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Artigo de método

Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis ​​e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca

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DOI:

10.3791/55192

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14 de fevereiro de 2017

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1Department of Intensive Care Medicine, University Hospital Aachen, 2Institute of Biochemistry and Molecular Biology, University Hospital Aachen, 3Department of Radiology, German Cancer Research Center, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Aachen, 5Department of Vascular Biology, Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), Klinikum der Universität München, 6Deutsches Zentrum für Herz-/Kreislaufkrankheiten (DZHK), Munich Heart Alliance

Neste artigo

Resumo

As células progenitoras endoteliais (CPE) são crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquémicos. Este método descreve o isolamento de EPCs humanos a partir de sangue periférico, bem como a identificação do seu potencial migratório contra amostras de soro de pacientes de cirurgia cardíaca.

Resumo

As células progenitoras endoteliais (CPE) são recrutadas a partir da medula óssea em condições patológicas como a hipóxia e são crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquémicos. A origem, classificação e caracterização de EPCs são complexas; Não obstante, dois sub-tipos importantes de EPCs foram estabelecidas: os chamados "early" EPCs (posteriormente referido como primeiros-EPCs) EPCs e tardio-excrescência (late-EPCs). Eles podem ser classificados pelo propriedades biológicas, bem como pela sua aparência durante a cultura in vitro. Enquanto EPCs "precoces" aparecem em menos de uma semana depois de a cultura de células mononucleares derivadas de sangue periférico em meios-CE específico, EPCs de fim de conseqüência pode ser encontrado após 2-3 semanas. EPCs Late-desdobramento ter sido reconhecido como estando directamente envolvido na neovascularização, principalmente através da sua capacidade de se diferenciar em células endoteliais maduras, enquanto que "cedo" EPCs expressar vários fatores angiogênicos como endógenaous carga para promover a angiogénese de um modo parácrino. Durante miocárdio a isquemia / reperfusão (I / R), vários factores controlar o homing de CPE para as regiões de formação de vasos sanguíneos.

Factor de inibição de migração de macrófagos (MIF) é uma citocina pró-inflamatória e ubiquamente expresso quimiocina-e como foi recentemente descrito como a função do regulador chave da migração EPCs em concentrações fisiológicas 1. Curiosamente, MIF é armazenado em piscinas intracelulares e pode rapidamente ser liberado na corrente sanguínea após vários estímulos (por exemplo, enfarte do miocárdio).
Este protocolo descreve um método para o isolamento seguro e cultura de início-EPCs a partir de sangue periférico humano adulto com base na selecção de células CD34-positivas com a cultura subsequente em meio contendo factores de crescimento endoteliais em placas revestidas com fibronectina para utilização em ensaios in vitro de migração contra amostras de soro dos pacientes cirúrgicos cardíacos. Além disso, oinfluência migratória de MIF em quimiotaxia de EPCs em comparação com outras citocinas de estimulação de angiogénese bem conhecido é demonstrada.

Introdução

As células progenitoras endoteliais (CPE) estão em circulação no sangue humano e têm a capacidade de se diferenciarem em células endoteliais 2. Eles participam na vasculogénese e são capazes de minimizar o dano causado por ferimentos inflamação e isquemia / reperfusão (I / R) de várias maneiras, 3 4. Por exemplo, EPCs mostram níveis elevados de enzimas antioxidantes intracelular, tal como a catalase, glutationa peroxidase ou superóxido dismutase de manganês (MnSOD) 5. A elevada resistência contra o estresse oxidativo permite EPCs para funcionar em microambientes com espécies elevados reactivas de oxigénio (ROS) após a lesão isquêmica 6. Estudos anteriores indicaram que também o número de CPE pode ser correlacionada com a reparação vascular e que um número reduzido de circulantes EPCs prevê a ocorrência de eventos cardiovasculares 7,class = "xref"> 8. No entanto, uma definição clara de um EPC ainda não foi encontrado. Até agora, não existe um marcador da superfície celular específico ou fenótipo consistente para CPE e estas células são muito raros no sangue periférico 9. Um EPC humana deve ser considerada como uma célula de circulação com a capacidade de contribuir para a reconstrução do endotélio lesionado e novas estruturas vasculares.

Uma maneira de isolar e caracterizar EPCs é através da adesão à fibronectina. Deste modo, a capacidade destas células é utilizado para mostrar uma aderência superior à fibronectina pratos revestidos em comparação com um tipo de colagénio, por exemplo, 3, 10, 11. No entanto, outros descobriram que o plaqueamento de células mononucleares em pratos revestidos com fibronectina sem qualquer passo de purificação anterior ou ainda leva a colónias incluindo células progenitoras mielóides, monócitos e linfócitos T 12, 13, 14. Além disso, neste caso, as plaquetas podem contaminar a fracção de células mononucleares (MNC) e transferir, assim, proteínas de membrana de plasma de todas as células aderentes 15.

Além da caracterização através de ensaios in vitro de adesão, uma combinação de diferentes marcadores de superfície de células é utilizado para descrever um tipo de célula considerado como um EPC. Neste caso, após a adesão mediada por fibronectina, as células são analisadas quanto ao atributos de tipo endotelial. Neste processo, os dois marcadores associados às células endoteliais, de lipoproteínas acetiladas de baixa densidade (AcLDL) e vascular do receptor do factor de crescimento endotelial 2 (VEGFR-2, KDR), desempenham um papel. As células endoteliais e macrófagos foram mostrados para tomar-se especificamente AcLDL em um processo chamado de "via celular sequestrante" 16. Outra proteína marcadora é KDR como o principal receptor de VEGF em endotelialAs células 17. No entanto, como EPCs em geral, são cultivadas em meio suplementado com factores de crescimento endoteliais e soro fetal de vitela, é possível que os macrófagos, que também pode ter sido erroneamente isolado, exibem um perfil de marcadores de tipo endotelial. Como foi mostrado anteriormente, se cultivadas em um meio com ar-endotelial, macrófagos expressam proteínas "específico-endoteliais" 18.

Em geral, existem duas categorias de EPCs dentro mais subtipos, os quais podem ser encontrados no sangue ou ser cultivadas in vitro. EPCs final-excrescência (late-EPCs) aparecem após 2-3 semanas de cultura. Estas células são integrados mais rápido para uma monocamada de células endoteliais da veia umbilical humana e pode formar tubos capilares 19. Além disso, os chamados "Early-EPCs" circulam no sangue para cerca de uma semana e agir de uma maneira mais passiva através da realização moléculas angiogénicas, tais como crescimento endotelial vascularfator (VEGF), ou CXCL8 19. Os pacientes com doença arterial coronariana (DAC) mostrou valores significativamente mais baixos de early-EPCs em comparação a um grupo controle sem DAC 20. Curiosamente, o mesmo grupo demonstrou valores mais elevados de final-EPCs em comparação com um grupo de controlo. Outro estudo mostrou que early-EPCs proteger CPE diferenciadas da apoptose em condições oxidantes, de uma forma parácrina 6. Portanto, os primeiros EPCs pode proporcionar efeitos protectores relevantes através da migração de outras células de uma forma automática ou parácrina dentro do sangue periférico.

Este protocolo descreve um método para purificar primeiros-EPCs em primeiro lugar isolar as PBMC-fracção a partir de sangue periférico humano e, subsequentemente, isolar as células CD34 + a partir de PBMC-fracção para limpar esta suspensão de células a partir de células não desejadas. O CD34 é um marcador, o qual é utilizado para o isolamento de células-tronco hematopoiéticas humanas 9 . Em seguida, as células CD34 + são cultivadas em superfícies de cultura de tecidos revestidas com f ibronectina. Depois de três dias, o meio é mudado, perdendo assim todas as células não-aderentes. Finalmente, CPE isoladas são coradas para verificar a absorção de AcLDL e a presença de células endoteliais como KDR-marcador usando células activadas por fluorescência (FACS). Como um marcador adicional, analisamos molécula endotelial de adesão celular das plaquetas (PECAM-1, CD31), que também ocorre em células endoteliais.

Restauração do tecido do miocárdio danificado ou infartados pela maior recrutamento de EPCs pertence às estratégias de tratamento intensamente investigadas em doenças cardiovasculares. No entanto, a tradução de resultados experimentais para a prática clínica é ainda difícil, dado o complexo interacção celular no corpo humano durante várias condições fisiopatológicas. Além disso, o miocárdio I / R lesões desencadear uma secreção excessiva de diversas citoquinas, hormonas e FAC crescimento res, que controlam a homing de EPCs a regiões de formação de vasos sanguíneos 13. Tal como já foi mostrado, CXCL8, derivado de células do estroma fator 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF e factor inibidor da migração de macrófagos (MIF) estão significativamente aumentados em amostras de soro após lesão miocárdica de I / R 1. Entre esses fatores, MIF é uma citocina quimiocinas-like pleiotropic com características predominantemente pró-inflamatórias. Em contraste com o seu nome histórico, MIF tem funções pró-migratórios, actuando como uma verdadeira quimiocina em vários tipos de células de 1, 21, 22. Processos de recrutamento celular de MIF-mediadas foram ligados ao receptores de quimioquinas CXCR4 e CXCR2, que MIF se liga e activa de uma forma não-cognato 21. De nota, EPCs expressar ambos estes receptores na sua superfície, o qual, adicionalmente, tornam-se-reguladas sob condições hipóxicasass = "xref"> 23, 24. Além disso, evidências acumuladas sugerem que MIF tem um efeito global cardio-protector durante a lesão de I / R do coração 22, 25, 26. Neste contexto, foi ainda demonstrado que MIF pode apoiar a neovascularização durante o estresse hipóxico que é de particular relevância, quando se analisam os mecanismos de recuperação limitadas do miocárdio lesado 27. Anteriores estudos in vitro e experiências em modelos pré-clínicos de rato fornecida primeira evidência sobre o papel da MIF no EPCs recrutamento 4. De nota, MIF também é uma proteína de carga proeminente de EPCs que pode ser introduzida durante o recrutamento EPCs dentro de sites isquêmicas 28. No entanto, estudos em ambientes clínicos, em especial em comparação com outros (angiogênicas) citocinas séricas permanecem ainda desconhecidos.

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Protocolo

Sangue para o isolamento de EPCs foi obtido de voluntários saudáveis ​​após consentimento informado, de acordo com o comitê de ética local. As amostras de soro usados ​​nos ensaios de migração foram obtidas de pacientes submetidos à cirurgia cardíaca convencional com o uso de circulação extracorpórea (CEC). Os critérios de exclusão foram operações de emergência, gravidez conhecida ou suspeita, do doente idade inferior a 18 anos, e falha na obtenção de consentimento informado. As amostras de soro foram desenhados para além das medições de rotina clínica (imediatamente antes da cirurgia e imediatamente após a reperfusão do miocárdio / abertura de aorta de pinçamento) e subsequentemente armazenado a -80 ° C até análise final. O (Comissão de Ética, RWTH Aachen University) de revisão institucional aprovou este estudo. Os pacientes apresentaram média de idade de 68,6 anos e um peso médio de 81,7 kg. doenças pré-existentes foram: hipertensão (65%), doença pulmonar crônica (19%), arteriopatia cardíaca extra (16%), disfunção cerebral (6%), angina instável (3%), enfarte do miocárdio recente (28% dentro de 90 d), doença renal crónica (14%), doença do fígado (2%) e a diabetes (34%).

1. Revestimento da garrafa T75:

  1. Prepare 5 mL de solução de fibronectina (1 mg de fibronectina humana diluída em 15 ml de água ultrapura) por frasco T75.
  2. Adicionar a solução para um frasco T75 e esperar até que a água é evaporada. Para evitar quaisquer interrupções desnecessárias durante o processo de isolamento devido à evaporação, efectuar este processo previamente (por exemplo durante a noite) e à temperatura ambiente. Esta solução dá 4,44 g de fibronectina / cm 2.
  3. Prepara-se o meio de crescimento celular endotelial MV2, completando a forma MV2 basal com suplementos de factor de crescimento fornecidos pelo fabricante.

2. Isolamento de células progenitoras endoteliais (CPE) a partir de 60 mL de sangue:

NOTA: Como o CD34 positivo selecção de cocktails umND as esferas magnéticas estão comercialmente disponíveis em um kit de selecção combinado, não há concentrações fornecidas pelo fabricante. No entanto, cerca de 100 ul do anticorpo são suficientes para o processamento de até 5 x 10 8 células. As pérolas magnéticas são diluídos em água, o dextrano-revestido e cerca 5,000x menor em comparação com outros grânulos disponíveis comercialmente. Para mais informações, consulte instruções do fabricante.

  1. Misture sangue (com ou sem anticoagulantes) 1: 1 com Ca 2+ Mg 2 + livre de PBS.
  2. Adicionar 15 ml de solução de gradiente de densidade por tubo de 50 mL. Para mais informações, consulte instruções do fabricante.
  3. Lentamente camada do sangue diluído em cima da solução de gradiente de densidade.
  4. Centrifugar as amostras a 2500 xg durante 30 minutos com a aceleração lenta e sem travagem.
  5. Recolher cuidadosamente a camada de creme leucocitário de cada tubo (Figura 1) usando uma pipeta de plástico estéril e colocá-lo em outro tubo.Evitar a recolha da solução de gradiente de densidade. O rendimento esperado PBMC é de aproximadamente 3-4 x 10 6 células / ml de sangue.

figure-protocol-1
Figura 1: Densidade centrifugação em gradiente de Revestimento na Ficoll Solution Bbuffy. É mostrado o resultado da centrifugação em gradiente de densidade a 2500 xg durante 30 minutos na solução de gradiente de densidade. Descrito são os eritrócitos e granulócitos (vermelho), a fracção de células mononucleares (camada branca), plasma (amarela), e a solução do gradiente de densidade (esbranquiçado). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Dilui-se a fracção de células mononucleares de sangue periférico com pelo menos 3 volumes de PBS e misturar. Centrifuga-se a temperatura ambiente durante 15 min a 200 x g.
  2. Repita o passo 2.6 duas vezes.
  3. Aspirar o sedimento celular sobrenadante e ressuspender em 5 mL de meio MV2.
  4. Adicionar 100 uL de anticorpo CD34 humano (suficiente para o processamento até 5 x 10 8 células) por buffy coat utilizado e girar durante 15 min a 37 ° C com 5% de CO 2.
  5. Adicionar 50 uL de pérolas magnéticas revestidas com dextrano por buffy coat utilizado e girar durante 10 min a 37 ° C com 5% de CO 2.
  6. Após a incubação, transferir a suspensão para tubos de FACS com um máximo de 3 mL em cada tubo. quantidades superiores não será permitida com o imã.
  7. Insira tubo (s) FACS para o ímã (s) e esperar por 5 min.
  8. Elimine o sobrenadante sem puxar os tubos de FACS fora do ímã.
  9. Ressuspender as células em cada tubo de FACS com 3 mL de meio MV2 fora do magneto.
  10. Repita os passos 2,12-2,14 duas vezes.
  11. Puxe os tubos FACS fora dos ímãs e ressuspender as células em 3 mL de meio MV2.
  12. Transferir a suspensão de células em pré-revestido T75 flasks e adicionar 17 mL de meio MV2 por frasco.
    NOTA: O meio deve ser mudado após 3 dias. Após uma semana, as células mostram estruturas fusiformes (Figura 2) e está pronto para usar. Para uma negligência do isolamento ver Figura 3.

figure-protocol-2
Figura 2: Imagem microscópica de isolado EPCs. É mostrada uma imagem representativa de isolado early-EPCs em um frasco T75 antes do destacamento. Aparente é a estrutura fusiforme do EPCs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-3
Figura 3: Fluxograma Mostrando o Procedimento de EPC isolamento. Retratado é um esquema, mostraing os passos individuais do protocolo de isolamento EPC. Para um protocolo mais detalhado ver Secção 2 na seção de protocolo.

3. Migration Assay

  1. Remover o meio das CPE no frasco T75.
  2. Lavar com 5 ml PBS, agitando-o com cuidado.
  3. Remover PBS e adicionar 5 ml de solução de separação celular comercial. Espere até que as células são separadas (verifique sob um microscópio). Acelerar o destacamento tocando cuidadosamente o fundo do frasco.
  4. Quando as células são separadas, adicionar rapidamente MV2 5 ml de meio completo e transferir a suspensão de células para outro tubo.
  5. Centrifugar a 2.000 xg durante 5 min.
  6. Ressuspender as células em 5-10 ml de PBS e centrifugar novamente a 2.000 xg durante 5 min.
  7. Repita o passo 3.6.
  8. Ressuspender o sedimento de células em meio de fome MV2 (50.000 células são necessários em 75 uL por poço transmigração).
    NOTA: Qual sistema de migração é necessária depende do tipo de célula e ensaio. Existem diff diâmetros erent poros e tamanhos de placa (número de poços). Para EPCs um tamanho de poro de 5 um de 96 sistema assim é óptima.
  9. Preparar a placa de migração através da adição de 235 ul da amostra de soro (soro diluído a 1: 5 em meio de fome MV2) para dentro da câmara inferior (Figura 4).

figure-protocol-4
Figura 4: Ensaio de migração de uma câmara de Boyden modificada. É mostrada a concepção geral de uma câmara de Boyden modificada. As inserções de cultura de células (= câmara superior) estão indicados a azul escuro e são inseridos dentro da câmara inferior. A parte inferior (mas não as paredes) destas inserções representa o sistema de filtro incluindo os poros. (A) mostra a configuração no ponto de tempo zero. (B) depois de um ponto de tempo escolhido, as células são migraram através do filtro para um estímulo.fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Adicionar a pastilha pouco antes de adicionar a solução de células.
  2. Adicionar 75 ul da solução de células (células = 50.000) para dentro da câmara superior.
  3. Deixe o EPCs migrar durante 3 h a 37 ° C e 5% de CO 2 (tempo de migração depende do tipo de célula e o sistema).
    1. Para evitar artefactos auto-fluorescência do soro, quantificar as células migraram por tirar fotos do bem sob um microscópio e contar as células utilizando o software semi-automático "ImageJ".
  4. Retire a câmara superior (contendo todas as células não migrados).
  5. Adicionar 70 ul solução de paraformaldeído a 3,6%, incluindo de corante Hoechst (diluído 1: 1000). A placa pode ser armazenada a 37 ° C e 5% de CO 2 durante a noite.
  6. Centrifugar a placa em breve para obter todas as células em um mesmo plano focal a 2.000 xg por 1-2 min.
  7. Take 5 imagens por well (Figuras 5 e 6) com uma ampliação de 100x.

figure-protocol-5
Figura 5: Esquema mostrando a posição das fotos tiradas. O esquema ilustra a posição das cinco fotografias tiradas, os quais são necessários para a determinação das células que migraram, em relação ao poço. As fotos são tiradas para contar as células e calcular um valor médio para cada poço. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Imagem microscópica para a quantificação celular. É mostrada uma imagem representativa, que foi feita para quantificação celular. As células foram coradas e fixadas USIng de corante Hoechst, em 3,6% de paraformaldeído. Os pontos representam fixadas e coradas células progenitoras endoteliais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Contar as células que migraram, utilizando o software semi-automático "ImageJ" pelo Instituto Nacional de Saúde.

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Resultados

Caracterização de isolados células endoteliais progenitoras

Em primeiro lugar, a absorção de AcLDL foi verificado, bem como a expressão de KDR, e CD31 sobre a superfície da população de células isoladas. Como mostra a figura 7A, 85,1% dos EPCs isoladas mostrou uma absorção de AcLDL e expressou CD31. As Figuras 7b e 7c mostram, adicionalmente, uma distribuição homogénea de ambos o...

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Discussão

A primeira parte deste estudo incluiu o isolamento de EPCs humanos do sangue periférico de voluntários saudáveis ​​para permitir uma avaliação completa do sangue de pacientes de cirurgia cardíaca. Portanto, uma centrifugação em gradiente de densidade foi realizada para separar a fracção de PBMC a partir de plasma, granulócitos e eritrócitos. Para remover a maioria dos contaminantes plaquetas, célula esta fracção foi submetida a curto e lavagem lenta os passos 29, 30.<...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores não têm confirmações.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
FibronectinaBiochrom AGL7117Revestimento de frascos T-75
Aqua ad iniectabiliaFresenius Kabi
Meio de crescimento de células endoteliais MV2Promo CellC-22221
Meio de crescimento de células endoteliais MV2 SupplementMixPromo CellC-39226
Ficoll-Paque plusGE Healthcare17-1440-03Centrifugação por densidade
EasySep kit de seleção positiva CD34 humanaStemcell Technologies18056Isolamento de células CD34+
Ímã EasySepStemcell Technologies18000
AccutaseSigma-AldrichA6964-100MLDesprendimento de células
Corning HTS transwell 96 suportes bem permeáveisSigma-AldrichCLS3387-8EASistema de migração
Solução HoechstThermoFisher33342Coloração de células migradas
ImageJInstitutos nacionais de saúdexxxContagem de células migradas

Referências

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