Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Resumo

Aqui, apresentamos um método de montagem versátil que permite a imagem de lapso de tempo de longo prazo do desenvolvimento posterior do corpo de embriões vivos de peixe-zebra sem perturbar o desenvolvimento normal.

Resumo

embriões de peixe-zebra oferecer um sistema experimental ideal para estudar processos morfogenéticos complexas devido à sua facilidade de acessibilidade e transparência óptica. Em particular, o alongamento do corpo posterior é um processo essencial do desenvolvimento embrionário, através da qual múltiplos deformações tecido agir em conjunto para dirigir a formação de uma grande parte do eixo do corpo. A fim de observar esse processo por meio de imagens de lapso de tempo de longo prazo, é necessário utilizar uma técnica de montagem que permite um apoio suficiente para manter amostras na orientação correta durante a transferência para o microscópio e aquisição. Além disso, a montagem também deve proporcionar liberdade suficiente de movimento para a excrescência da região do corpo posterior, sem afectar o seu desenvolvimento normal. Finalmente, deve haver um certo grau de versatilidade do método de montagem para permitir a imagiologia em diversas imagem set-ups. Aqui, apresentamos uma técnica de montagem para a imagiologia do desenvolvimento de posterior elongatio corpon no peixe-zebra D. rerio. Esta técnica envolve a montagem de embriões de tal forma que as regiões da cabeça e do saco vitelino são quase inteiramente incluídas no agarose, deixando de fora região do corpo posterior para alongar e desenvolver normalmente. Vamos mostrar como isso pode ser adaptado para microscopia de luz folhas na vertical, invertida e vertical set-ups. Embora este protocolo centra-se na montagem de embriões para a imagem latente para o corpo posterior, poderia ser facilmente adaptado para a imagem ao vivo de vários aspectos do desenvolvimento do peixe-zebra.

Introdução

Posterior alongamento corpo é um processo essencial do desenvolvimento embrionário em que o embrião se estende de modo a formar uma grande parte do eixo do corpo. É um exemplo de um processo morfogenético complexo, através da qual vários comportamentos de células agir coordenadamente para gerar a morfogénese no nível de tecidos individuais. Estas deformações tecido diferencial, em seguida, actuar em conjunto para gerar o alongamento do corpo posterior em todo o nível da estrutura. Para entender como esses processos são controlados e coordenados durante o desenvolvimento, que deve ser capaz de seguir esses processos em múltiplas escalas (ou seja, no nível de ....

Protocolo

1. Preparação de Soluções e puxou vidro Needle

1. Adicione uma solução de estoque de 25x tricaina (3-amino éster de etilo do ácido benzóico, também chamado de acetato de 3-aminobenzoato de metilo) a 4 mg / mL em Tris 20 mM, pH 8,8 e trazer esta solução é a pH 7. alíquota, de 4 ml e armazenar a -20 ° C.
   NOTA: O tricaina anestésico actua preferencialmente nos canais de sódio dependentes da voltagem neurais bloqueando assim espasmos musculares e movimento ^6.
2. Adicione uma solução de trabalho de tricaina a uma concentração final de 0,17 mg / mL em meio de embrião E3. ⁷
   NOTA: Faça o tricaina so....

Resultados

O protocolo descrito acima detalha uma técnica versátil para a montagem de embriões de peixes-zebra para imagiologia de lapso de tempo de longa duração. Um exemplo disto é mostrado na Figura 2A e na animação / vídeo Figura 1. Os embriões foram injectados no estádio de uma célula com o ARNm que codifica a proteína fluorescente photoconvertible kikumeGR. Na fase de 15 somito eles foram montados como descrito acima e trabalhada durante 12 horas em um micros.......

Discussão

Esta técnica de montagem permite que embriões que permanecer estática durante a transferência para o microscópio e mais experimentos com imagens de lapso de tempo de longo prazo destinadas a seguinte alongamento do corpo posterior em várias escalas de comprimento. Além disso, é versátil na medida em que permite a imagem em microscopia invertida na vertical e fixados-ups, e uma sugestão é feita para como isto pode ser ainda adaptado para SPIM orientada verticalmente.

Um passo essencial no pre.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CONSUMÍVEIS
			10 mm. Vidro de cobertura nº 1.5
Capilares para agulhas de injeção	Sutter	BF 120-94-10	Usamos vidro de orosilicato com filamento, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, comprimento 10 cm. No entanto, as agulhas de filamento não são necessárias e a maioria das agulhas padrão de injeção deve funcionar.
Micro-bisturi	Feather	P-715	Micro Feather bisturi oftálmico
		Pipetas Pasteur	230 mm de comprimento
REAGENTES
Tricaína	Sigma-Aldrich	A5040
Agarose de baixo ponto de fusão	Sigma-Aldrich	A9414
< forte>EQUIPAMENTO
Pinça fina	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Extrator de agulhas	Sutter	P97	Extrator de agulha de filamento
de aquecimento Microscópio de dissecação binocular	Leica	S8 Apo

Pratos com fundo de vidro Mattek P35-1.5-10-C Placa de Petri de 35 mm, micropoço de descartável com cabo de plástico