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Artigo de método

Síntese de 1,2-Azaborines e preparação dos seus complexos de proteínas com T4 lisozima Mutantes

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DOI:

10.3791/55154

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25 de março de 2017

 , 
1Department of Chemistry, Boston College

Neste artigo

Resumo

Um protocolo para a síntese de 1,2-azaborinas e a preparação de seus complexos proteicos com mutantes de lisozima T4 é apresentado.

Resumo

Descrevemos uma síntese geral de 1,2-azaborinas usando técnicas padrão sem ar e preparação de complexo proteico com mutantes de lisozima T4 por difusão de vapor. Os compostos sensíveis ao oxigénio e à humidade são preparados e isolados sob uma atmosfera inerte (N2) utilizando um colector de gases a vácuo ou um porta-luvas. Como exemplo de síntese de azaborina , demonstramos a síntese e purificação do volátil N-H-B-etil-1,2-azabourina por uma sequência de cinco etapas envolvendo destilação e cromatografia em coluna para o isolamento de produtos. Os mutantes L99A e L99A/M102Q da lisozima T4 são expressos com a cepa RR1 de Escherichia coli. Protocolos padrão para lise de células químicas seguidas de purificação usando coluna de troca iônica carboximetil fornecem proteínas de pureza suficientemente alta para cristalização. A cristalização de proteínas é realizada em várias concentrações de precipitante em diferentes faixas de pH usando o método de difusão de vapor de gota suspensa. A preparação complexa com as pequenas moléculas é realizada pelo método de difusão de vapor sob uma atmosfera inerte. A análise de difração de raios-X do complexo cristalino fornece evidências estruturais inequívocas de interações de ligação entre o local de ligação da proteína e as 1,2-azaborinas.

Introdução

Boro-azoto contendo heterociclos (ou seja, 1,2-azaborines) têm atraído recentemente a atenção significativa como is�teros de arenes. Este isosterism pode levar a diversificação dos motivos estruturais existentes para expandir o espaço químico 2, 3, 4. Azaborines ter utilidade potencial para aplicação na investigação biomédica 5, 6, 7, 8, especialmente na área da química medicinal, em que os químicos realizar a síntese de bibliotecas de moléculas estruturalmente e funcionalmente relevantes. Significativamente, no entanto, embora existam inúmeras vias sintéticas bem desenvolvidos para moléculas contendo areno disponíveis, apenas um número limitado de métodos para a síntese de azaborines foram relatados 9, 10, 11, 12, 13. Isto é principalmente devido a um número limitado de opções para a fonte de boro e do ar e da natureza sensível à humidade da molécula na fase inicial da sequência sintética.

Na primeira parte deste artigo, iremos descrever uma síntese escala multi-grama de N -TBS- B Cl-1,2-azaborine (3) utilizando técnicas livre de ar padrão. Este composto serve como um intermediário versátil que pode ser adicionalmente funcionalizado para moléculas estruturalmente mais complexo 14, 15. A partir de 3, será descrita a síntese e purificação de N -H- B -etil-1,2-azaborine (5) para utilização em estudos de ligação de proteína. Devido à volatilidade de 5, o seu isolamento eficiente requer um controlo preciso da temperatura de reacção, tempo, e distilação condições.

Na segunda parte, os protocolos para a expressão da proteína e o isolamento de mutantes de T4 lisozima (L99A e L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 irá ser apresentada, seguido por cristalização de proteínas e preparação de complexos de cristais de proteína-ligando. Mutantes lisozima T4 e L99A L99A / M102Q foram escolhidos como sistemas modelo biológicos para examinar a capacidade de ligação de hidrogénio de moléculas contendo NH azaborine 17. Usando um protocolo padrão de biologia molecular, a proteína é expressa na estirpe Escherichia coli RR1 e induzidas com isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). purificação de proteínas é realizada utilizando cromatografia em coluna de permuta iónica. cristalização de proteínas é realizada com uma solução altamente concentrada de proteína purificado (> 95% de pureza por electroforese em gel) usando a suspensãosoltar método de difusão de vapor. Devido à sensibilidade de ligandos deste estudo a oxigénio, os complexos proteína-ligando são preparados sob condições isentas de ar.

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Protocolo

NOTA: Todas as manipulações oxigênio e sensível à humidade foram realizadas sob uma atmosfera inerte (N2), utilizando tanto técnicas livre de ar padrão ou uma caixa de luvas. THF (tetra-hidrofurano), Et2O (éter dietílico), CH 2 Cl 2 (diclorometano), tolueno, pentano e foram purificados por passagem através de uma coluna de alumina neutra, sob árgon. O acetonitrilo foi seca sobre CaH 2 (de hidreto de cálcio) e destilou-se sob atmosfera de azoto antes de ser utilizado. Pd / C (paládio sobre carbono) foi aquecida sob alto vácuo a 100 ° C durante 12 h antes da utilização. gel de sílica (230-400 mesh) foi seco durante 12 h a 180 ° C sob alto vácuo. A cromatografia flash foi realizada com este gel de sílica, sob uma atmosfera inerte. Todos os outros produtos químicos e solventes foram adquiridos e utilizados como recebidos.

NOTA: Cuidado, consulte todas as fichas de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Muitos dos produtos químicos utilizados na síntese de umre altamente tóxico e cancerígeno.

1. Preparação de 1,2-Azaborines

NOTA: Os dados de caracterização de todos os compostos deste estudo foram relatados 12, 13, 16.

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Figura 1: Esquema de síntese de 1,2-azaborines. Os protocolos detalhados para a síntese de cada composto (1-5) encontram-se descritos na secção protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Preparação de N -allyl- N -TBS- B cloreto de alil aducto (1)
    1. Numa caixa de luvas, medir 6,70 g (50,0 mmol) triallylboraNE 22 para um 24/40 L um balão de fundo redondo seco na estufa equipado com uma barra de agitação e adicionar 250 mL de diclorometano. Fecha-se o frasco com um septo de borracha. Do lado de fora da caixa, arrefece-se a solução para -78 ° C sob uma atmosfera de azoto sobre um colector de gás de vácuo.
    2. Adicionar 100 mL de solução 1,00 M de tricloreto de boro (100 mmol) em hexano à solução triallylborane a -78 ° C por meio de transferência de uma cânula. Deixe a mistura de reacção agitar a esta temperatura durante 4 h.
      NOTA: Cuidado, tricloreto de boro é altamente reativo com água.
    3. Em um balão de 100 mL separado, medir 25,7 g N - (t-butildimetilsilil) - N -allylamine (150 mmol) e adicionar 20,0 mL de diclorometano. Ao balão reaccional de 1 L, adicionar esta solução através de transferência de uma cânula mantendo a temperatura da reacção a -78 ° C.
    4. Adicionar 21,0 ml de trietilamina (150 mmol) à mistura reaccional. Manter a agitação sob um fluxo positivo de azoto e permitir que ele se aquecer gradualmente a rodurante a noite a temperatura om.
    5. Após 18 h de agitação, a remoção de aproximadamente metade do solvente por meio de um colector de gás sob vácuo, utilizando alto vácuo (300-500 mTorr), com uma armadilha de azoto líquido.
    6. Aqui o balão de reacção para uma caixa de luvas e filtra-se o sal branco que se formou na mistura de reacção através de uma frita de porosidade média, seco no forno equipado com um adaptador de vácuo e uma 24/40 mL balão de fundo redondo de 500 24/40 com uma agitação Barra. Use diclorometano para transferir todos os materiais restantes.
    7. Remover todos os produtos voláteis restantes do filtrado fora da caixa através de um colector de gás de vácuo com vácuo elevado.
    8. Numa caixa de luvas, transferir a mistura de reacção concentrou-se em uma seco em forno, 14/20 frasco de 100 ml de fundo redondo com uma barra de agitação para se preparar para destilação. Tapar o frasco com um septo.
    9. Sob um fluxo de azoto, abrir rapidamente o septo e adicionar 200 mg de hidreto de cálcio como um agente de secagem.
    10. Configurar o aparelho de destilação pela montagem de um forno-secou-se 14/20 cabeça de destilação ligado com um termómetro, um lado com um 14/20 frasco de 50 ml de armazenamento isento de ar, que recebe e o outro lado com o balão de 100 mL contendo o produto em bruto. Equipar a cabeça de destilação com água gelada. (Utilize graxa para todas as articulações do aparelho de destilação.)
      NOTA: o produto começa a destilar, quando a temperatura do vapor atingir 60 ° C a 300 mTorr.
    11. Continuar a recolher o produto, aumentando a temperatura do banho de óleo até que a cabeça de destilação termómetro lê 75 ° C.
      NOTA: o produto é um líquido incolor transparente.
    12. Pare destilação por remoção da fonte de calor e arrefece-se a aparelhos para a temperatura ambiente antes do armazenamento. Ao arrefecer, pressurizar o aparelho com azoto e firmemente fechar a válvula macho no frasco de armazenamento livre de ar. Armazene o produto isolado em um freezer porta-luvas.
      NOTA: O rendimento pode variar de 65% a 84%.
  2. Preparação de N -TBS- B Cl produto fechou-ring (2)
    1. Numa caixa de luvas, medir 56,0 g N -allyl- N -TBS- B-alilo aduto de cloreto de (1) (217 mmol) em um 24/40 1 L balão de fundo redondo, seco no forno com uma barra de agitação e adicionar 500 tolueno mL.
    2. Medir 1,79 g Grubbs 1 catalisador geração st (2,17 mmol).
    3. Adicionar o catalisador, em porções, à solução em agitação de 1, à temperatura ambiente numa caixa de luvas. Purgar a caixa durante a adição para remover o gás de etileno formado a partir da reacção.
      NOTA: a reacção está normalmente completa dentro de 30 min, da cessação da evolução de gás. Como outro indicador de conclusão, a cor da reação terá mudado completamente de sua inicial roxo ao marrom. Neste ponto, o produto pode ser isolado por meio de destilação no vácuo; veja referência 12 para obter detalhes. Neste protocolo, é descrito um one-pot, processo de dois passos para a síntese directa de 3.
  3. Preparação de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3)
    1. Para a solução de reacção do produto de anel fechado (2) em tolueno, adicionar 14,0 g de paládio sobre carbono (10% em peso de Pd, 13,2 mmol).
    2. Retirar o balão da caixa e ajustá-lo com um condensador de refluxo 24/40 seco no forno, que foi purgado com azoto e equipado com água gelada.
    3. Aquece-se a reacção utilizando um banho de óleo a um refluxo vigoroso a 135 ° C enquanto se agitava.
    4. Depois de se manter ao refluxo durante 16 h, arrefece-se a reacção por remoção do balão do banho de óleo. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, retirar uma aliquota mL a partir da mistura reaccional utilizando uma seringa equipada com uma agulha de fecho Luer seco no forno 0,5. Transferir o mL alíquota de 0,5 a um tubo de RMN de parafuso-top para analisar através de 11 B RMN 12.
      NOTA: O pico do produto desejado aparecer em ca. 35,5 ppm 12, enquanto que o mater começandopico ial aparece na ca. 42,9 ppm 12. Normalmente, neste momento 11 B RMN indica que a reacção está incompleta, com um menor pico de material de partida restante.
    5. Se a reacção estiver incompleta, trazer o balão de reacção para uma caixa de luvas e adicione um adicional 3,00 g de paládio sobre carbono (10% em peso de Pd, 2,82 mmol).
    6. Resubject a reacção até ao refluxo condições como descrito em 1.3.2 e 1.3.3.
    7. Após um adicional de 24 h em refluxo, analisar uma outra alíquota da reacção por RMN 11 B. Neste ponto, a reacção deve estar completa.
    8. Transferir o frasco da reacção para a caixa de luva e passar a mistura de reacção através de uma coluna de cromatografia flash descartável embalado com toalhetes de papel. Recolhe-se o filtrado por meio de lavagem com 50,0 ml de tolueno.
    9. Remove todos os voláteis do filtrado fora da caixa sobre um colector de gás de vácuo equipado com vácuo elevado.
      NOTA: A remoção dos produtos voláteis pode levar 40 minutos tO 90 min, dependendo da pressão de vácuo. Quando o indicador de vácuo lê a pressão máxima, que indica que a remoção do solvente é completa. Embora a remoção de solvente, certifique-se de que o banho de água sob o balão permanece à temperatura ambiente durante a dissipação de calor.
    10. Numa caixa de luvas, transferir a mistura de reacção concentrou-se em uma seco em forno, 24/40 balão de 250 ml de fundo redondo com uma barra de agitação. Tapar o frasco com um septo.
    11. remover rapidamente o septo e adicionar 200 mg de hidreto de cálcio como um agente de secagem.
    12. Configurar o aparelho de destilação pela montagem de um 24/40 cabeça de destilação seca em estufa anexado com um termómetro, um lado com um 24/40 100 mL frasco de armazenamento livre de ar recebendo e do outro lado com o frasco de 100 ml contendo produto bruto. Equipar a cabeça de destilação com água gelada. Use graxa para todas as articulações do aparelho de destilação.
      NOTA: o produto começa a destilar-se quando a temperatura do vapor atingir 65 a 70 ° C a 1000 mTorr com um óleotemperatura do banho entre 90-100 ° C. O produto é um líquido incolor transparente.
    13. Pare destilação por remoção da fonte de calor e arrefece-se a aparelhos para a temperatura ambiente antes do armazenamento. Ao arrefecer, pressurizar o aparelho com azoto e firmemente fechar a válvula macho no frasco de armazenamento livre de ar. Armazenar o produto isolado num congelador caixa de luvas a -30 ° C.
      NOTA: O rendimento para o um-vaso, o procedimento de dois passos é de 52%.

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Figura 2: 11 B espectros de RMN para a formação de monitorização de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3). A) N -Allyl- N-TBS-B-alil cloreto de aducto (1), o material para o anel de metátese de fecho inicial. B) Oxidação após 16 h. (Produto de anel fechado que não reagiu N -TBS- B Cl (2) e o produto isomerizado B -vinil de anel fechado (2 '), juntamente com N-TBS-B-Cl-1,2-azaborine (3) são mostrados.) C) A oxidação após mais 24 h. D) produto isolado (3), após purificação por destilação sob vácuo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Preparação de N -H- B -OBu-1,2-azaborine (4)
    1. Numa caixa de luvas, medir 4,00 g N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17,6 mmol) num balão mL, seco no forno 100 de fundo redondo com uma barra de agitação e adicionar 35 mL de acetonitrilo. Medir acetamida 1,14 g (19,3 mmol) e transferir para o frasco da reacção. Fecha-se o frasco com um septo de borracha.
    2. Retirar o frasco da reacção a partir da caixa e se encaixam com um OVen-seco 24/40 condensador de refluxo que foi purgado com azoto e equipado com água gelada.
    3. Aquecer a reacção a refluxo a 85 ° C num banho de óleo com agitação.
    4. Após 3 h em refluxo, arrefece-se a reacção por remoção do balão do banho de óleo. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, remover o solvente em um tubo de distribuição de gás de vácuo equipado com vácuo elevado.
    5. Após a remoção dos voláteis sob vácuo, redissolver o resíduo de reacção em 15,0 mL de THF. A esta solução adicionar 3,21 mL de n-butanol (35,1 mmol).
    6. Agita-se a reacção à temperatura ambiente durante 1 h.
    7. Remover o solvente num colector de gás de vácuo equipado com vácuo elevado, para se obter o produto em bruto.
    8. Numa caixa de luvas, isolar o produto através de cromatografia em coluna de gel de sílica, utilizando uma mistura de pentano e éter dietílico (5: 1) como eluente. Remover os voláteis a partir das fracções contendo o produto, utilizando um colector de gás de vácuo equipado com vácuo elevado, para se obter o produto puro comoforma de um sólido branco.
      NOTA: O rendimento pode variar de 82% a 87%.
  2. Preparação de N -H- B -etil-1,2-azaborine (5)
    1. Numa caixa de luvas, medir 1,00 g N- H -B- Obu-1,2-azaborine (4) (6,62 mmol) num frasco de 100 ml de fundo redondo, seco no forno com uma barra de agitação e adicionar 25 mL de Et 2 O. selo do frasco com um septo de borracha e colocar sob N 2 em um colector de gás de vácuo.
    2. Em um balão de 100 ml de fundo redondo, seco no forno separado, adicionar 26,5 mL de uma solução de etil-lítio (0,5 M em benzeno / ciclo-hexano, 13,2 mmol) sob atmosfera de azoto. Remover a mistura do solvente (benzeno / ciclo-hexano) a partir do reagente de etil-lítio para evitar problemas com o isolamento do produto desejado azaborine. Redissolve-se o etil-lítio sólido em 13,0 ml de Et 2 O.
      NOTA: Atenção: reagentes organolítio são pyrophoric (inflamável em contacto com o ar ou água). O produto desejado (5 ) É particularmente volátil (MW = 106,96). Portanto, a remoção do solvente de benzeno / ciclo-hexano a partir de etil-lítio reagente é necessário para o isolamento eficaz do produto puro, devido à volatilidade semelhante com o produto desejado.
    3. Arrefece-se o balão de reacção que contém de 4 a -30 ° C com um banho de arrefecimento.
    4. Adicionar a solução de etil-lítio ao frasco de reacção por meio de transferência de uma cânula a -30 ° C. Manter agitação a esta temperatura durante 1 h e permitir que a aquecer lentamente até à temperatura ambiente.
    5. Monitorizar a reacção por 11 B RMN. (O pico intermediário desejado aparecer a cerca de 39,8 ppm).
    6. Após a conclusão da reacção, arrefece-se a reacção a -30 ° C e adicionar 6,62 mL de uma solução de HCl (2,0 M em Et2O, 13,2 mmol). Agita-se a reacção durante 1 h, enquanto que permitindo-a aquecer lentamente até à temperatura ambiente.
    7. Remover o solvente num colector de gás de vácuo equipado com baixo vácuo (20-25 torr) para se obter a mistura de produto em bruto.
    8. Numa caixa de luvas,isolar o produto através de cromatografia em coluna de gel de sílica, utilizando 2-metilbutano como eluente. Remover o volátil para um colector de gás de vácuo equipado com um vácuo atenuada para se obter o produto puro como um líquido incolor.
      NOTA: O rendimento é de 56%.

2. Proteína Preparação e cristalização de lisozima T4 Mutantes

  1. Protein Expression and Purification
    1. Cultivar células E. coli RR1 transformadas com os plasmídeos subclonados (L99A ou L99A / M102Q) meio suplementado com 40,0 mg de ampicilina a 37 ° C durante 12 h, 17, 20 em 200 ml de LB (caldo de lisogenia).
      NOTA: A composição do meio LB é 12 g de triptona, 5 g de extracto de levedura, cloreto de sódio a 10 g, e 1 g de glucose por 1 LH 2 O.
    2. Inocular 4,00 L meio LB (suplementado com ampicilina 800 mg) com 160 mL da cultura durante a noite e incubar a 37 ° C a 240 rpm com um filterefornecimento de ar d.
    3. Quando a densidade óptica atingir 0,7 a 600 nm, arrefece-se a cultura bacteriana até à temperatura ambiente, retirando-o da incubadora.
    4. Medir 695 mg de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (concentração final de 0,7 mM) num tubo de centrifugação cónico e adicionar 4 ml de LB meios para dissolver.
    5. Adicionar a solução de IPTG à cultura para induzir a expressão da proteína. Incubam-se as culturas a 110 rpm durante 21 h a 25 ° C.
    6. Centrifugar a cultura a 4412 xg durante 30 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 300 ml de fosfato de sódio 0,1 M (pH 6,6), NaCl 0,2 M e adicionar 30,0 mL de 0,5 M de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) (pH 8,0). Agita-se a suspensão durante 17 h a 4 ° C.
    7. Adicionar 30,0 ml de 1,0 M MgCl2 e 0,500 mL de desoxirribonuclease I (ADNase I) à suspensão e agita-se à temperatura ambiente durante 8 h.
    8. Centrifugar a suspensão de células lisadas a 30913 xg durante 30 min a 4 76; C. Recolher o sobrenadante contendo proteína expressa e descartar o pellet.
    9. Dialisar o lisado contra fosfato de sódio 20 mM (pH 6,5 para pH 6,3 e L99A para L99A / M102Q) a 4 ° C durante a noite.
    10. Lavar e equilibrar 20,0 mL de carboximetilo grânulos de permuta iónica com tampão de equilíbrio (Tris 50 mM, EDTA 1 mM (pH 7,3)) em uma coluna. Carregar a solução contendo proteína sobre as pérolas e lava-se a coluna com 100 ml do tampão de equilíbrio. Elui-se a coluna com um gradiente linear de 600 mL de NaCl 300 mM no tampão de equilíbrio.
    11. Usar um sistema de cromatografia de baixa pressão para a coluna de purificação. Usar uma bomba de taxa de 1 mL / min e recolhem fracções de 10 ml. Recolher as fracções contendo proteína pura.
      Nota: Durante a eluição, monitorar a densidade óptica (DO) a 280 nm para verificar a presença da proteína. Determinar a pureza de cada fracção por SDS-PAGE e apenas recolher as fracções mais puras.
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Figura 3: Os resultados representativos para a purificação de proteínas de T4 lisozima L99A mutante / M102Q. A) cromatograma que mostra a absorvância de UV medido na UA a 280 nm (linha azul) e da condutibilidade em mS / cm (linha vermelha). As fracções 20-23 foram combinadas e a pureza foi determinada por SDS-PAGE. B) 15% de gel SDS-PAGE que mostra a presença de proteína purificada de fracções 20-23 em 18,6 kDa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. cristalização de proteínas
    1. Transferir a solução de proteína purificada a um tubo de membrana de diálise (MWCO 12.000 a 14.000). Colocar o tubo de diálise para um copo contendo 4,00 L de fosfato de sódio 100 mM, NaCl 550 mM, 0,02% de NaN3 (pH 6,5 para pH 6,3 e L99A para L99A / M102). Agita-se a solução de 4 L durante a noite a 4 ° C.
    2. Adicionar 2-mercaptoetanol (concentração final de 5 mM) para a amostra dialisada e concentrar de modo a ~ 40,0 mg / ml utilizando um concentrador centrífugo (10.000 MWCO). Determinar a concentração de proteína através da medição da absorção a 280 nm. Remover qualquer precipitado por fiação antes da cristalização.
    3. Use o método de gota suspensa de vapor de difusão para cristalização de proteínas. Misture 5,00 mL da solução concentrada de proteína com 5,00 mL da solução de reservatório (fosfato 2,0-2,2 M de sódio / potássio, pH 6,7-7,1, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mM de dissulfureto de 2-hidroxietilo) sobre uma lâmina de vidro de cobertura siliconizada.
    4. Equilibrar a gota mistura contra 1,00 mL da solução de reservatório, colocando a lâmina de cobertura de cabeça para baixo na parte superior do reservatório de solução de cada cavidade que continha. Use graxa para selar firmemente cada poço com o slide. Defina-se várias condições utilizando uma placa de 24 poços com solução reservatório mencionado no ponto 2.2.3.Armazenar a placa a 4 ° C durante o crescimento do cristal.
      NOTA: Os cristais crescem normalmente em 1-2 semanas, no tampão de equilíbrio nas na corrediça de cobertura. precipitação imediata durante a mistura solução de proteína com a solução reservatório no passo 2.2.3 indica falha de cristalização.

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Figura 4: imagem representativa de cristais de T4 lisozima L99A mutante antes de complexação com ligantes. Os cristais são no licor mãe (de sódio 2,1 M / fosfato de potássio, pH 6,9, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mM de dissulfureto de 2-hidroxietilo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. preparação de complexo
    1. Escolha os cristais utilizando um tubo criogénico em forma em um loop (veja Lista de Materiais) ecolocá-los em um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL. Adicionar 50.0 ul de licor mãe para o tubo para evitar a secura e preservar os cristais.
      NOTA: a seleção de cristal único é auxiliado por meio de um microscópio.
    2. Transferir o tubo contendo cristais em uma caixa de luvas. Tome 5,00 mL do ligando azaborine (5) e coloque dentro do snap-cap do tubo. Cap e armazenar o tubo no frigorífico (4 ° C) dentro da caixa de luva para 2-7 dias para o equilíbrio por difusão de vapor.
      NOTA: As propriedades físicas (elevada volatilidade e solubilidade em solução aquosa) do ligando azaborine (5) permite que a complexação com os cristais de proteína pré-formadas através do método de difusão de vapor.
    3. Transferir os cristais utilizando um tubo criogénico em forma em forma de laço a uma lâmina de vidro contendo uma gota de N-paratone antes do Flash-congelação em azoto líquido. Escolha o cristal protegido com N-paratone e rapidamente flash-freeze mergulhando o cristal sobrelacete num Dewar contendo azoto líquido. Monte o cristal em loop usando um tong criogênico.
    4. Recolher conjuntos de dados de um único cristal usando radiação síncrotron. Realizar a substituição molecular utilizando estruturas publicados 20, 24; verificar a existência de ligante no interior do sítio de ligação da proteína por um blob un-modelada de densidade de elétrons.

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Figura 5: modelos atômicos do T4 lisozima mutante L99A bolso de ligação com a densidade de elétrons. A) cavidade L99A com um blob densidade de elétrons-modelado un no sítio de ligação. B) L99A cavidade com o ligando azaborine modelada 5 em dois confórmeros alternativos. Por favor click aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

A via de síntese para 1,2-esquemática azaborines é mostrado na Figura 1. Isto aplica-se o protocolo para a síntese de cinco moléculas de boro-azoto contendo diferentes. A Figura 2 representa espectros de RMN de 11 B medida no decurso do passo 1.3 para monitorizar a formação do produto desejado (3). Purificação de proteínas foi realizada por cromatografia usando o sistema de baixa pressão e um cromatograma representativo é most...

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Discussão

Na primeira parte deste protocolo, descrevemos uma síntese modificada de 1,2-azaborines baseados em métodos previamente relatados 12, 13. Triallylborane 22 foi utilizado como um substituto para as rotas usando allyltriphenyl estanho ou de potássio allyltrifluoroborate para preparar N N -allyl- -TBS- B -alil aduto de cloreto de (1). Este método permite uma abordagem mais átomos de-econômica e amb...

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Divulgações

Todos os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes neste manuscrito.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) e Boston College.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tetrahidrofurano (THF), livre de inibidores, para HPLC, ≥ 99,9%Sigma Aldrich34865
Éter dietílico (Et2O), para HPLC, ≥ 99,9%, livre de inibidoresSigma Aldrich309966
cloreto de metileno  (CH2Cl2), (ACS estabilizado/certificado)FisherD37-20
ToluenoFisherT290-4
Pentano, HPLCFisherP399-4
AcetonitrilaFisherA21-4
Hidreto de cálcio (CaH2), grau de reagente, 95%Sigma Aldrich208027Paládio pirofórico
em carvão ativado (Pd/C), 10% em peso PdStrem46-1900
1.0 M Solução de tricloreto de boro em hexanoSigma Aldrich211249Trietilamina altamente tóxica/pirofórica
, ≥ 99,5%Sigma Aldrich471283
Grubbs Catalisador < geração >stmateriaC823
AcetamidaSigma AldrichA0500
n-Butanol, anidro, 99,8%Sigma Aldrich281549
Solução de etillítio, 0,5  M em benzeno/ciclohexanoSigma Aldrich561452altamente tóxico/pirofórico
, 2.0 M em Et2OSigma Aldrich455180
2-Metilbutano, anidro, ≥ 99%Sigma Aldrich277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani e Chalmers (ATCC® 31343™)ATCC31343
T4 lisozima WT* (L99A)Addgene18476
T4 lisozima mutante (S38D L99A M102Q N144D)Addgene18477
Ampicilina sal de sódioSigma AldrichA0166
isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) InvitrogenAM9464
Fosfato de sódio monobásico anidroFisherBP329
Fosfato de sódio dibásico anidroFisherBP332
Cloreto de sódioFisherS642212 
Ácido etilenodiaminotetracéticoFisherBP118
Cloreto de magnésioSigma AldrichM4880Corrosivo
Thermo scientific pierce DNaseIFisherPI-90083
GE Healthcare  Meio de Troca Catiônica de Fluxo Rápido SepharoseFisher45-002-931
Tris-baseFisherBP152-500 
Azida de sódioTCIS0489Altamente tóxico
2-MercaptoetanolFisherICN806443 
Sartório  Concentradores Centrífugos Vivaspin 20Fisher14-558-501
Fosfato de potássio monobásicoSigma AldrichP5379
2-Hidroxietil dissulfetoSigma Aldrich380474
N-paratone Hampton ResearchHR2-643
4 RC Tubo de Membrana de Diálise 12.000 a 14.000 Dalton MWCO Fisher08-667E
  CryoLoopHampton Researchtubulação criogênica em forma de loop
CryoTongThermo Fishercriogênico tong
CootImagens de densidade eletrônica são geradas a partir do software
Solução de HCl

Referências

  1. Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
  2. Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
  3. Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
  4. Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
  5. Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
  6. Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
  7. Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
  8. Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
  9. Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
  10. White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
  11. Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
  12. Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
  13. Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
  14. Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
  15. Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
  16. Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
  17. Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
  18. Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
  19. Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
  20. Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
  21. Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
  22. Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
  23. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  24. Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).

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