Artigo de método

Modelos agudos e crônicos de hiperglicemia no peixe-zebra: um método para avaliar o impacto da hiperglicemia na neurogênese e a biodisponibilidade das moléculas radiomarcadas

DOI:

10.3791/55203

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26 de junho de 2017

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1UMR 1188 Diabète athérothombose Thérapie Réunion Océan Indien (DéTROI), Saint-Denis de La Réunion, France, Université de La Réunion, INSERM, 2RIPA (Radiochimie et Imagerie du Petit Animal), Cyclotron de la Réunion Océan Indien CYROI, 3CHU de La Réunion

Neste artigo

Resumo

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Este trabalho descreve métodos para estabelecer modelos de hiperglicemia aguda e crônica no peixe-zebra. O objetivo é investigar o impacto da hiperglicemia em processos fisiológicos, como a neurogênese constitutiva e induzida por lesão. O trabalho também destaca o uso de peixe zebra para seguir moléculas radiomarcadas (aqui, [ 18 F] -FDG) usando PET / CT.

Resumo

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A hiperglicemia é um importante problema de saúde que leva à disfunção cardiovascular e cerebral. Por exemplo, está associado a problemas neurológicos aumentados após o AVC e é mostrado que prejudica os processos neurogênicos. Curiosamente, o peixe-zebra adulto surgiu recentemente como um modelo relevante e útil para imitar a hiperglicemia / diabetes e investigar a neurogênese constitutiva e regenerativa. Este trabalho fornece métodos para desenvolver modelos de hipertensão do peixe-zebra para explorar o impacto da hiperglicemia na proliferação de células cerebrais sob condições de reparação homeostática e cerebral. A hiperglicemia aguda é estabelecida usando a injeção intraperitoneal de D-glucose (2,5 g / kg de peso corporal) em peixe zebra adulto. A hiperglicemia crônica é induzida por imersão de peixe zebra adulto em D-glucose (111 mM) contendo água por 14 dias. As medidas do nível de glicose no sangue são descritas para essas diferentes abordagens. Métodos para investigar o impacto da hiperglicemia na constitutiva aE a neurogênese regenerativa, descrevendo a lesão mecânica do telencefalo, dissecando o cérebro, encaixando parafina e seccionando com um micrótomo, e realizando procedimentos de imuno-histoquímica, são demonstrados. Finalmente, o método de utilização do peixe zebra como modelo relevante para o estudo da biodistribuição de moléculas radiomarcadas (aqui, [ 18 F] -FDG), utilizando PET / CT também é descrito.

Introdução

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A hiperglicemia é definida como níveis excessivos de glicose no sangue. Embora possa refletir uma situação de estresse agudo, a hiperglicemia também é uma condição que muitas vezes leva a um diagnóstico de diabetes, uma doença crônica da secreção de insulina e / ou resistência. Em 2016, o número de adultos que vivem com diabetes atingiu 422 milhões em todo o mundo e, a cada ano, 1,5 milhão de pessoas morrem desta doença, tornando-se um importante problema de saúde 1 . De fato, a diabetes descontrolada leva a vários distúrbios fisiológicos que afetam o sistema cardiovascular, os rins e os sistemas nervoso periférico e central.

Curiosamente, a hiperglicemia aguda e crônica pode alterar a cognição e contribuir com demência e depressão 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Além disso, a admissão de pacientes wA hiperglicemia tem sido associada a piores resultados funcionais, neurológicos e de sobrevivência após o AVC isquêmico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Também foi demonstrado que a hiperglicemia / diabetes afeta a neurogênese adulta, um processo que leva à geração de novos neurônios, impactando a atividade das células-tronco neurais e a diferenciação neuronal, migração e sobrevivência 2 , 12 .

Em contraste com os mamíferos, os peixes teleósticos, como o peixe-zebra, exibem uma atividade neurogênica intensa em todo o cérebro e exibem uma excelente capacidade de reparo cerebral na idade adulta 13 , 14 , 15 , 16 . Notavelmente, tais capacidades são possíveis devido à persistência de neuCélulas do caule / progenitor ral, incluindo glia radial e neuroblastos 17 , 18 , 19 . Além disso, o peixe-zebra surgiu recentemente como um modelo para estudar distúrbios metabólicos, incluindo obesidade e hiperglicemia / diabetes 20 , 21 , 22 .

Embora o peixe zebra seja um modelo bem reconhecido de hiperglicemia e neurogênese, poucos estudos investigaram o impacto da hiperglicemia na homeostase cerebral e na função cognitiva 12,23 . Para determinar o impacto da hiperglicemia na proliferação de células cerebrais induzidas por constituição e lesão, foi criado um modelo de hiperglicemia aguda através da injeção intraperitoneal de D-glucose. Além disso, um modelo de hiperglicemia crônica foi reproduzido através da imersão de peixes em água suplementada wIth D-glucose 12 . Zebrafish exibe muitas vantagens na pesquisa. Eles são baratos, fáceis de aumentar e transparentes durante os primeiros estágios de desenvolvimento, e seu genoma foi sequenciado. No contexto deste trabalho, eles também apresentam várias vantagens adicionais: (1) eles compartilham processos fisiológicos semelhantes com os seres humanos, tornando-os uma ferramenta crítica para a pesquisa biomédica; (2) permitem a rápida investigação do impacto da hiperglicemia na homeostase cerebral e neurogênese, dada a sua atividade neurogênica generalizada e forte; E (3) eles são um modelo alternativo, permitindo a redução do número de mamíferos utilizados na pesquisa. Finalmente, o peixe-zebra pode ser usado como modelo para testar a biodistribuição de moléculas radiomarcadas e potenciais agentes terapêuticos utilizando PET / CT.

O objetivo geral do procedimento a seguir é documentar visualmente como configurar modelos de hiperglicemia aguda e crônica no peixe zebra, usar zebRape para avaliar a remodelação cerebral em condições hiperglicêmicas e monitorar moléculas radiomarcadas (aqui, [ 18 F] -FDG) usando PET / CT.

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Protocolo

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O peixe-zebra de tipo selvagem adulto ( Danio rerio ) foi mantido sob condições padrão de fotoperíodo (14/10 h luz / escuro) e temperatura (28 ° C). Todas as experiências foram conduzidas de acordo com as Diretrizes da França e da Comunidade Européia para o Uso de Animais em Pesquisa (86/609 / EEC e 2010/63 / EU) e foram aprovadas pelo Comitê de Ética local para experimentação animal.

1. Estabelecimento de um modelo de hiperglicemia aguda em peixe-zebra

  1. Prepare uma solução-mãe de tricaína (MS-222) dissolvendo 400 mg de pó de tricaína em 97,9 mL de água e 2,1 mL de tampão Tris / HCl 1 M (pH 9). Ajuste o pH para 7 e uma alíquota para armazenamento a -20 ° C.
  2. Prepare um anestésico para o peixe-zebra adulto, colocando 5 mL de tricaína (solução de reserva) em 100 mL de água de peixe (concentração final de tricaína: 0,02%).
  3. Transfira um peixe-zebra (3 a 6 meses) de seu tanque até o anestésico até parar de se mover.
  4. RéMova o peixe usando uma pipeta cortada e rapidamente secá-lo em papel de seda absorvente.
  5. Pesar o peixe.
  6. Prepare uma seringa de D-glucose dissolvida em 1X PBS e injete 50 μL de D-glucose (2,5 g / kg de peso corporal).
    NOTA: Por exemplo, um peixe de 0,6 g receberá 50 μL de solução de D-glucose / PBS a 3%.
  7. Coloque o peixe nas costas e insira a agulha da seringa na cavidade intraperitoneal.
  8. Injele lentamente a solução D-glucose / PBS e, em seguida, coloque o peixe de volta na água.
  9. Verifique o peixe até que ele se recupere completamente. Devolva-o ao tanque até chegar o tempo necessário para a medição da glicemia.
    NOTA: A glicemia é medida 1,5 h após a injeção.

2. Estabelecimento de um modelo de hiperglicemia crônica em peixe-zebra

  1. Prepare um tanque de 2 L de água de peixe limpa.
  2. Dissolver 40 g de D-glucose no 2 L de água dos peixes para uma concentração final de D-glucose de111 mM.
  3. Mergulhe 5 a 7 peixes zebra adultos na água contendo D-glicose.
  4. Substitua a água dos peixes D-glucose a cada 2 dias, a fim de evitar o crescimento de bactérias ou outros microrganismos.
  5. Após 14 dias de tratamento, coloque o peixe brevemente em água fresca para remover a D-glicose do corpo antes de tomar a medição do nível de glicose no sangue.

3. Medição de níveis de glicose no sangue no peixe-zebra

  1. Cubra o peixe com gelo para eutanásia rápida.
    NOTA: Não use uma overdose de tricaína, pois isso induz grandes variações nos níveis de glicose no sangue. Não deixe o peixe no gelo por muito tempo, pois isso irá fazer coagular o sangue.
  2. Limpe o peixe com papel de tecido absorvente para remover toda a água e para evitar qualquer diluição do sangue durante a medição da glicemia.
  3. Retire um olho usando fórceps de dissecação e aguarde até que a cavidade do olho esteja cheia de sangue.
  4. Coloque uma tira de teste em um glucômetro e euLimpe a tira na cavidade do olho.
  5. Medir os níveis de glicose no sangue.

4. Analisando a proliferação de células cerebrais após hiperglicemia

  1. Soluções e buffers: requisitos e preparação
    1. Prepare 1 L de 1x PBS adicionando 100 mL de PBS 10x a 900 mL de H 2 O (dH 2 O) destilado e misture.
    2. Prepare 1x PBS com detergente a 0,2% (PBS-T, veja a tabela de materiais).
      NOTA: Para preparar 1 L de PBS-T, adicione 2 mL de detergente (veja a Tabela de Materiais ) a 1 L de PBS.
    3. Prepare uma série de etanol (100% x 2, 95%, 85%, 70%, 50% e 30%) e 0,85% de NaCl.
    4. Prepare o tampão de bloqueio: PBS-T contendo 0,5% a 1% de leite em pó.
      NOTA: Para preparar 200 mL de tampão de bloqueio, adicione 2 g de leite em pó a 200 mL de PBST.
    5. Preparar tampão de recuperação de antígeno, citrato de sódio.
      NOTA: Para preparar 1 L de tampão de citrato de sódio, adicione 2,94 g de citrato de sódio triSal de sódio desidratado para 1 L de dH 2 0. Ajuste o pH para 6 antes do enchimento para 1 L.
    6. Preparar um tampão de paraformaldeído-PBS a 4%, adicionando 4 g de paraformaldeído a 100 mL de 1x PBS. Aquecer sob agitação a 58-60 ° C até dissolver completamente.
  2. Preparação de amostras para imuno-histoquímica: fixação e desidratação
    1. Depois de medir o nível de glicose no sangue, separe a cabeça do corpo cortando a cabeça atrás das brânquias.
      Nota: Alternativamente, o cérebro pode ser extraído e congelado diretamente para outras experiências, como a extração de mRNA.
    2. Corrigir as cabeças durante a noite a 4 ° C em paraformaldeído a 4% dissolvido em PBS (PFA-PBS).
    3. No dia seguinte, lave rapidamente as cabeças no PBS.
    4. Dissecê o cérebro com cuidado usando um microscópio. Enxaguar as cabeças fixas com PBS e usar uma agulha para proteger uma cabeça sob um microscópio de dissecação. Remova os olhos e a parte superior do crânio com fórceps. CarefuRetire o cérebro e coloque-o em 1x PBS.
    5. Lavar sucessivamente os cérebros fixos com 1x PBS durante 30 min, NaCl a 0,85% durante 30 min, EtOH a 70% / NaCl 0,85% (v / v) durante 15 minutos, EtOH a 70% durante 15 min (duas vezes), EtOH a 85% durante 20 Min, EtOH a 95% durante 20 minutos e 100% de EtOH durante 20 min (duas vezes). Incubar durante a noite numa solução final de EtOH a 100%.
      NOTA: Os cérebros desidratados podem permanecer durante vários meses em 100% de EtOH a 4 ° C antes da incorporação de parafina.
  3. Preparação de amostras para imuno-histoquímica: preparação de tecidos para inclusão de parafina
    1. Coloque os cérebros em um copo de vidro pequeno.
      NOTA: Não use um recipiente de plástico, pois o tolueno pode danificar alguns plásticos.
    2. Remova o etanol e substitua-o por tolueno, pois o cérebro deve ser totalmente recuperado pelo tolueno. Execute dois banhos de 30 min de tolueno.
    3. Remova o tolueno e coloque os cérebros em uma cassete de encaixe. Coloque a cassete fechada em torneiras da série de parafina derretida às 58-60 ° C (30 min em cada copo de parafina). Ative as pinças de inclusão de aquecimento. No final dos banhos de parafina, tire a cassete e despeje uma parafina líquida em um molde.
    4. Despeje a parafina derretida em um molde e coloque o cérebro no interior. Oriente o cérebro usando a pinça de inclusão de aquecimento, usando a orientação ântero-posterior do cérebro como guia. Deixe a parafina endurecer na parte de refrigeração da máquina de encaixe.
    5. Por razões técnicas, posicione os cérebros ao longo do eixo ântero-posterior. Depois de desmoldar o bloco de parafina, coloque-o e conserte-o em uma cassete, com a parafina derretida na orientação apropriada para permitir a seção transversal.
    6. Insira o bloco de parafina no braço do microtome. Corte secções de 50 μm de espessura até atingir o nível de amostra do cérebro. Corte o bloco de parafina para obter um trapézio e ajuste a espessura de seccionamento para 7 μm. Recolher as fitas de parafina usando pincéis e colocá-las no pap pretoEr. Corte-os suavemente a cada 3 a 4 seções.
    7. Coloque um slide sobre uma placa de aquecimento e cubra-a com água com dH 2 O.
    8. Posicione suavemente as fitas cortadas na água. Remova a água com papel de tecido absorvente quando as fitas de parafina estiverem suficientemente espalhadas / desdobradas. Remova as últimas gotas mecanicamente. Remova a água das lâminas e deixe secar durante pelo menos 3 h no prato aquecido em torno de 30-40 ° C.
  4. Procedimento de imuno-histoquímica
    1. Remova a cera de parafina colocando secções em três recipientes de xileno por 7 minutos cada.
    2. Rehydrate as secções colocando as lâminas em dois recipientes de EtOH a 100% durante 2 minutos cada, seguindo-se os banhos de EtOH a 95%, EtOH a 85%, EtOH a 70% e EtOH a 30% durante 30 s cada. Finalmente, coloque as lâminas em dH 2 O brevemente e duas vezes em PBS por 5 minutos cada.
    3. Realize a recuperação do antígeno incubando as seções em tampão de citrato em um microondas (2 min a 500 W) atéO buffer começa a ferver. Deixe as lâminas se recuperar à temperatura ambiente durante 15 min.
    4. Lave três vezes em PBST, 5 min cada, e bloqueie as secções durante 45 minutos em PBST contendo 1% de leite. Incubar durante a noite com anticorpos primários ( por exemplo, antígeno nuclear celular proliferante (PCNA) para coloração celular proliferativa, 1/100) diluído em tampão de bloqueio ( ou seja , PBST, 1% de leite).
    5. Lavar três vezes em PBST, 5 minutos cada, e incubar as secções durante 90 min com anticorpos secundários apropriados ( p . Ex., Alexa Fluor 488; 1/200) de cabra anti-mouse, diluídos em tampão de bloqueio e com DAPI (1/500).
    6. Lave três vezes em PBST, 5 min cada, e monte as lâminas com meio de montagem fluorescente (veja a tabela de materiais).
    7. Analisar a coloração usando um microscópio de epifluorescência e / ou confocal.
    8. Quantificar a proliferação de células cerebrais em pelo menos três seções cerebrais sucessivas de uma região de interesse em pelo menos trêsImal.
      NOTA: Alternativamente, a incorporação do cérebro pode ser feita em agarose para proceder à cirurgia de circulação vibratoma e à imuno-histoquimica de flutuação livre, conforme descrito anteriormente 24 .
  5. Estudando o impacto da hiperglicemia nos mecanismos de reparação do cérebro
    NOTA: Alternativamente, a investigação do reparo do cérebro sob hiperglicemia aguda e crônica pode ser realizada após ferimento na ferida da cebola do telencéfalo, conforme descrito anteriormente 24 , 25 , 26 . Em resumo:
    1. Anestesiar peixe zebra adulto com tricaína.
    2. Coloque o peixe sob um microscópio de dissecação com luz.
    3. Segure o peixe com uma mão.
    4. Por outro lado, insira uma seringa de 30 G verticalmente através do crânio na região medial do hemisfério telencefálico direito.
    5. Coloque o peixe de volta na água do peixe fresco, água suplementada com D-glicose (111MM), ou controle a água dos peixes. Permita que os peixes sobrevivam por 7 dias após a lesão.
      NOTA: Consulte a etapa 4 para o resto do procedimento.

5. Imaging a Biodistribuição de Moléculas Radiomarcadas por PET / CT em Peixe Zebra: Fluorodesoxiglucose ([18F] -FDG) para Analisar o Metabolismo da Glucose

  1. Prepare uma seringa de 50 μL contendo 20 MBq de uma solução salina de [18F] -FDG.
  2. Coloque a seringa atrás da tela de proteção contra radiação.
  3. Anestesiar um peixe zebra adulto com tricaína.
  4. Coloque o peixe atrás de uma tela protetora de radiação.
  5. Injete [18F] -FDG na cavidade intraperitoneal. Limpe o local da injeção com um pequeno pedaço de papel de seda para evitar a detecção de [18F] -FDG residual que poderia escorrer da barriga do peixe.
  6. Use um calibrador de radioisótopos para medir a atividade restante contida na seringa e no tecido para calcular a dose injetada exata.
  7. Coloque o peixe em umEw, pequeno pedaço de tecido absorvente embebido com tricaína e gentilmente envolvê-lo. Coloque o peixe com o tecido absorvente na cama do PET / CT.
  8. Insira a cama no sistema de imagem PET / CT e comece a aquisição.
  9. Proceda para realizar a aquisição PET / CT.
  10. No final do procedimento, coloque o peixe de volta em uma pequena quantidade de água fresca de peixe.
    NOTA: Alternativamente, após a injeção [18F] -FDG, o peixe pode ser colocado de volta em uma pequena quantidade de água fresca por 10 min a 1 h para facilitar a difusão de [18F] -FDG antes de anestesiar o peixe novamente para PET / Imagem de CT.

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Resultados

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Utilizando os procedimentos descritos neste artigo, a injeção intraperitoneal de D-glucose (2,5 g / kg de peso corporal) foi realizada em peixes zebra adultos e levou a um aumento significativo nos níveis de glicose no sangue 1,5 h após a injeção ( Figura 1A ). 24 horas após a injeção, os níveis de glicose no sangue foram semelhantes entre os peixes D-glucose e PBS injetados 12 . Para o tratamento crônico, o peixe-zebra foi imerso em ...

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Discussão

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Este trabalho descreve vários métodos para estabelecer modelos agudos e crônicos de hiperglicemia no peixe zebra. As principais vantagens desses procedimentos são as seguintes: (1) permitem uma redução no número de mamíferos utilizados para pesquisas, (2) são simples de configurar e de implementar rapidamente, e (3) são econômicas. Portanto, esses modelos permitem a investigação do impacto da hiperglicemia em um grande número de animais para estudar seu impacto em diferentes processos fisiológicos, incluindo a aterotrom...

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Divulgações

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Nenhum conflito potencial de interesse foi divulgado.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos muito a Direção de Uso do Numérico (DUN) da Universidade La Reunião para editar o vídeo (especialmente Jean-François Février, Eric Esnault e Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan para a narração, Mary Osborne-Pellegrin para revisão A voz-sobre e a plataforma CYROI. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Universidade La Réunion (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), do Conselho Regional da Reunião, da União Européia (CPER / FEDER) e da associação Philancia. A ACD é destinatária de uma bolsa de bolsa do Ministério da Educação Nacional, da Enseignement Supérieur e da Pesquisa, Universidade da Reunião (contrato de doutorado).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa Luer-Lok de 1mLBD, EUA309628
4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sigma-Aldrich, AlemanhaD8417
7 mL bijou container plain labDutscher, França080171
D-glicoseSigma-Aldrich, Alemanha67021
Câmera digitalLife Sciences, JapãoHamamatsu ORCA-ER
Moldes de base descartáveis Simport, CanadáM475-2
Burro anti-coelho Alexa fluor 488Life Technologies, EUAA21206
Centro de incorporaçãoThermo Scientific, EUAShandon Histocentre 3
Microscópio de fluorescênciaNikon, JapãoEclipse 80i
Fluorodesoxiglicose (18F-FDG)Cyclotron, França
Tira de teste de glicosímetroLifeScan, FrançaOne-Touch 143 Ultra
Goat anti-mouse Alexa fluor 594Life Technologies, EUAA11005
In-Vivo Sistema de ImagemTriFoil Imaging, CanadáTriumph Trimodality 
MicrotomeThermo Scientific, EUAMicrom HM 355 S
Mouse monoclonal anti-PCNADAKO, EUAclone PC10
Paraformaldeído (PFA)Sigma-Aldrich, AlemanhaP6148-500G
Coelho policlonal anti-GFAPDAKO, EUA
Bancada de secagem de lâminasEletrotérmica, EUAMH6616
Cloreto de sódioSigma-Aldrich, AlemanhaS9888
Citrato de sódio sal trissódico desidratado Prolabo, França27833.294
Agulha estérilBD Microlance 330 G 1/2 ; 0.3 mm&vezes; 13 mm
Student Dumont #5 FórcepsFine Science Tools91150-20
Tesoura cirúrgica StudentFine Science Tools91400-14
Superfros Plus Gold SlidesThermo Scientific, EUAFT4981GLPLUS
Microscópio cirúrgicoLeica, FrançaM320-F12
para incorporação de tecidosSimport, CanadáM490-10
Meio para incorporação de tecidosLeicaBiosystems, EUA39602004
TolueneSigma-Aldrich, Alemanha244511
Tricaine MS-222Sigma-Aldrich, AlemanhaA5040
Triton X100Sigma-Aldrich, AlemanhaX100-500 mL
Vectashield médio Vector Laboratories, EUAH-1000
XilenoSigma-Aldrich, Alemanha534056
Cepa de peixeAB
forte>Tampão de fosfato salino (10X PBS) pH 7,4 (para 1 litro)Para preparar 10X PBS, adicione os seguintes sais e complete para 1 litro com água
destiladaCloreto de potássio (MM : 74,55 g/mol): 2,00 gSigma-Aldrich, Alemanha746436<
em>Fosfato de potássio monobásico (MM: 136,09 g/mol): 2,40 gSigma-Aldrich, Alemanha795488
Cloreto de sódio (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g  Sigma-Aldrich, AlemanhaS9888
Fosfato de sódio dibásico (MM: 141,96 g): 14,40 gSigma-Aldrich, Alemanha795410
Z033429 <

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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