Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia

Resumo

Este relatório descreve um protocolo de preparação de amostras e condições específicas de imagem para a realização de tomografia eletrônica de transmissão de varredura de espécimes biológicos espessos.

Resumo

Este relatório descreve um protocolo para preparar espécimes biológicos espessos para observação posterior usando um microscópio eletrônico de transmissão de varredura. Também descreve um método de imagem para estudar a estrutura 3D de espécimes biológicos espessos por tomografia eletrônica de transmissão de varredura. O protocolo de preparação da amostra é baseado em métodos convencionais nos quais a amostra é fixada usando agentes químicos, tratada com um agente contrastante de sal de átomo pesado, desidratada em uma série de banhos de etanol e embebida em resina. As condições específicas de imagem para observar amostras espessas por microscopia eletrônica de transmissão de varredura são então descritas. Seções da amostra são observadas usando um método de foco que envolve a coleta de várias imagens em vários planos focais. Isso permite a recuperação de informações em foco em várias alturas ao longo da amostra. Esse padrão de coleta específico é realizado em cada ângulo de inclinação durante a coleta de dados da tomografia. Uma única imagem é então gerada, mesclando as informações em foco de todos os diferentes planos focais. Um conjunto de dados clássico da série tilt é então gerado. A vantagem do método é que o alinhamento e a reconstrução da série de inclinação podem ser realizados usando ferramentas padrão. A coleta de imagens através da focal permite a reconstrução de um volume 3D que contém todos os detalhes estruturais da amostra em foco.

Introdução

Desde o início da década de 1970, a tomografia abordagens em microscopia electrónica de transmissão (MET) têm sido amplamente utilizados para a caracterização estrutural de espécimes biológicos ^{1, 2, 3.} O recurso de tomografia electrónico de transmissão mostrou que poderia ser usado para estudar uma vasta gama de estruturas biológicas em escala nanométrica, a partir da arquitectura das células e a ultra-estrutura de organelos para a estrutura dos complexos macromoleculares e as proteínas. No entanto, a tomografia electrónica de transmissão não pode ser usado para estudar amo....

Protocolo

Cuidado: Consulte as fichas de segurança (MSDS) dos vários reagentes antes de usá-los. Vários dos produtos químicos utilizados durante a preparação da amostra são tóxicas, cancerígenas, mutagénicas e / ou tóxicas para a reprodução. Use equipamento de protecção individual (luvas, jaleco, calças compridas e sapatos fechados) e trabalhar sob um exaustor durante o manuseio da amostra. Seccionamento da amostra com um ultramicrotome envolve o uso de instrumentos cortantes, e uso cuidadoso dessas ferramentas é obrigatória. Nos passos descritos abaixo, os autores assumem que a amostra é uma amostra de cultura de células. O protocolo pode necessitar de ser modificada de acord....

Resultados

Em nosso estudo, os elétrons foram acelerados a 200 kV na emissão de campo microscópio eletrônico de transmissão arma. As imagens foram coletadas no modo STEM BF usando um tempo de permanência de 20 uS. Quanto ao design do tilt-série através de-focal, descobrimos que os intervalos de focagem de 150 nm deram resultados satisfatórios para o estudo ultra-estrutural de uma amostra-even 750 nm de espessura biológica que a profundidade de campo-do feixe de elétrons foi apenas 3 nm-desde que us.......

Discussão

Neste artigo, apresentamos um protocolo de preparação da amostra convencional, juntamente com um guia passo-a-passo para a realização de análise 3D em amostras biológicas de espessura usando STEM tomografia meio-focal. Resina incorporação de espécimes biológicos tem sido usado por décadas ²⁶ e protocolos alternativos que são adaptados a diferentes tipos de amostras podem ser encontrados em toda a literatura ^27. Em contraste, a imagem espécimes de espessura em STEM usando m.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tampão fosfato Salino	Sigma-Aldrich	P4417
Etanol	Sigma-Aldrich	2860
Resina epóxi	EMS	14120
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148	Adicione pó de paraformaldeído ao PBS aquecido a aproximadamente 60 °C. Aumente o pH adicionando 1 N NaOH até que nenhum pó de PFA seja visível.
Glutaraldeído	Sigma-Aldrich	G5882
Tetróxido de Ósmio	EMS	19150
Acetato de Uranila	Sigma-Aldrich	73943
Cápsula de Gelatina	EMS	70110
Facas de corte e Histo	Distribuição LFG Facas		de diamante Diatomáceas
Microscopia eletrônica Grade de cobre Distribuição	LFG Caneta	de revestimento de grade G200-
	Microscópio