expor durante pelo menos 4 h, ou, desde que o fabricante sugere tela de fósforo.
   3. Uma vez que a exposição é completada, digitalização tela de fósforo e capturar a imagem com um scanner de fósforo.

6. Preparando Nitrocellulose membrana para contagem de cintilação

1. Ponceau S a coloração e descoloração
   1. Resumidamente mergulhar a membrana de nitrocelulose em solução de coloração de Ponceau S (0,1% de Ponceau S (w / v) em 5% de ácido acético) para 1-2 min. Molhar toda a membrana com o corante antes da descoloração.
   2. Decantar o excesso de Ponceau S a partir da membrana.
   3. Lavar a membrana com _ddH2O até que apenas os pontos da histidina quinase estão manchadas. Note-se que este procedimento só funcionará se todos os pontos contêm quantidades detectáveis ​​de proteína.
      NOTA: Este passo é necessário para confirmar que a quinase está ligado à nitrocelulose, e que a carga de proteína é mesmo em todas as manchas. Também permite que a quinase manchado seja facilmente retirado por corte da membrana.
2. Cortar pontos
   1. Com uma tesoura, cortar cada ponto na membrana de nitrocelulose. Não é necessário cortar perfeitamente Along a borda da mancha corada; Se a membrana foi lavada suficientemente, de fundo devido ao tamanho variável de manchas cortadas será negligenciável. É importante apenas para cortar todo o local para cada reação.
   2. Utilizando uma pinça, transferir cuidadosamente cada ponto em frascos de cintilação. Não é necessário uma mistura de cintilação, como o ³² P é prontamente detectável por radiação Cherenkov.
      NOTA: Como alternativa, o local pode ser cortado utilizando um furador de cortiça afiada. Remover cada ponto da nitrocelulose com o furador de cortiça, e empurrá-lo para um frasco de cintilação com um alfinete. Com este método, a membrana não precisa de ser tocado, minimizando ainda mais a exposição à radiação.
3. Determinando CPM / pmol de [γ- ³² P] -ATP solução
   1. Spot várias diluições de [γ- ³² P] -ATP solução (seção 1.5) para 1 cm x 1 cm quadrados de nitrocelulose. Resumidamente ar seco.
   2. Utilizando uma pinça, transferir cuidadosamente cada quadrado em cintilaçãofrascos. Não é necessário uma mistura de cintilação. Estas amostras serão usadas para gerar uma curva padrão para determinar o CPM / pmol de ATP a solução.

Contando 7. Cintilação

1. Coloque todos os frascos de cintilação em cassetes de contador de cintilação. cassetes de carga em contador de cintilação.
2. Executar programa de contagem de cintilação para medir CPM para cada frasco. Estes dados, juntamente com o CPM / pmol da mistura de ATP marcado radioactivamente (de secção 6.3), pode ser utilizado para calcular a quantidade de histidina quinase fosforilada presente em cada ponto, e assim a taxa de autofosforilação. ^18,19

Resultados

Um conjunto de dados representativo foi gerado com uma imagem captada com uma câmara de fósforo (Figura 1), Ponceau S a mancha da membrana de nitrocelulose (Figura 2), e os dados de contagem de cintilação (Figura 3). A Figura 3A mostra as constantes cinéticas das enzimas em uma trama de Lineweaver-Burk. Estes resultados foram obtidos utilizando uma histidina quinase purificada a partir da espécies de bactérias gram-negat...

Discussão

O ensaio de ligação de nitrocelulose temos descrito tem muitas vantagens sobre os métodos anteriormente utilizados para caracterizar quinases histidina. Em comparação com SDS / autorradiografia tradicional à base de PAGE, o nosso método é maior rendimento e menos demorado. A membrana de nitrocelulose é mais fácil de manusear do que geles de SDS, e não precisa de ser fixo. Ponceau manchando a nitrocelulose permite que os pontos de proteínas a ser visualizado. Isso fornece uma maneira fácil de cortar cada local para conta...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido fosfórico	VWR	AAAA18067-AP	Para reacções de têmpera e lavagem de nitrocelulose
Base Tris RPI		T60040-5000.0	Tris-HCl pH 8,0, para tampão de reacção de quinase
Cloreto de potássio	RPI	P41000-2500.0	Para tampão de reacção de quinase
Cloreto de magnésio	RPI	M24000-500.0	Para tampão
de reacção de quinaseGlicerol	RPI	G22020-4000.0	Para tampão de reação de quinase
5'-ATP	Promega	E6011	Substrato de quinase
[γ-32P]-5'-ATP	Perkin Elmer	NEG002Z250UC	6.000 Ci/mmol
Aparelho de mancha de pontos de 96 poços	Bio-rad	1706545	Para reações de detecção
Nitrocelulose	Whatman	32-10401396-PK	Para reações de detecção
Ponceau S	Sigma aldrich	P3504-50G	Para coloração de nitrocelulose