Este trabalho descreve métodos para estabelecer modelos de hiperglicemia aguda e crônica no peixe-zebra. O objetivo é investigar o impacto da hiperglicemia em processos fisiológicos, como a neurogênese constitutiva e induzida por lesão. O trabalho também destaca o uso de peixe zebra para seguir moléculas radiomarcadas (aqui, [ 18 F] -FDG) usando PET / CT.
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Artigo de método
Modelos agudos e crônicos de hiperglicemia no peixe-zebra: um método para avaliar o impacto da hiperglicemia na neurogênese e a biodisponibilidade das moléculas radiomarcadas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A hiperglicemia é um importante problema de saúde que leva à disfunção cardiovascular e cerebral. Por exemplo, está associado a problemas neurológicos aumentados após o AVC e é mostrado que prejudica os processos neurogênicos. Curiosamente, o peixe-zebra adulto surgiu recentemente como um modelo relevante e útil para imitar a hiperglicemia / diabetes e investigar a neurogênese constitutiva e regenerativa. Este trabalho fornece métodos para desenvolver modelos de hipertensão do peixe-zebra para explorar o impacto da hiperglicemia na proliferação de células cerebrais sob condições de reparação homeostática e cerebral. A hiperglicemia aguda é estabelecida usando a injeção intraperitoneal de D-glucose (2,5 g / kg de peso corporal) em peixe zebra adulto. A hiperglicemia crônica é induzida por imersão de peixe zebra adulto em D-glucose (111 mM) contendo água por 14 dias. As medidas do nível de glicose no sangue são descritas para essas diferentes abordagens. Métodos para investigar o impacto da hiperglicemia na constitutiva aE a neurogênese regenerativa, descrevendo a lesão mecânica do telencefalo, dissecando o cérebro, encaixando parafina e seccionando com um micrótomo, e realizando procedimentos de imuno-histoquímica, são demonstrados. Finalmente, o método de utilização do peixe zebra como modelo relevante para o estudo da biodistribuição de moléculas radiomarcadas (aqui, [ 18 F] -FDG), utilizando PET / CT também é descrito.
Introdução
A hiperglicemia é definida como níveis excessivos de glicose no sangue. Embora possa refletir uma situação de estresse agudo, a hiperglicemia também é uma condição que muitas vezes leva a um diagnóstico de diabetes, uma doença crônica da secreção de insulina e / ou resistência. Em 2016, o número de adultos que vivem com diabetes atingiu 422 milhões em todo o mundo e, a cada ano, 1,5 milhão de pessoas morrem desta doença, tornando-se um importante problema de saúde 1 . De fato, a diabetes descontrolada leva a vários distúrbios fisiológicos que afetam o sistema cardiovascular, os rins e os sistemas nervoso periférico e central.
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Protocolo
O peixe-zebra de tipo selvagem adulto ( Danio rerio ) foi mantido sob condições padrão de fotoperíodo (14/10 h luz / escuro) e temperatura (28 ° C). Todas as experiências foram conduzidas de acordo com as Diretrizes da França e da Comunidade Européia para o Uso de Animais em Pesquisa (86/609 / EEC e 2010/63 / EU) e foram aprovadas pelo Comitê de Ética local para experimentação animal.
1. Estabelecimento de um modelo de hiperglicemia aguda em peixe-zebra
- Prepare uma solução-mãe de tricaína (MS-222) dissolvendo 400 mg de pó de tricaína em 97,9 mL de água e 2,1 mL de tampão Tris / HCl 1 M (pH 9). Ajuste o pH para 7 e uma ....
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Resultados
Utilizando os procedimentos descritos neste artigo, a injeção intraperitoneal de D-glucose (2,5 g / kg de peso corporal) foi realizada em peixes zebra adultos e levou a um aumento significativo nos níveis de glicose no sangue 1,5 h após a injeção ( Figura 1A ). 24 horas após a injeção, os níveis de glicose no sangue foram semelhantes entre os peixes D-glucose e PBS injetados 12 . Para o tratamento crônico, o peixe-zebra foi imerso em .......
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Discussão
Este trabalho descreve vários métodos para estabelecer modelos agudos e crônicos de hiperglicemia no peixe zebra. As principais vantagens desses procedimentos são as seguintes: (1) permitem uma redução no número de mamíferos utilizados para pesquisas, (2) são simples de configurar e de implementar rapidamente, e (3) são econômicas. Portanto, esses modelos permitem a investigação do impacto da hiperglicemia em um grande número de animais para estudar seu impacto em diferentes processos fisiológicos, incluindo a aterotrom.......
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Divulgações
Nenhum conflito potencial de interesse foi divulgado.
Agradecimentos
Agradecemos muito a Direção de Uso do Numérico (DUN) da Universidade La Reunião para editar o vídeo (especialmente Jean-François Février, Eric Esnault e Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan para a narração, Mary Osborne-Pellegrin para revisão A voz-sobre e a plataforma CYROI. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Universidade La Réunion (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), do Conselho Regional da Reunião, da União Européia (CPER / FEDER) e da associação Philancia. A ACD é destinatária de uma bolsa de bolsa do Ministério da Educação Nacional, da Enseignement Supérieur e da Pesquisa, Universidade da Reunião (contrato de doutorado).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa Luer-Lok de 1mL | BD, EUA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma-Aldrich, Alemanha | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, França | 080171 | |
| D-glicose | Sigma-Aldrich, Alemanha | 67021 | |
| Câmera digital | Life Sciences, Japão | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Moldes de base descartáveis | Simport, Canadá | M475-2 | |
| Burro anti-coelho Alexa fluor 488 | Life Technologies, EUA | A21206 | |
| Centro de incorporação | Thermo Scientific, EUA | Shandon Histocentre 3 | |
| Microscópio de fluorescência | Nikon, Japão | Eclipse 80i | |
| Fluorodesoxiglicose (18F-FDG) | Cyclotron, França | ||
| Tira de teste de glicosímetro | LifeScan, França | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, EUA | A11005 | |
| In-Vivo Sistema de Imagem | TriFoil Imaging, Canadá | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, EUA | Microm HM 355 S | |
| Mouse monoclonal anti-PCNA | DAKO, EUA | clone PC10 | |
| Paraformaldeído (PFA) | Sigma-Aldrich, Alemanha | P6148-500G | |
| Coelho policlonal anti-GFAP | DAKO, EUA | ||
| Bancada de secagem de lâminas | Eletrotérmica, EUA | MH6616 | |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich, Alemanha | S9888 | |
| Citrato de sódio sal trissódico desidratado | Prolabo, França | 27833.294 | |
| Agulha estéril | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm&vezes; 13 mm | |
| Student Dumont #5 Fórceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Tesoura cirúrgica Student | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, EUA | FT4981GLPLUS | |
| Microscópio cirúrgico | Leica, França | M320-F12 | |
| para incorporação de tecidos | Simport, Canadá | M490-10 | |
| Meio para incorporação de tecidos | LeicaBiosystems, EUA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Alemanha | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Alemanha | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Alemanha | X100-500 mL | |
| Vectashield médio | Vector Laboratories, EUA | H-1000 | |
| Xileno | Sigma-Aldrich, Alemanha | 534056 | |
| Cepa de peixe | AB | ||
| forte>Tampão de fosfato salino (10X PBS) pH 7,4 (para 1 litro) | Para preparar 10X PBS, adicione os seguintes sais e complete para 1 litro com água | ||
| destiladaCloreto de potássio (MM : 74,55 g/mol): 2,00 g | Sigma-Aldrich, Alemanha | 746436< | |
| em>Fosfato de potássio monobásico (MM: 136,09 g/mol): 2,40 g | Sigma-Aldrich, Alemanha | 795488 | |
| Cloreto de sódio (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Alemanha | S9888 | |
| Fosfato de sódio dibásico (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Alemanha | 795410 |
Referências
- W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
- Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
- Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D.
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Reimpressões e permissões
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