Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.
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Artigo de método
Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de neurônios combinados com o uso de agrupamento independente e imparcial análises para criar um completo levantamento das características morfológicas observadas entre uma população neuronal selectiva. Combinação destas técnicas constitui uma nova abordagem para a recolha e análise de dados neuroanatômicos. Em conjunto, estas técnicas permitem em grande escala, e, portanto, mais abrangente, a amostragem de populações neuronais selectivos e estabelecer métodos quantitativos imparciais para descrever as classes neuronais morfologicamente únicos dentro de uma população.
O protocolo descreve o uso de vírus da raiva modificado para etiquetar selectivamente neurónios. G-excluído atos de vírus da raiva como um traçador retrógrado após injecção estereotáxica em uma estrutura do cérebro alvo de interesse e serve como um veículo para a entrega e expressão de EGFP em neurônios. Um grande número de neurônios estão infectados usando estetécnica e expressar GFP ao longo de suas dendrites, produzindo "Golgi-like" preenchimentos completos de neurônios individuais. Por conseguinte, o método de rastreamento retrógrado mediada por vírus melhora nas técnicas tradicionais de rastreamento retrógrado à base de corantes, produzindo preenchimentos intracelulares completos.
Neurónios individuais bem isoladas que abrangem todas as regiões do cérebro a área sob estudo são seleccionados para a reconstrução, a fim de obter uma amostra representativa de neurónios. O protocolo descreve os procedimentos para reconstruir corpos celulares e completar padrões de arborização dendrítica de neurônios marcados abrangendo vários cortes de tecido. Os dados morfológicos, incluindo as posições de cada neurónio dentro da estrutura do cérebro, são extraídas para análise posterior. funções de programação padrão foram utilizados para realizar conjunto independente de análises e avaliações de cluster com base em métricas morfológicas. Para verificar a utilidade destas análises, a avaliação estatística de uma análise de agrupamento performada em 160 neurônios reconstruídos no núcleo reticular talâmico do tálamo (TRN) do macaco macaque foi feita. Tanto a análise de cluster original e as avaliações estatísticas realizadas aqui indicam que os neurônios TRN são separados em três subpopulações, cada um com características morfológicas únicas.
Introdução
Neuroanatomia é um dos fundamentos da neurociência 1 e interesse recente no "conectonomia" renovou o entusiasmo para a compreensão da diversidade morfológica de populações neuronais e as conexões entre os neurônios específicos 2. Métodos para a rotulagem e neurônios reconstruindo melhoraram muito com as recentes inovações, incluindo o rastreamento circuito genético e mediada por vírus aproxima 3, 4, permitindo pesquisas morfológicas mais abrangentes de populações neuronais 5. Além de melhorias na rotulagem neurônios individuais, técnicas ....
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Protocolo
Nota: O tecido examinado neste estudo foi preparado como parte de um estudo independente 5. Por isso, todos os métodos experimentais que envolvem a utilização de animais foram descritas em detalhe na secção de Métodos Experimentais de Briggs et ai. (2016). Todos os procedimentos com animais realizados como parte do estudo anterior foram aprovados pelos Comitês Animal Care e uso institucional. As etapas para a injeção de vírus no dLGN e processamento histológico de tecido cerebral são brevemente descritos abaixo nas seções 1 - 2.
1. A injeção estereotáxica
- Efectuar todos os procedimentos cirúrgic....
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Resultados
Nós mostramos anteriormente que reconstruções em larga escala de neurónios dentro de uma população selectiva é viável injecção seguinte de vírus da raiva modificado no dLGN 5. Recentemente, o mesmo tecido foi utilizada para reconstruir 160 neurónios no sector visual da TRN (Bragg et ai, na avaliação;. A Figura 2A-B) seguindo os passos metodológicos detalhados descritos acima. No estudo TRN, três conjuntos únicos de neurónios TRN foram identif.......
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Discussão
estudos neuroanatômicos mantiveram-se um dos pilares da neurociência e recente interesse em conectonomia e relações estrutura-função renovou o entusiasmo para a caracterização morfológica detalhada de populações neuronais selectivos. Tradicionalmente, os estudos neuroanatômicos têm contado com classificações qualitativas de neurônios em classes morfologicamente distintas de neurônios definidos pela neuroanatomistas especializados. Com os avanços nas técnicas de reconstrução de neurônios e extração de dados morfológicos,.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Nós gostaríamos de agradecer Drs. Ed Callaway e Marty Usrey por nos permitir usar o tecido preparado como parte de um estudo prévio e Libby Fairless e Shiyuan Liu para ajudar com reconstruções neuronais. Este trabalho foi financiado pelo NIH (NEI: EY018683) e da Fundação Whitehall.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| TRISTE & Delta; G-EGFP | E.M. Laboratório Callaway, Instituto | Preparado pelo Dr. F. Osakada. Vírus da raiva deletado por G disponível através do Salk Institute Viral Core | |
| Eletrodo de gravação: platina/irídio ou tungstênio | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visite o site (www.fh-co.com) para especificações de pedidos alternativos |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternativas: picospritzer, seringa Hamilton |
| Micrótomo de congelamento | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidina tetracloridrato, comprimido, substrato de 10 mg por comprimido. Cuidado: cancerígeno - deve ser branqueado antes de descartar |
| o Citocromo C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Anticorpo primário |
| Vetor anti-coelho de cabra biotinilado | Laboratories | #BA-1000 | Anticorpo secundário |
| Sistema Neurolucida | MicroBrightField | para rastreamento e análise de neurônios. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Software de exportação de dados | |
| Microfire Camera | verdadeiras Optronics | de 2 megapixels. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Microscópio Nikon E800 Nikon | Instruments Inc. | Microscópio de pesquisa biológica. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Software de matemática computacional baseado em matriz. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Programa de planilha | da Microsoft |
Referências
- Cajal, S. R. y Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. , Maloine. (1911).
- Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
- Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropi....
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Reimpressões e permissões
