Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

Summary

Subretinal injeção tem sido amplamente aplicada em estudos pré-clínicos de terapia de reposição de células-tronco para degeneration macular age-related. Neste artigo visualizado, descrevemos uma técnica de injeção subretinal menos arriscado, reproduzíveis e precisamente modificados através da abordagem trans-escleral para entregar as células nos olhos de rato.

Abstract

Doenças degenerativas da retina, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI) são a principal causa de perda de visão irreversível em todo o mundo. AMD é caracterizada por degeneração de células epiteliais pigmento retinal (RPE), que são uma monocamada de células apoiando funcionalmente e anatomicamente, envolvendo em torno da retina neural. Tratamentos farmacológicos atuais para o não-neovascular AMD (AMD seco) apenas retardar a progressão da doença, mas não podem restaurar a visão, necessitando de estudos que visam identificar novas estratégias terapêuticas. Substituindo as células RPE degenerativas com promessa de porões de células saudáveis para tratar DMRI seca no futuro. Extensos estudos pré-clínicos de terapias de substituição de células-tronco para AMD envolvem o transplante de células-tronco derivadas de células de RPE no espaço subretinal de modelos animais, em que é aplicada a técnica de injeção subretinal. A abordagem mais utilizada nestes estudos pré-clínicos de animais é através da rota trans-escleral, que é dificultada pela falta de visualização directa da extremidade da agulha e muitas vezes pode resultar em danos na retina. Uma abordagem alternativa através do vítreo permite a observação direta da posição final da agulha, mas carrega um alto risco de traumas cirúrgicos como mais tecidos oculares são perturbados. Nós desenvolvemos um método modificado injeção trans-escleral menos arriscado e reprodutíveis que usa agulha definidos ângulos e profundidades com êxito e consistentemente fornecer células RPE no espaço subretinal rato e evitar danos excessivos da retina. Células entregadas desta forma tem previamente demonstradas para ser eficaz em ratos Royal College of Surgeons (RCS) pelo menos 2 meses. Esta técnica pode ser usada não só para o transplante de células, mas também para a entrega de pequenas moléculas ou terapias de gene.

Introduction

A retina humana situado na parte traseira as funções do olho como um tecido sensorial leve e desempenha um papel crítico na percepção de visão. Disfunção de células da retina ou morte celular, portanto, causa problemas de visão ou cegueira permanente. Distúrbios envolvendo a degeneração ou disfunção das células nas diferentes camadas da retina são conhecidos como doenças degenerativas da retina, entre os quais a AMD é o tipo mais comum e a principal causa de cegueira irreversível em idosos nos países desenvolvidos ^1,2. O processo patológico da AMD é associado com o acúmulo de "drusen" entre a camada RPE e memb....

Protocol

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) na Universidade Estadual de Nova York em Albany.

1. preparação pre-injeção

1. Preparação de uma suspensão de células de hRPESC-RPE
   Nota: Todas as seguintes etapas são executadas no capô de cultura de tecido estéril e familiaridade com técnica estéril básica é necessária.
   1. Isolar as células primárias hRPE de doador humano olhos com idades entre 50-90 anos e células de cultura em placas boas 24¹². Cryopreserve as células na passagem 1, conforme necessário e descongelam....

Results

Usando a técnica descrita neste artigo, nós consistentemente entregues células hRPESC-RPE no espaço subretinal de ratos RCS controlando precisamente a localização, ângulo e profundidade da inserção de agulha injector no tecido (figura 1B-D ). Imediatamente seguinte transplante, um exame de OCT foi realizado para observar o local da injeção e a bolha subretinal criado pelas células transplantadas. Avaliação de OCT pós-cirúrgica serve como uma ferramenta de.......

Discussion

A técnica de injeção subretinal descrita neste artigo é através da via trans-escleral, onde a agulha do injetor penetra as camadas externas (complexo de esclera-coroide-RPE) da parede do olho, sem prejudicar a retina neural ou perturbar a cavidade vítrea. Uma abordagem alternativa trans-vitreal tem um risco potencial de dano de lente, levando à catarata, desde que a lente dos roedores ocupa a maioria da cavidade vítrea. Comparado a esse método, nossa técnica é menos arriscada e faz com que o mínimo de trauma como a agulh.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% Tripsina-EDTA (1x)	Life Technologies	25200-072
DNAse I	Sigma	DN-25
1xDulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e Magnésio (1xDPBS-CMF)	Corning Cellgro	431219
Solução salina balanceada estéril (BSS)	Alcon	00065079550
Lavagem dos olhos estéril	Moore Medical	75519
Solução estéril de solução salina a 0,9%	Hospira	488810
Solução oftálmica de cloridrato de proparacaína (0,5%)	Akorn	17478026312
Solução oftálmica de tropicamida, USP (1%)	Bausch & Solução
, estoque USP (10%)	Bausch & Lomb	42702010305	Isso é usado para fazer 2,5% de fenileferina
Buprenex	Patterson	433502
dexametasona	APP Pharmaceuticals	63323051610
100% Etanol	Thermo Scientific	615090040
70% Etanol	Ricca Chemical Company	2546.70-5
Gel Lubrificante GenTeal Estéril	Novartis	78042947
Colírio Estéril Systane Ultra Lubrificante	Alcon	00065143105
células hRPESC-RPE	Não disponível comercialmente		Consulte a "Referência #12" para isolamento e manutenção de células.
Placas de 24 poços	Corning	3526
Tubos cônicos (15 ml)	Sarstedt	62554002
Tampa da microcentrífuga com anel de vedação	LPS inc	L233126
Tubos de microcentrífuga sem tampa (1,7 ml)	LPS inc	L233041
Centrífuga	Eppendorf	5804R
Toalhete estéril com álcool	McKesson	58-204
Aplicadores de ponta de algodão estéril	McKesson	24-106-2S
Lanças Weck-Cel estéreis	Beaver-Visitec International
Campos cirúrgicos estéreis	Gaze McKesson	25-515
	McKesson	16-4242
Seringa Nanofil (10 ul)	World Precision Instruments	Nanofil
Agulha chanfrada de calibre 33	World Precision Instruments	NF33BV-2
Agulhas de seringa de insulina calibre 31	Becton Dickinson	328418
Rato	Mundo Precision Instruments	555041FT
Tesoura de Mola Micro Dissecante Vannas	Roboz	RS-5602
Bomba de circulação de água T	Stryker	TP700
Almofada de aquecimento	Kent Scientific	TPZ-814
Sistema de anestesia animal	World Precision Instruments	EZ-7000
Balance	Ohaus	PA1502
Microscópio estéreo	Zeiss	Stemi 2000
Microscópio fonte de luz	Schott	ACE series
Sistema de Imagem Oftálmica de Domínio Espectral Bioptigen Envisu	Bioptigen	R2210
	Viscot Industries	1416S-100
Miniatura de Balança	Ted Pella Inc	13623
Lâmpada de Ponto de Aquecimento Infravermelho	EXO-TERRA	PT2144	Este é usado como uma lâmpada de aquecimento para animais durante a fase de recuperação pós-cirúrgica