Artigo de método

Um glóbulo vermelho simples método de lise para o estabelecimento de linhas celulares linfoblastóides B

DOI:

10.3791/55191

⸱

14 de janeiro de 2017

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1Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

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Um método simples de lise de glóbulos vermelhos para o estabelecimento de B-LCLS foi desenvolvido com alta eficiência de imortalização, requerendo uma pequena quantidade de sangue e de economia de tempo desde a iniciação à criopreservação.

Resumo

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Existem vários métodos para a transformação de linfócitos B pelo vírus Epstein Barr in vitro em linhagens celulares imortalizadas. Desenvolvemos um novo método com uma estratégia poderosa e simples para o estabelecimento de B-LCLs, o método de lise de glóbulos vermelhos. Este método simplificou o procedimento de separação de PBMC com remoção de glóbulos vermelhos e usou apenas 0,5 mL de sangue total para estabelecer linhagens celulares imortalizadas por EBV, que podem proliferar para grandes números de células em um período de tempo relativamente curto com uma taxa de sucesso de 100%. O método é simples, confiável, economiza tempo e é aplicável ao tratamento de um grande número de amostras clínicas.

Introdução

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As células B em repouso podem ser transformadas pelo vírus Epstein-Barr (EBV) in vitro em linhagens celulares linfoblastóides B de proliferação ativa (B-LCLs). As B-LCLs são semelhantes às células germinativas em diferenciação e desenvolvimento, e a taxa de mutação somática das B-LCLs foi de apenas 0,3%1, com alteração genética e fenotípica insignificante. Portanto, os B-LCLs, como substitutos das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), aceleraram substancialmente o progresso do estudo genômico, transcriptômico e proteômico de doenças associadas ao EBV2,3. Além disso, os B-LCLs também têm importante aplicação na triagem de anticorpos monoclonais4,5.

Vários métodos foram desenvolvidos para a imortalização de linfócitos B pelo EBV. Os procedimentos mais comuns incluem o isolamento de linfócitos B e o uso de linhagens celulares B95-8 para produzir EBV infeccioso. Do isolamento à transformação, esses métodos são divididos em três estratégias. Os linfócitos são separados do sangue fresco por centrifugação por gradiente de densidade e transformação de EBV diretamente6-8, denominado método de separação por gradiente de densidade neste estudo. No entanto, outras técnicas superam a dificuldade de envio de sangue fresco e utilizam um procedimento para congelamento de linfócitos purificados e subsequente descongelamento e infecção por EBV9-11. O sangue total criopreservado também pode ser usado para o isolamento e transformação de linfócitos B12,13. Além da centrifugação do gradiente de densidade para separar os linfócitos B, alguns pesquisadores usam um classificador magnético de células para selecionar os linfócitos B12. No entanto, a separação magnética é um processo caro, complexo e demorado. Embora esses métodos sejam úteis para imortalizar linfócitos B com alta taxa de sucesso, a necessidade de tratar um grande número de amostras clínicas e o volume relativamente pequeno de sangue exigem um método mais simples para o estabelecimento de uma linhagem celular permanente.

Outro método menos comumente usado é usar sangue total como fonte de células nucleadas para infecção por EBV e o estabelecimento de B-LCLs. Esses métodos simplificam a técnica omitindo o procedimento de separação. Apenas uma pequena quantidade de sangue total, fresco14 ou congelado15,16, é suficiente para obter as linhagens celulares. Infelizmente, há uma grande variabilidade no sucesso dos documentos15,16 e de vários de nossos testes de validação. Além disso, as colônias transformadas dificilmente são reconhecidas ao microscópio por causa das grandes impurezas contaminantes. Assim, é necessário um método mais confiável para a transformação.

Com base nas considerações acima, desenvolvemos um novo método para estabelecer B-LCLs sem purificação prévia dos linfócitos, denominado método de lise de glóbulos vermelhos. Este método é conveniente, economiza tempo e é aplicável a um grande número de amostras. Apenas 0,5 mL de sangue total foi suficiente para obter B-LCLs que são facilmente obtidos de bebês e idosos sem prejudicar significativamente sua saúde.

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Protocolo

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Este estudo foi aprovado pelo Comitê do Instituto de Genética e Biologia do Desenvolvimento de Ética e o protocolo segue as diretrizes institucionais para o bem-estar humano.

1. Preparação de vírus EB

  1. No dia 1, descongelar células B95-8 e cultura em 6 ml de RPMI completo 1640, suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 2 mM de L-glutamina, e antibióticos (100 ug / ml de estreptomicina, 100 U / mL de penicilina) numa balão de cultura T25. Colocar o frasco de cultura em 5% de CO2 a 37 ° C.
  2. No dia 2, observar a morfologia das células sob um microscópio. As células estão em boas condições quando eles são brilhantes e redondos. Adicionar 10 ml de meio completo RPMI 1640.
  3. No dia 4, adicionar 10 mL de meio fresco completo RPMI 1640, e depois transferir para um balão de cultura T75.
  4. No dia 8, adicionar 20 mL de meio completo RPMI 1640.
  5. Manter as células durante 8 dias sem a adição de meio fresco, ou seja, inanição.
  6. No dia 16, células observarobservada sob o microscópio. Recolher as células num tubo de centrífuga de 15 mL, 12 mL / tubo.
  7. Cryo-preservar a -80 ° C durante 1 h, e depois descongelar rapidamente a 37 ° C. Repetir 3 vezes até que as partículas de vírus são libertados a partir das células.
  8. Centrifugar a 240 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
  9. Filtra-se o sobrenadante através de um filtro de 0,22 um, alíquota, 12 mL / tubo, e armazenar a -80 ° C.

2. Tratamento de Sangue Total com Glóbulo Vermelho Tampão de Lise

  1. Adicionar 0,5 ml de sangue total anticoagulado por EDTA · K 2 para um tubo de 15 mL.
  2. Coloque 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (filtrada por filtro de 0,22? M e descongeladas à temperatura ambiente antes da utilização) a todo o sangue e misture bem. Coloque a mistura à temperatura ambiente durante 4 min. Em seguida, adicionar 5-7 mL de PBS 1x rapidamente para a reacção parada.
  3. Centrifugar a 240 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Os glóbulos brancos precipitará no fundo do tubo.
  4. Descartar o sobrenadante e lava-se a precipitação por adição de 7 ml 1640 de base. Centrifugar durante 5 minutos a 240 xg à temperatura ambiente. Repita duas vezes.
  5. Ressuspender o sedimento celular em 300 uL meio de transformação (meio RPMI 1640, contendo 20% de soro fetal de bovino e 10 ug / mL de f ito-hemaglutinina (PHA)).

Infecção 3. EBV

  1. Adicionar 60 uL de 20 ug / mL de ciclosporina A (CsA) para a suspensão de células.
  2. Descongelar rapidamente uma aliquota de EBV, a 37 ° C. Adicionar 240 uL de EBV para a suspensão de células.
  3. Misturar bem e coloque a suspensão de células para uma placa de 96 poços, 200 ul por poço. Para evitar a evaporação, adicionar 200 ul de 1x PBS a cada poço em torno da placa de 96 poços. Colocar a placa num incubador de CO2 a 5% a 37 ° C.

4. Expansão e Criopreservação de B-LCLS

  1. Mudar metade do meio, uma vez por semana durante o primeiro mês após a infecção por EBV. Apenas um laye de espessurar de fragmentos celulares é visível ao microscópio no dia 7 (Figura 2). Após um mês de infecção por VEB, os agregados de células linfoblastóides são visíveis sob uma espessa camada de fragmentos de células sob o microscópio (Figura 2).
  2. Mudar metade do meio a cada 3 dias até que os agregados de células são claramente visíveis ao microscópio (Figura 2). Tipicamente, este processo demora entre 10 a 20 dias.
  3. Depois de se misturar, pipetar as células e transferir para a placa de 24 poços. Dobrar o volume de meio de cultura com RPMI 1640 completo, enquanto ele fica amarelo. Este processo depende da taxa de crescimento celular.
  4. Posteriormente, a transferência das células para balão de cultura T25. O dobro do volume de meio de cultura, uma vez que se torna amarela até que o volume do meio expande-se para 10 - 15 mL.
  5. Mudança de meio 24 horas antes da congelação. suspensão de células Centrifugar durante 5 minutos a 240 x g. Contar as células com um contador de células e congelamento a uma densidade de 5-10 x 10 6 / mL em FRsolução estoque ozen contendo 90% de FBS e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar a uma taxa de 1 ° C por minuto a -80 ° C e, em seguida, transferir directamente em azoto líquido.

5. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazólio (MTT) 17

  1. Prepara-se uma suspensão de células individuais B-LCLS com o meio 1640 contendo soro bovino fetal a 10%. Semente de 3 x 10 4 culas por po em placas de 96 poços, 100 ul por poço.
  2. Colocar a placa em 5% de CO2 a 37 ° C durante 12-16 h.
  3. Adicionar MTT (5 mg / mL) aos poços em que as células estão a crescer e manter ao abrigo da luz durante 4 h a 37 ° C.
  4. placa de células Centrifugar durante 10 minutos a 168 x g.
  5. Remover o sobrenadante e adicionar 100 ul por poço de DMSO.
    NOTA: Tenha cuidado. Não toque nos corante cristais em forma de agulha.
  6. Agitar a placa durante 10 minutos a baixa velocidade para dissolver completamente os cristais.
  7. absorção medida a 570 nm porutilizando um espectrofotómetro de microplacas.

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Resultados

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Durante o processo de transformação, as modificações morfológicas das células são visualizados por microscopia de luz (Figura 2). Pequenos grupos de células foram claramente visíveis com o método de separação por gradiente de densidade depois de 7 dias de infecção, ao passo que apenas uma camada de espessura de fragmentos celulares são visíveis a partir do método de lise de glóbulos vermelhos. No entanto, grupos de células linfoblastóides são visíveis sob a espessa camad...

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Discussão

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Relata-se o desenvolvimento de um novo método para imortalizar células B humanas a partir de sangue total por lise de células vermelhas do sangue, e a sua viabilidade celular estabelecida de B-LCLS foi avaliada pelo ensaio de MTT. Os resultados mostraram que a viabilidade da célula de B-LCLS estabelecidos pelo método da lise de células vermelhas do sangue é muito maior do que a do método de separação por gradiente de densidade. A principal vantagem do método de lise de glóbulos vermelhos é que é simples e não requer um ...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelos principais projetos da Academia Chinesa de Ciências (KFZD-SW-205), sistema de suporte tecnológico de recursos biológicos estratégicos da Academia Chinesa de Ciências (CZBZX-1).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CentrífugaTechcompCT6TCentrifugação
Automatizada Contador de Células Countstar  IC 1000Para contagem de células 
Espectrofotômetro de Microplacas EpochBioTek InstrumentsSN263839Para medir a absorbância
Cluster de cultura de células de 96 poçosCorning Incorporated3599Placas de poliestireno
Cluster de cultura de células de 24 poçosCorning Incorporated3524Placas de poliestireno
25 cm2 frasco de cultura de célulasNest707001Poliestireno& nbsp;
FBSGibco10270Componente de B-LCLs médios
RPMI Medium 1640Gibco31800-022Para B-LCLs médios
L-Glutamina   Amresco0374Componente do meio B-LCLs
100x estreptomicina solução de penicilina BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Componente do meio B-LCLs
Ficoll paque plusGE  Saúde17-1440-03Para isolamento in vitro de linfócitos
PHA-MSigmaL8902Para estimular a proliferação de linfócitos
Ciclosporina ACayman  Químico12088Para inibir o efeito de citotoxicidade das células T
Tampão de lise de glóbulos vermelhosTiangenRT122-01Para lisar glóbulos vermelhos
MTTAmresco0793Para a detecção de viabilidade celular
DMSOSigmaD2650Para congelar células

Referências

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