Artigo de método

Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

9.4K vistas

⸱

DOI:

10.3791/55177

⸱

27 de março de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para células de imagens que expressam receptores verdes fluorescentes marcado com proteína de tipo angiotensina 1a durante a endocitose iniciadas por tratamento angiotensina II. Esta técnica inclui lisossomas rotulagem com um segundo marcador fluorescente, e em seguida, utilizando software para analisar a co-localização do receptor e lisossoma em três dimensões ao longo do tempo.

Resumo

Processamento de imagem de células vivas é usado para capturar simultaneamente imagens de lapso de tempo de receptores do tipo angiotensina 1a (AT 1a R) e compartimentos intracelulares em células embrionárias humanas transfectadas renal-293 (HEK) após estimulação com angiotensina II (Ang II). HEK são transitoriamente transfectadas com DNA plasmídeo contendo AT 1a R marcado com reforçada proteína verde fluorescente (EGFP). Os lisossomas são identificados com um corante fluorescente vermelho. imagens ao vivo de células são capturados num microscópio confocal de varrimento laser, após a estimulação de Ang II e analisadas por software em três dimensões (3D), voxels ao longo do tempo. processamento de imagem de células vivas, permite investigações de tráfico receptor e evita confunde associados com a fixação, e em particular, a perda ou o deslocamento artefactual de receptores de membrana de EGFP-marcados. Assim, como as células individuais são rastreados através do tempo, a localização subcelular de receptores pode ser representada por imagem e medido. As imagens devem ser adquiridas sufficiently rapidamente para capturar o movimento vesícula rápida. No entanto, a velocidades mais rápidas de imagem, o número de fotões recolhidos é reduzida. Compromissos também deve ser feita na seleção de parâmetros de imagem como o tamanho do voxel, a fim de ganhar velocidade de imagem. aplicações significativas de processamento de imagem de células vivas estão a estudar proteína tráfico, migração, proliferação, ciclo celular, apoptose, autofagia e proteína-proteína interação e dinâmica, para citar apenas alguns.

Introdução

O objectivo global é obter evidência quantitativa em tempo e espaço de co-localização do receptor com organelas subcelulares específicos após o tratamento com um agonista do receptor. Assim, o objectivo imediato aqui é capturar lapso de tempo imagens confocais de lisossomas e um transmembranar abrangendo receptor em células de rim embrionário humano (HEK) a seguir à transfecção e de montar posteriormente e analisar os dados de imagem em 3D para medir quantitativamente a entrega do receptor de lisossomos. Investigando o tráfico simultânea de um receptor transmembranar com lisossomos ou outras organelas durante a endocitose quando ativado por ligando de receptor pode ajudar a determinar a forma como o receptor de membrana é regulada sob condições fisiológicas e fisiopatológicas.

EM 1a R é presumido ser degradado nos lisossomas, após tratamento com Ang II em sistemas celulares modelo, principalmente HEK293 1, embora a maioria dos receptors estão localizados principalmente em endossomas de reciclagem multivesiculares para posterior reciclagem para a membrana plasmática, enquanto a maior parte do ligando, a Ang II, é degradado no lisossoma 2, 3, 4, 5. Mais recentemente, Li et al. demonstrada utilizando transferência de Förster de energia de ressonância (FRET) e microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM) técnicas que a 1A R colocaliza (em ~ 10 nm escala) com LAMP1, uma proteína de membrana lisossomal o que sugere que pelo menos algum do receptor está voltado para e degradada por lisossomas 6. Estes autores observaram que a cloroquina inibidor lisossômico bloqueado na 1a associação R-LAMP1 que é consistente com relatórios anteriores que sugerem que um efeito da cloroquina é bloquear fusão de endossomas tardios ou autofagossomas com lisossomos. Outras abordagens indiretas para determinar AT 1a R localization nos lisossomos têm utilizado bafilomicina, um inibidor lisossômico para inferir AT 1a presença R nos lisossomos 3, 4, 5, 6, 7, 8.

processamento de imagem de células vivas evita potenciais efeitos de fixação sobre o volume das células e perda / escurecimento / redistribuição de receptor GFP-quimérico. Estudos anteriores têm invocado células fixas para determinar colocalização ou co-ocorrência do receptor com lisossomas ou utilizando células vivas marcadas com substitutos de ligação ao receptor, como β-arrestina 1, 2, 3, 4, 5, 6. processamento de imagem de células vivas de outros GPCRs usando confocal disco giratório ou laser conf ponto de leituramicroscópios ocal equipados com detectores de Gaasp ou HYD habilitado investigadores para observar a internalização e tráfico de receptores em células individuais fotografada em z-stacks em 30 s intervalos de 9, 10. No entanto, mesmo quando células z-stacks vivo são recolhidos rapidamente, análise só pode ocorrer após a seleção de um único plano dentro de cada pilha, ou seja, em 2D 10. Embora isso possa ser suficiente para estudar o receptor quinase GPCR ou tirosina internalizado em questão, os Rs 1-A em acumula em vesículas que mudam de tamanho e posição ao longo do tempo e, portanto, são inerentemente mais difícil de provar de forma adequada usando uma fatia único representante em cada ponto de tempo. Para determinar completamente a rota do rotulada a 1a R através da célula e detectar cada subpopulação de vesículas que diferem em tamanho e posição, temos desenvolvido um método para geração de imagens 3D e análise 3D para acompanhar essas mudanças e ser utilizado em conjunto com a rotulagem de vários compartimentos intracelulares, tais como os lisossomas.

Os investigadores podem utilizar este protocolo para geração de imagens ao vivo de células de visualizar diretamente o movimento de AT 1a R dentro da célula e sua transferência para compartimentos subcelulares após a estimulação Ang II. compartimentos subcelulares são marcados com quimeras proteínas fluorescentes ou outros marcadores fluorescentes. Este protocolo pode também ser utilizado como uma primeira abordagem para localizar receptores em organelos subcelulares com uma resolução mínima de 200 nm a fim de comparar mutado contra os receptores de tipo selvagem ou para detectar alterações seguintes tratamentos farmacológicos. A técnica é acessível, uma vez que pode ser realizado em qualquer microscópio confocal equipado para processamento de imagem de células vivas. A relativa facilidade desta abordagem contrasta com o aumento da experiência e equipamento necessário para levar a cabo / FLIM técnicas FRET / BRET que detectam interacções moleculares 6,"xref"> 11. Estas medições definir interacções proteína-proteína com uma resolução elevada (~ 10 nm) e localização dentro organelos subcelulares é inferida. Estas técnicas mais avançadas são usadas para acompanhar e definir melhor as interações moleculares de interesse, em vez de a passagem de receptores através de compartimentos subcelulares, e eles demonstram diretamente interações proteína-proteína em horários e locais específicos dentro da célula 11. FLIM, uma técnica de FRET independente da concentração de aceitador, é mais frequentemente realizada em amostras fixadas desde aquisição de imagem é mais lenta. Em contraste, a relação FRET fornece imagens rápida e co-localização de alta resolução de proteínas que interagem. A desvantagem de relação de FRET é que a imagem utiliza widefield epi-fluorescência para ganhar velocidade de imagem e incluir toda a célula, resultando na redução da resolução e contraste de organelas 12. transferência de bioluminescência de energia de ressonância (BRET) é outraavançada técnica que tem sido aplicado aos GPCRs para medir a aquisição de proximidade molecular ao longo do tempo 11. Nesta técnica, um fluoróforo proteína molecularmente é dividida e cada metade ligada a uma das duas proteínas em questão. Quando as duas proteínas de interesse ligam-se um ao outro, as partes da etiqueta quimérico voltar a montar para a aquisição de fluorescência e o aumento da fluorescência ao longo do tempo quantificada.

Aqui, apresentamos uma técnica simples para geração de imagens ao vivo de células juntamente com quantificação imagem para estudar o tráfico de AT 1a R na célula com a estimulação Ang II e da alteração potencial de entrega de internalizado AT 1a R para lisossomos após a estimulação Ang II. A utilização final para esta técnica é para caracterizar diferenças de tráfico membrana comparando tipo selvagem e mutantes receptores. Estas diferenças ajudará a identificar o mecanismo (s) que o impacto atividades fisiológicas da AT 1a R leading a regulação da pressão arterial.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Dia um

Sementeira 1. celular

  1. Prepare completa de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM). Adicionar 50 mL de soro bovino fetal, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 mL de L-glutamina em 450 ml de DMEM para fazer 500 ml de DMEM completo suplementado com soro fetal de bovino (10%), penicilina / estreptomicina (1%) e L-glutamina (1%).
  2. Semear as células de rim embrionário humano (HEK), número passagem 6-11 em 50.000 / poço em um 8 sistema lamela bem compartimentado em DMEM completo.
  3. Manter a corrediça compartimentado a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 24 h.

Dia dois

2. Lipossomas transfecção

  1. Recém fazer pelo plasmídeo e lipossomas soluções 1a R-GFP utilizando condições estéreis com um gabinete de biossegurança nível 2.
  2. Dilui-se 2 ul de DNA de plasmídeo a 900 ng / mL da solução em 178 uL de meio de soro reduzido para atingir um Concentratião de ADN plasmídeo de aproximadamente 10 ng / mL.
  3. Diluir 4,5 mL de solução de estoque de lipossomas em 175,5 mL de meio de soro reduzido para criar uma diluição de 1:40 do estoque.
  4. Adicionar a solução de lipossomas para a solução de plasmídeo e misture utilizando um pipetador de 1 mL a pipetar para cima e para baixo 20 vezes para misturar a solução de transfecção.
  5. Incubar a mistura durante 30 min à temperatura ambiente (25-27 ° C).
  6. Enquanto esta mistura é incubação, remover os meios lentamente com uma pipeta de 1 mL e adiciona-se lentamente 400 ul de 1x tampão de fosfatos salino (PBS), que é pré-aquecido a 37 ° C.
  7. Suavemente remover o PBS e substituir com 200 ul / poço de meio de soro reduzido pré-aquecido a 37 ° C.
    NOTA: Tenha cuidado em todas as etapas ao lavar as células para evitar desprendimento de células da lamela por pura estresse induzido por pipetagem.
  8. Manter as células a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 30 min.
  9. Uma vez operíodo de incubação é longo, adicionar 80 mL de mistura de transfecção a cada poço e incubar as células durante 4,0-4,5 h, mas não mais do que 5 h a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2.
  10. Após o período de transfecção incubação estar completa, remover lentamente a mídia das câmaras utilizando um ml pipetador 1 e suavemente substituir com 300 ul / poço de DMEM completo e incubar as células durante 24 h a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 .

Dia três

3. Soro fome

  1. Remova o material suavemente, utilizando uma pipeta de 1 mL e substituir-se lentamente com 300 mL de DMEM isento de soro sem vermelho de fenol.
  2. Manter a câmara a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO2 durante 10-12 h.

dia Quatro

4. imagens de células vivas

  1. Compartimentos intracelulares Mancha (lisossomos, neste caso).
    1. AboUT (corante fluorescente 0,5 ul de 1 mM diluída em 499,5 mL de DMEM isento de soro sem vermelho de fenol) 30 minutos antes da imagiologia lisossomas nas células, adicionar 22,5 mL de uma solução de fluorescência da tintura 1 uM a cada poço para uma concentração final de corante de 75 nM.
    2. Incubar durante 25-30 min a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 e, em seguida, remover suavemente o corante e adiciona-se lentamente 300 ul de DMEM fresco isento de soro sem vermelho de fenol.
  2. Prepare o microscópio para a imagem latente.
    1. Ajustar a fase para baixo a fim de evitar danos para a lente durante o arranque de um microscópio automatizado.
    2. Ligue a alimentação do microscópio, poder scanner, potência do laser e, em seguida, emissão de laser e, finalmente, a lâmpada de iodetos metálicos para a observação visual (veja as instruções do fabricante microscópio confocal).
    3. Abra o programa de software de imagem e na volta software no argônio (488 nm) laser e potência de até 30-50%. Observe o poder dependeidade de laser. Dentro de experiências é fundamental para manter as definições constantes.
    4. Ligue laser emitindo red-(por exemplo, 568 nm ou 594 nm).
    5. Definir formato de imagem à profundidade de 12 bits.
    6. Defina o pinhole para a linha de laser de argônio de 488 nm e para a 568 nm ou 594 nm laser para uma unidade de disco de Airy. Se a GFP é muito fraca, use uma configuração de 2 unidades de disco de Airy, mas coincidir com os canais de forma adequada.
    7. Ao usar conjuntos de filtros dicróicas, selecionar os comprimentos de onda de emissão adequadas para GFP e o corante fluorescente. Ou, defina o comprimento de onda de emissão (Em) a 499-580 nm para GFP e Em 599-680 nm para o corante fluorescente que emite vermelho.
    8. Verifique se sangrar e outros cruzados não ocorrem. Desligue cada laser, por sua vez e verificar ambos os canais de emissão para cada um. Quando o laser de argônio é desligado, a emissão verde deve ser zero. Quando o laser emitindo verde está apagado, o canal de emissão vermelha deve ser zero.
      NOTA: O método mais seguro é para a imagem cada um em faixas separadas (sequcial).
    9. Incluir um canal brightfield se desejado. Evitar a imagiologia de contraste diferencial (DIC), porque ele pode distorcer medições colocalização.
    10. Para geração de imagens ao vivo, selecione sequencial de linha em vez de sequencial quadro.
  3. Selecione as células para a imagem latente.
    1. Utilizar um objectivo 1,4 abertura numérica (NA), tal como um 63X / 1.4 NA objectivo de óleo para as células da imagem (ou 40X / 1.4 NA). Centralize o objetivo e adicionar uma gota de alta viscosidade, óleo de baixa autofluorescência de imersão para o objectivo.
    2. Transferir a câmara com as células transfectadas da incubadora para a fase do microscópio. Tenha cuidado para manter os slides plano e assegurar que a câmara está bem encaixado e impedido de movimento.
    3. Mover o objectivo acima até que a gota de óleo apenas toca na parte inferior da corrediça; o plano focal direito está perto a esta posição. Em microscópios automáticas, guardar esta posição, bem como a posição mais baixa para usar para o remainder da experiência de imagem para facilitar a mudança de amostras.
    4. Escolha células dim. As células que sobre-expressam a 1A R-GFP irá desviar o receptor na célula e interromper a função normal.
    5. Confirmar que o contorno da célula, definido pela membrana de plasma, é visível, e de preferência não se sobrepõem com outras células.
    6. A focagem e o centro da célula no campo de visão.
    7. Alternar para o modo confocal.
    8. Selecione um modo de imagem rápido. Com uma das mãos sobre o controle de foco e outra no controle XY fase, concentrar e centralizar a célula de interesse visualizada no monitor.
    9. Confirmar que a célula de interesse é bem se espalhar e seu lado inferior ou ventral justapostos em estreita colaboração com a lamela, concentrando-se para cima e para baixo através do celular.
  4. Defina os parâmetros z-estágio para uma imagem de células em 3D.
    1. Selecione o botão On para o topo Z-stack e de diálogo de fundo (ou equivalente) e foco para o fundo da cell seguida, pressione "begin". Em seguida, o foco para o topo da célula e pressionar "final". Verifique novamente que toda a célula é incluída na z-pilha.
    2. Defina o tamanho do Z-passo a 1,0 mm.
  5. Defina as configurações de imagem.
    1. Escolha de zoom 2, dependendo da lente, de modo que o tamanho final do pixel é de cerca de 0,279 uM x 0,279 uM a 0,14 uM x 0,14 mm na dimensão XY.
    2. Para as células HEK nesta experiência, definir a velocidade de digitalização para cerca de 1 mS por voxel e selecione 2 média ou 2 acumulações por linha, dependendo do brilho das células.
    3. Ajustar a intensidade do laser e ganhar para geração de imagens GFP e o corante fluorescente. Em geral, counterstains será muito mais brilhante e, portanto, detector fotomultiplicador (PMT) e fosfeto de arseneto de gálio não (Gaasp) ou detectores de híbridos (HYD) devem ser utilizados para este segundo canal de cor enquanto detectores GASP e HYD são necessários para o canal de GFP. Se o HYD ou Gaasp detectarRUP são utilizados para o corante fluorescente, exercer cautela e iniciar com o laser com uma potência extremamente baixa.
    4. Definir duração da varredura e frequência de digitalização, por exemplo, a cada 30-60 s durante 25 minutos ou mais para ver a segmentação da AT 1a R-GFP para lisossomos.
    5. Ajustar o foco automático para manter a estabilidade de plano focal ao longo do tempo.
  6. Comece a experiência de imagem.
    1. Preparar adiantado 100x Ang II de estoque a 5 ug / uL (4,7793 mM) e adicionar 2,1 mL desta forma a 998 ul (10 uM).
    2. Comece a estimulação do ligando pela adição de 3 ul de uma solução de reserva de ligando 100x (Ang II) para o poço contendo 300 mL imediatamente antes da imagem (concentração final 100 nM).
    3. Clique em Iniciar e imagem em 3D para o tempo e frequência desejada.
    4. Antes de terminado o trabalho no microscópio, recolher um z-stack para uso posterior na subtração de fundo durante a análise. No modo de contagem de fotão, isto não énecessário uma vez que o fundo é essencialmente 0. Com iluminação ligado e todas as outras condições de imagiologia do mesmo, mas com nenhuma amostra de tomar uma imagem de exemplo. Veja a subtracção de fundo (abaixo) em análise.

Quinto dia

Análise 5. Imagem

  1. Imagens de exportação para o formato TIFF.
    1. Botão direito do mouse sobre o nome do arquivo de imagem para ver menus e selecione Exportar ou clique em Arquivo | Export | importar.
    2. Exportação para TIFF para análises posteriores certificando-se de exportar o RAW, os dados de 12 bits [não o "Vermelho Verde Azul" conversão (RGB) usadas para imagens de qualidade de publicação]. Não exportar para o formato jpeg.
    3. Note-se a X, Y, Z e dimensão do voxel o tamanho Z-passo para uso mais tarde durante a análise de imagem. Por exemplo, usando um 40X / 1.4. NA objectiva estes valores pode ser 0.138 mm x 0.138 mm, com 1 mm de tamanho z-passo (ver dados na seção de resultados representativos).
  2. Criar pilha de imagens para análise.
    1. Software de quantificação imagem aberta (Figura 2)
    2. Use "Ação | Criar Nova | Imagens de sequência seleccionada" para gerar uma imagem de arquivo único de sequências importadas individuais (Figura 2, seta # 1).
    3. Digite o número de canais, o número de z-seções, eo número de pontos no tempo.
    4. Dependendo da estrutura dos ficheiros.tiff *, seleccionar, por exemplo, canais, plano z, e pontos de tempo como a ordem dos planos de imagem. Verifique se a pilha de final representa corretamente os canais de cor, z-stack, e pontos no tempo da imagem original.
    5. Selecione o nome da imagem (Figura 2, destacou nome do arquivo à esquerda, seta # 2). Botão direito do mouse na imagem e / ou o campo da imagem, e uma das opções na parte inferior da lista, selecione "Propriedades". No pixel uM para (X) (Y) e (Z) de tamanho, introduzir as propriedades de imagem corretos notado acima.
  3. Fundo de subtração antes da análise de imagem. Correcção de fundo pode ser realizada de qualquer software de análise de imagem. Fundo Subtrair usando uma das duas opções.
    1. Opção 1: Selecione "Ação | Criar Nova | subtração de fundo" (Figura 2, seta # 1). Use a imagem de fundo adquiriu obtido no final da sessão de imagem descrito acima como a imagem de "Reference escuro" em "Ferramentas | Subtrair fundo".
    2. Opção 2: Inspecionar as áreas mais escuras nas imagens em que não há amostra, encontrar a média ou máxima luminosidade de pixels na região, ignorando quaisquer pixels excepcionalmente brilhantes que poderiam ser fluoróforo espúria, um pixel aleatoriamente brilhante, ou algum outro fenômeno. Selecione "Ações | Criar Nova | subtração de fundo". Utilize este brilho dos pixéis (feito negativo) como o deslocamento.
  4. Verifique se há registro de cor e corrigir, se necessário.
    1. Usando um controlo positivo, como microesferas fotografada, ou, colocalized GFP contendo vesículas e corante fluorescente (Figura 3) avaliar a necessidade de correção por mudar tanto o canal de cor vermelha ou verde e desligando. Visualmente, se o registro está desativado por até 1 pixel, que é visível a olho nu.
    2. Gerar uma correção de registro, selecionando "Ações | Criar Nova | correção do registro" (Figura 2, seta # 1) e use a caixa de diálogo para fazer ajustes. Após a conclusão de um novo item de pasta será exibida intitulado "correção do registro".
    3. Aplicar o registro a uma ou mais das imagens de interesse clicando no nome da imagem (Figura 2, destacou nome do arquivo à esquerda, seta # 2) e, em seguida, selecionando "Ferramentas | Registro Correct" (botão de ferramenta ao lado de Ações).
  5. Criar sequência de medição para analisar AT vesícula 1a R-GFP e intensidade de células inteiras seguintetratamento com Ang II.
    1. Selecione uma imagem (Figura 2, destacou nome do arquivo à esquerda, seta # 2) e desenhar uma região de interesse (ROI) em torno de uma única célula usando a ferramenta de freestyle região (Figura 2, seta # 3). Use o modo de Foco Estendida (2D, no menu suspenso na parte superior esquerda) para observar a célula como a ferramenta de corte só funciona na visualização 2D.
    2. Botão direito do mouse na imagem e selecione "Cortar a Selecção" e um novo item de imagem é gerada.
    3. Selecione a célula cortada clicando em seu nome e, em seguida, selecione a guia "Medição" acima (Figura 2, seta # 4).
    4. Para definir e medir vesículas internalizadas para GFP, arraste "localizar objetos" em "Finding" (Figura 2, seta # 5) na caixa de sequência (Figura 2, seta # 6).
    5. Defina "Find Objects" Channel para o canal de GFP.
    6. Abra as configurações (ícone da roda de caixa de diálogo em, seta # 6) e definir4; Threshold usando: "para SD e" limite inferior "a 6. Set" Tamanho mínimo do objecto "para 0 mm 3.
      NOTA: O limite SD inferior dependerá de experiências individuais. Confirmação visual de que os objetos corretos são thresholded é feita através da análise de diferentes pontos de tempo (Figura 2, seta # 7). A "Medição | Opções de Comentários" caixa de diálogo é usada para escolher a maneira que os objectos seleccionados limiarizadas são visualizados (Figura 2, seta # 8).
    7. Clique em "Measure" na caixa de diálogo "Find Objects" (Figura 2 seta # 6) e selecionar os canais e tipo de medidas. Normalmente, selecione "Todos os canais" e "intensidade e volume Medidas".
    8. Para definir o limiar e filtros para a identificação de toda a célula e para medir a intensidade total de GFP, repita os passos acima (5.5.4 - 5.5.8), utilizando os seguintes parâmetros: SD 0 e "tamanho mínimo de objeto" a 2 μ; m 3 na segunda caixa de diálogo "Encontrar Objectos" para identificar células utilizando GFP (Figura 2, a seta # 9)
    9. Arraste "Filter População" em "filtragem" para a caixa de sequência sob população 2 (segunda caixa "Encontrar objetos", Figura 2, seta # 9). Seleccione "Volume (mm 3> 100).
    10. Visualmente garantir que apenas um objecto é identificado. Toda a célula deve ser thresholded e todos os outros objectos separados por filtração. O parâmetro "Filter" (s) pode precisar de ajuste se a célula é pequeno, por exemplo.
    11. Uma vez que a medida foi padronizado, guardar o protocolo com o botão direito na imagem e selecione "Salvar Protocolo", a fim de reutilizar ( "Restaurar Protocolo"). O protocolo também podem ser exportados para fornecer um registro no mesmo subdiretório como a imagem.
    12. Passe para "Faça Medição", selecionando "Medidas | Faça item Measurement" (Figura 2 , seta # 8) ou para a direita clicando na imagem e selecione "Fazer Medição" e "Todos os pontos temporais".
    13. Digite o nome da medição correta (copiar e colar a partir da imagem é conveniente) eo código de análise ou data (uma adição útil para fins de registro) e selecione "Todos os pontos temporais". Um novo item da planilha será criada abaixo da imagem. Manter os nomes dos arquivos concisa.
  6. Analisar e exportar os dados.
    1. Clique no nome do arquivo planilha e selecione a guia "Analisar". Determinar se voxels saturadas estão presentes pela primeira selecionar "Restringir Análise para:", selecione População 2 (a célula).
    2. clique com o botão direito do campo sob a guia "Analisar" e na caixa de diálogo em "analisar estes dados:", selecione "Max ([canal de cor GFP])"; em "resumidos por:", selecione "Média ([canal de cor GFP]"; e em "Organizar os dados por:" e "Linha" selecionar "Ponto de tempo" e click "OK".
      NOTA: Se os dados contém pixels saturados (por exemplo, 65.536 para a de 16 bits ou 4096 para 12-bit), a análise não serão precisos (ele irá subestimar o conteúdo da vesícula). Desconsidere essa célula para análise. Se não saturado, prossiga para a próxima etapa.
    3. Em seguida, sob a guia "Raw" e, em seguida, na guia "Análise" e botão direito do mouse os dados encontrar "Restringir Análise para:", selecione População 1 para vesículas ou População 2 para toda a célula.
    4. Em "analisar estes dados:", selecione "Sum" (canal de cor GFP); em "resumidos por:", selecione "Sum"; e, em "Organizar os dados por:" e "Linha" selecionar "Ponto de tempo" ou "Time Relativa" e clique em "OK". seleções de análise podem ser salvas e reutilizadas.
    5. Selecionar e copiar / colar diretamente do software de imagem quantificação para uma planilha em branco ou exportar os dados da planilha com o botão direito do datum e selecionando Salvar como arquivo .csv. A medição da intensidade de células inteiras serão incluídos com medições de cada vesícula na população por isso não deixe para identificar e separá-lo das vesículas.
      NOTA: Depois de o desenho dos dados, o aumento na fluorescência total de GFP contido no interior de vesículas aumenta rapidamente. Fotobranqueamento, se ocorrer, é detectada como a perda de intensidade total de GFP de células ao longo do tempo.
  7. Criar sequência de medição para analisar GFP presente em lisossomos.
    1. Nos Localizar Objetos (População 1), conjunto "Find Objects" canal para o canal vermelho e no ícone de roda dentro dessa caixa de diálogo indicada pela seta # 6 (Figura 2) Conjunto "Threshold usando:" para SD e "limite inferior" para 6. Defina "tamanho mínimo do objecto" a 0,017 mm 3.
      NOTA: O limite SD inferior dependerá de experiências individuais. confirmação visual de que os objetos corretos estão sendo thresholded deve ser feita por exameining diferentes pontos de tempo. A "Medição | Opções de Comentários" caixa de diálogo é usada para escolher a maneira que os objectos seleccionados limiarizadas são visualizados (Figura 2, seta # 8).
    2. Clique em "Measure" em "encontrar" objetos "de diálogo (Figura 2 seta # 6) e selecionar os canais e tipos de medições. Normalmente," Todos os canais "e" intensidade e volume Medidas "são selecionados.
    3. Para População 2, as definições de uso idêntico ao utilizado para identificar a célula transfectada que expressa toda a 1A R-GFP (5.5.9).
    4. Se várias células incluindo células não transfectadas (vesículas com corantes fluorescentes positivas) estão presentes, o desbaste da célula na primeira fase da análise é crítica. Em alternativa, o uso de "compartimentalizar" deve ser utilizado para limitar a identificação de lisossomas na célula transfectada que expressa pelo 1a R-GFP. Lisossomos só deve ser identificado dentro da célula GFP enão a partir de células próximas, untransfected.
    5. Analisar e exportar dados como acima.
      NOTA: Um exemplo de células de limiar definido e vesículas é mostrado na Figura 4.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Neste conjunto representativo de experiências, as células HEK foram transfectadas com o receptor de angiotensina tipo 1a (AT 1a R-GFP) construção (E1,2,3-AT 1a R) clonado no plasmídeo pEGFP-N2 13. Imagens de lapso de tempo de HEK foram adquiridos e jogado como um filme (Veja imagens de células vivas 1 e imagens de células vivas 2 filmes). Os filmes e fotografias mostram que após estimulação do ligando, a

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Experimentos preliminares aqui apresentados mostram que ao longo de um curso de tempo bastante curto de 24 min, nenhuma mudança significativa na prestação de AT 1a R-GFP para os lisossomos ocorreu. Em geral, a entrega de receptores internalizados para os lisossomas pode ocorrer tão cedo quanto 15-20 min. Esta experiência é consistente com a hipótese de que a maior parte da AT internalizado 1a R é voltado para grandes perinucleares, endossomas. A prova de que, pelo menos, alguns em 1a R c...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

O trabalho de pesquisa apresentado neste manuscrito foi apoiado pela concessão R01 HL121456-01A1 para Kathryn Sandberg. Este trabalho foi apoiado além da disponibilidade de uma Leica SP8 AOBS na Microscopia e recursos partilhada Imagem (MISR) a Georgetown University Medical Center, que é parcialmente financiado pelo P30-CA051008 dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos da América. Agradecemos Leica assistência imagem SP8 por Peter Johnson, eo uso da Zeiss LSM880 no laboratório de Thomas Coate, do Departamento de Biologia da Universidade de Georgetown com a ajuda de imagens fornecido pela Alma Arnold da Carl Zeiss Microscopia LLC. O conteúdo deste manuscrito é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Angiotensina II (Ang II)Sigma-AldrichA9525 
Meio Modified Eagle de Dulbecco (DMEM 1x)Gibco -ThermoFisher Scientific11960-044Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar 
Soro Fetal Bovino (FBS)Sigma-AldrichF2442Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar
Penicilina Estreptomicina (Estreptococo Caneta)Gibco -ThermoFisher Scientific15140-122Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco (life technologies)25030-081Quente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso
Rim Embrionário Humano (HEK)-293 célulasAmerican Type Culture Collection (ATCC) CRL-1573 Número depassagem 5 - 12
Nunc Lab-Tek II com câmara 1.5 Sistema de Lamínula AlemãoSigma-Aldrich155409
Lipofectamine 2000 Reagente de TransfecçãoThermoFisher Scientific11668019Loja em 4 ° C 
Opti-MEM, Soro Reduzido MédioGibco- ThermoFisher Scientific31985-070Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
PBS 10x BioReagentes FisherBP3994Quente em 37 ° C banho-maria antes
do uso Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific31053-028Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Sondas moleculares LysoTracker Red DND-99-ThermoFisher ScientificL7528Armazene as alíquotas no escuro a -20 ° C . 
Volocity Ver. 6.3 Software de análise de imagemMódulos de visualização e quantificaçãoPerkinElmerPara análise de imagens 3D de pilhas de imagens
Leica SP8 AOBSMicroscópio confocal de varredura a laserLeica MicrosystemsPara coleta de imagens
Zeiss LSM 880Microscópio confocal de varredura a laserCarl ZeissPara coleta de imagens

Referências

  1. Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
  2. Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
  3. Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
  4. Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
  5. Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206(2008).
  6. Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003(2010).
  7. Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
  8. Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
  9. Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
  10. Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
  11. Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26(2014).
  12. Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613(2016).
  13. Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
  14. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  15. Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
  16. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
  17. Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
  18. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Tr fego do Receptor de AngiotensinaC lulas HEK 293Receptores Marcados com GFPColocaliza o Lisoss micaAn lise de Imagem 3DImagens de Time LapseInternaliza o do ReceptorMicroscopia Fluorescente

Artigos relacionados