Este protocolo descreve um ensaio para medir a função do CFTR e as respostas do modulador do CFTR em tecido cultivado de indivíduos com fibrose cística (FC). Os organoides intestinais derivados de biópsia incham de forma impulsionada pelo AMPc, uma resposta que é defeituosa (ou fortemente reduzida) nos organoides da FC e pode ser restaurada pela exposição a moduladores de CFTR.
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Artigo de método
Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An
Neste artigo
Resumo
Resumo
Drogas moduladoras do regulador de condutância transmembrana (CFTR) de fibrose cística recentemente desenvolvidas corrigem a expressão superficial e/ou função do canal CFTR mutante em indivíduos com fibrose cística (FC). A identificação de indivíduos que podem se beneficiar desses medicamentos é um desafio devido à extensa heterogeneidade das mutações do CFTR, bem como a outros fatores desconhecidos que contribuem para a eficácia individual do medicamento. Aqui, descrevemos um ensaio simples e relativamente rápido para medir a função individual do CFTR e a resposta aos moduladores CFTR in vitro. Organoides epiteliais tridimensionais (3D) são cultivados a partir de biópsias retais em meio organoide padrão. Uma vez estabelecidos, os organoides podem ser bioarmazenados para análise futura. Para o ensaio, 30-80 organoides são semeados em placas de 96 poços na matriz da membrana basal e são então expostos a drogas. Um dia depois, os organoides são corados com verde calceína e o inchaço induzido por forscolina é monitorado por microscopia confocal de células vivas a 37 ° C. O inchaço induzido por forscolina é totalmente dependente de CFTR e é suficientemente sensível e preciso para permitir a discriminação entre as respostas medicamentosas de indivíduos com mutações CFTR diferentes e até idênticas. As respostas de inchaço in vitro se correlacionam com a resposta clínica à terapia. Este ensaio fornece uma abordagem econômica para a identificação de indivíduos responsivos a medicamentos, independentemente de suas mutações no CFTR. Também pode ser fundamental no desenvolvimento de futuros moduladores CFTR.
Introdução
FC é causada por mutações no gene da fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), que codifica um canal de anião epitelial. CF afeta cerca de 85.000 pessoas em todo o mundo 1. Mais de 2.000 mutações CFTR foram identificados ( www.genet.sickkids.on.ca ). Esta diversidade explica parcialmente um amplo espectro de fenótipos da doença observados ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Seis classes de mutações CFTR são definidos com base no seu efeito na expressão da proteína de CFTR e função de: (i....
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Protocolo
Todos os experimentos usando tecidos humanos aqui descritos foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade Medical Center Utrecht (UMCU; TcBio # 14-008). O consentimento informado para a recolha de tecidos, geração, armazenamento e uso dos Organóides foram obtidas junto aos pacientes do Hospital (WKZ) -UMCU de Wilhelmina Children.
| Equipamento | consumível | Ferramentas |
| câmara de fluxo laminar | 15 e 50 ml de tubos cónicos | Zeiss LSM 800 - Zen 2 (edição az.... |
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Resultados
A Figura 1A mostra um isolamento fresco representante da criptas incorporados em BMM. As criptas são a partir de uma biópsia de um sujeito colorrectal CF. Normalmente, um organ�de é gerado a partir de cada cripta (Figura 1A - C). Devido à disfunção da CFTR, a maioria dos Organóides cólon CF não são cística, mas sim são compactos e com projecções e brotos (Figura 2A - 2B). No entanto, alguns CF organ�.......
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Discussão
Aqui, nós fornecemos um protocolo completo para a geração, a expansão, o congelamento e descongelamento das Organóides colorectal humanos. Enquanto nós estabelecemos culturas organ�de humanos há algum tempo atrás 17, tem por vezes sido difícil para estabelecer a tecnologia em outros laboratórios, sem treinamento prático. Prevemos que esses protocolos irá substituir essa formação.
-Wnt-3A meio condicionado é um dos reagentes mais importantes para ter sucesso no estab.......
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Divulgações
Hans Clevers é um inventor de patentes para cultura de organoides e o ensaio de inchaço induzido por Forskolin. Jeffrey M Beekman é um inventor de uma patente para o ensaio de inchaço induzido por Forskolin. Sylvia F Boj e Robert Vries são empregados pela Fundação Hubrecht Organoid Technology (HUB), que detém a licença exclusiva para a Organoid Technology. Caso contrário, os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo programa HIT-CF dos holandeses CF fundação (CNSF), ZonMW (40-00812-98-14103), Fundo de Investigação Hospital Infantil de Wilhelmina e CZ, e Zilverenkruis / Achmea. Nós gostaríamos de agradecer a S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, e G. Berkers (Departamento de Pneumologia Pediátrica, Hospital de Wilhelmina Children, UMC Utrecht), e RHJ Houwen (Departamento de Gastroenterologia Pediátrica, Wilhelmina Hospital infantil, UMC Utrecht) para abordar os pacientes e recebendo as biópsias para a geração de um CF Biobank.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dulbecco Avançado' s Meio de Águias Modificado com Mistura de Nutrientes F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | armazenado a 4 &graus; C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | armazenado a 4 &graus; C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | armazenado a 4 &graus; C |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | armazenado a -20 &graus; C |
| Placa de cultura de 96 poços | Cellstar | #655180 | |
| Placa de cultura de 24 poços | Cellstar | #662160 | |
| Placa de cultura de 6 poços | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Salight (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | armazenado a 4 ° C |
| Dulbecco' s Águias Modificadas Médias (DMEM) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | Para Produção Média Condicionada Wnt-3A. Armazenado a 4 &graus; C |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Bovogen | #SFBS LOTE#11113 | Para Produção Média Condicionada Wnt-3A. Armazenado a -20 > Linha |
| celular CL Wnt3A | ATCC | #CRL-2647 | para produção de meio condicionado Wnt-3A. |
| Plasmídeos TOP/FOP | Millipore | #17-285 | Para medir a atividade Wnt |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | Para medir a atividade Wnt |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | Para medir a atividade Wnt |
| Sistema de Ensaio Reporter Dual-Luciferase | Promega | #E1910 | Para medir a atividade Wnt |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | Para Wnt-3A Seleção de linha celular |
| B27 suplemento | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | armazenado a -20 &graus; C |
| N-Acetilcisteína | Sigma Aldrich | #A9165-5G | armazenado a -20 ° C |
| Nicotinamida | Sigma Aldrich | #N0636 | armazenado a -20 ° C |
| Fator de Crescimento Epitelial Humano (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | armazenado a -20 ° C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | armazenado a -20 ° C |
| TGFb tipo I Inibidor do receptor (A83-01) | Tocris | #2939 | armazenado em -20 ° C |
| Y-27632 dicloridrato (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | armazenado a -20 ° C |
| p38 Inibidor de MAPK (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | armazenado a -20 &graus; C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | armazenado a -20 & C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | # 120-10C | armazenado a -20 ° C |
| R-sespondina humana 3 (hRspo-3) | R& D Systems | #3500-RS/CF | armazenado a -20 &graus; C |
| Vancomicina | Sigma Aldrich | # 861987 - 250mg | armazenado a -20 ° C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | armazenado a -20 ° C |
| Ácido etilenodiamina tetracético (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Armazenado a 4 ° C |
| Matrigel | Corning | # 354230 | armazenado a -80 ° C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | para tripsinização de organoides para congelamento |
| Congelamento de cultura de células de recuperação Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | para congelamento |
| de calceína | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | armazenado a -20 ° C |
| Forskolin | R& D Systems | #1099-50 mg | armazenado a -80 &graus; C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | armazenado a -80 ° C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | armazenado a -80 ° C |
| Nome dos Reagentes/Material | Solvente | Concentração de estoque | Concentração Final |
| GlutaMax | 200 mM | 2 mM | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicilina/Estreptomicina | 10K U/ml 10K µ g/ml | 100 U/ml 100 µ g/ml | |
| de zeocina | 100 mg/ml | 125 µ g/ml | |
| de suplemento de B27 | 100x | 1x | |
| N-Acetilcisteína | MiliQ H2O | 500 mM | |
| Nicotinamida | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Fator de Crescimento Epitelial Humano (hEGF) | DPBS 0,1% BSA | 0,5 mg | /ml 50 ng/ml |
| Gastrina | DPBS | 100 µ M | 10 nM |
| TGFb tipo I Inibidor do receptor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dicloridrato (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µ |
| M p38 inibidor de MAPK (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µ |
| M Primocin | 50 mg/ml | 100 µ g / ml | |
| de Noggin Humano (hNoggin) | DPBS 0,1% BSA | 100 e micro; g/ml | 100 ng/ml |
| R-spondina humana 3 (hRspo-3) | varia por lote | 300 ng/ml | |
| Vancomicina | 10 mg/ml | 50 µ g/ml | |
| Gentamicina | 10 mg/ml | 50 µ g/ml | |
| Ácido etilenodiamina tetracético (EDTA) | MiliQ H2O | 0,5 M | 2 mM |
| Calceína | DMSO | 10 µ g/ml | 3,3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | variável |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 | mM variável |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 | mM variável |
Referências
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- ....
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Reimpressões e permissões
