Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

A retina humana situado na parte traseira as funções do olho como um tecido sensorial leve e desempenha um papel crítico na percepção de visão. Disfunção de células da retina ou morte celular, portanto, causa problemas de visão ou cegueira permanente. Distúrbios envolvendo a degeneração ou disfunção das células nas diferentes camadas da retina são conhecidos como doenças degenerativas da retina, entre os quais a AMD é o tipo mais comum e a principal causa de cegueira irreversível em idosos nos países desenvolvidos ^1,2. O processo patológico da AMD é associado com o acúmulo de "drusen" entre a camada RPE e membrana de Bruch a subjacente, que por sua vez prejudica o apoio da RPE da fisiologia fotoreceptor, levando à atrofia da retina neural e perda de visão^{3, 4,5}. Até agora, não existe cura para avançados (não-neovascular) AMD seco. O surgimento da terapia de células-tronco como um novo paradigma na medicina regenerativa traz a esperança de substituir as células RPE disfuncionais ou mortas com células-tronco derivadas de células saudáveis. De fato, estudos pré-clínicos extensivos de transplantar células (por exemplo, células-tronco embrionárias humanas)-tronco-células derivadas de RPE em modelos animais RPE-degenerativas têm sido realizados^6,7, alguns dos quais têm progredido para ensaios clínicos^8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Recentemente, uma fonte alternativa de células-tronco residentes na camada RPE humana, as células-tronco humanas RPE (hRPESCs), foi identificada pelo nosso laboratório e está sendo usada atualmente em estudos pré-clínicos de terapia de transplante de celular (hRPESC-RPE) de derivados-RPE hRPESC para AMD ^{10 , 11 , 12 , 13}.

A técnica de injeção subretinal é aplicada nos estudos pré-clínicos mencionados acima por vários grupos, incluindo o nosso grupo. Existem duas abordagens gerais para injeção subretinal em animais: trans-vitreal e trans-escleral. A abordagem trans-vitreal tem a vantagem de ser capaz de observar diretamente o fim da agulha que penetra no olho anterior, cruza a vitreal toda cavidade adjacente à lente e penetra a retina para trás para o olho para alcançar o apresentam o cirurgião espaço de^15,de^14,16. No entanto, exige perturbar a retina em dois locais (anteriores e posteriores), carrega o risco de danificar a lente e pode resultar em refluxo de células para o vítreo, quando a agulha é recolhida. Em contraste, a abordagem trans-esclera, em princípio, evita envolvimento da retina e vítreo e refluxo sai do olho. Em roedores pigmentadas, o cirurgião pode inicialmente observar a penetração da esclera, mas após a passagem para a coroide pigmentada, o fim da agulha não está visível. Sem observação directa, romper a retina é comum e pode resultar em dissecção da retina e entrega de células e/ou sangue para o vítreo. Além disso, porque a superfície do olho é curvo, é muito difícil saber qual agulha ângulos e profundidades são mais eficazes para a trans-escleral injeções.

Neste artigo visualizado, apresentamos um método de injeção subretinal trans-escleral informado pelo uso de avaliações pós-cirúrgicos com a tomografia de coerência óptica (OCT), que permite um exame detalhado do local da injeção. Nossa técnica de injeção trans-escleral utiliza locais definidos, ângulos e profundidades para agulhas de injeção produzir trauma cirúrgico muito baixo e alta confiabilidade. Aqui, demonstramos especificamente a injeção de células hRPESC-RPE no espaço subretinal do rato RCS, um modelo pré-clínico de AMD humana. Com este método de injeção, com sucesso e consistentemente foram entregues as células hRPESC-RPE no espaço de subretinal olhos de rato RCS com uma taxa de sucesso muito alta. Injeção de células anteriormente foi encontrada para resultar na preservação dos FOTORRECEPTORES RCS pelo menos 2 meses após injeção¹³. Este procedimento é realizado sob o microscópio de dissecação e é fácil de aprender. Requer duas pessoas (um cirurgião e assistente) para realizar a injeção e o tempo médio de injeção para cada animal é menos de 5 minutos. Os ângulos definidos e profundidades para agulhas de injeção tornam possível para os laboratórios, onde a OCT está indisponível, para alcançar o sucesso injeção subretinal. Ele permite acesso subretinal altamente reprodutível e pode ser usado não só para o transplante de células, mas também para terapias medicamentosas de entrega e gene.

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) na Universidade Estadual de Nova York em Albany.

1. preparação pre-injeção

1. Preparação de uma suspensão de células de hRPESC-RPE
   Nota: Todas as seguintes etapas são executadas no capô de cultura de tecido estéril e familiaridade com técnica estéril básica é necessária.
   1. Isolar as células primárias hRPE de doador humano olhos com idades entre 50-90 anos e células de cultura em placas boas 24¹². Cryopreserve as células na passagem 1, conforme necessário e descongelamento e cultura passagem 2 células (P2) para 4-5 semanas (figura 1A) para injeção.
   2. Remover o meio de cultura¹² e suavemente poços de lavar duas vezes com 500 µ l pré aquecido 1 X fosfato tamponada salina de Dulbecco sem cálcio & magnésio (1 x DPBS-CMF) adicionando 1 X DPBS-CMF em poços utilizando uma pipeta de 1.000 µ l e removê-lo usando um vácuo.
   3. Adicione 300 µ l de tripsina/DNAse para cada poço. Incube as células hRPESC-RPE em tripsina/DNAse (kU 4 DNase por 1 mL de 0,25% do trypsin-EDTA) para 4 min a 37 ° C para dissociar as células.
   4. Verifique as células sob o microscópio para ver se eles têm arredondado. Continue a incubar as células em tripsina/DNase por um adicional 2 min, se eles não capturou ainda.
   5. Uma vez que as células são arredondadas, use uma pipeta de 1.000 µ l Triture as células desanexadas do poço e transferir a tripsina/DNase contendo células isoladas em um tubo cônico de 15 mL, com igual volume de meio de cultura previamente aquecido, para inactivar a tripsina/DNase.
   6. Lavar os poços com 1 pré-aquecido X DPBS-CMF pipetando delicadamente acima e para baixo, especialmente em torno das bordas do poço; em seguida, adicione estas células ao anterior tubo cónico.
   7. Centrifugar o tubo cônico em 286 x g por 5 min a 4 ° C para as células de Pelotas.
   8. Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 1 mL de meio de cultura.
   9. Conte as células usando um hemocytometer.
   10. Centrifugar a 286 x g por 5 min a 4 ° C para as células de Pelotas.
   11. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em estéril equilibrado sal solução (BSS) a 50.000 células / µ l (entregar 50.000 pilhas no 1 µ l de volume durante a injeção subretinal).
   12. Transferi a suspensão de célula final (CS) para um tubo de 1,7 mL microcentrifuga e manter em uma mistura de água gelada até o uso de injeção.
2. Preparação do injector do celular
   1. Introduza uma agulha estéril de calibre 33 chanfrada a seringa de injeção e o parafuso firmemente para montar o injector.
   2. Irrigue o injector com 100% de etanol, 5 - 6 vezes.
   3. Irrigue o injector com etanol 70% 5 - 6 vezes.
   4. Irrigue o injector com BSS 5 - 6 vezes.
   5. Marca a agulha do injetor com uma caneta marcador preto estéril em uma posição de 600 µm longe da ponta da agulha ao microscópio dissecação (figura 1B).
   6. Coloque o injetor em um micromanipulador para injeção.

2. apresentam injeção

1. Área cirúrgica e preparação do animal
   1. Pesar um rato RCS de 4-5 semanas (60-100 g) e anestesia-lo usando o sistema de distribuição de vapor de isoflurano.
      Nota: Para induzir anestesia manter a taxa de fluxo do isoflurano em 5%. Confirme a profundidade da anestesia com as patas e então reduzir a taxa de fluxo de 2-3% para a manutenção da anestesia durante a cirurgia.
   2. Coloque uma cortina de cirurgia estéril, com uma almofada de aquecimento por baixo, no palco do microscópio dissecação para configurar uma área cirúrgica estéril.
   3. Transferir o rato para a área cirúrgica e coloque o rato em um cone de nariz conectado ao sistema para manter a anestesia de isoflurano.
   4. Cobrir o corpo do rato com gaze. Belisca o dedo do rato para confirmar a anestesia total.
2. Trans-escleral subretinal injeção sob o microscópio
   1. Aplique uma gota de lubrificante do olho no olho não-operados do rato.
   2. Posicione o rato no seu lado direito com seu olho esquerdo virado para o teto por injeção, a cabeça para a direita do cirurgião e suas costas voltadas para o cirurgião.
   3. Apare qualquer bigodes que cubram o olho com uma pequena tesoura.
   4. Uma pequena quantidade de lavagem do olho do lado temporal do olho esquerdo do gotejamento e recolher o excesso no lado nasal com um aplicador de algodão para lavar o olho.
   5. Dilate a pupila com fenilefrina tropicamida e 2,5% 1% (acabada de fenilefrina 10% diluindo-o em solução salina 0,9% estéril no dia da cirurgia) para um exame de OCT pós-injeção aplicando uma gota de cada um.
   6. Puxe delicadamente a pele ao redor do olho, 4 - 6 vezes para abrir a pálpebra para que o olho é um pouco proptosed para facilitar o acesso às regiões posteriores ao limbo.
   7. Aplique uma gota de lavagem do olho e manter o olho úmido.
   8. Delicadamente, Triture o CS (preparado na etapa 1.1.12) e carregar o injetor com 1,2 µ l de CS. O extra 0,2 µ l é usado para compensar o recuo da injeção.
      Nota: Baseado em nossas medições, sobre 5.000-8.000 células perdem-se no recuo com uma injeção de 50.000 células / µ l que equivale a cerca de 10-16% de perda de célula e um extra de 0,2 µ l de CS foi injetado para compensar essa perda de célula.
   9. Coloque o injetor repleto de CS em um micromanipulador (ou ter um assistente que segure) verticalmente como RPE células tendem a afundar-se facilmente em suspensão.
   10. Aplique uma gota de proparacaine de 0,5% (anestesia tópica local) no olho e retire o excesso com um aplicador de algodão.
       Nota: Esta etapa deve suprimir o reflexo corneal e impedir que o olho piscar durante as etapas subsequentes.
   11. Use pinças para agarrar a conjuntiva posterior ao limbo, girar o olho por via nasal e levantar a conjuntiva para fazer uma "barraca".
   12. Use uma tesoura para cortar o topo da "tenda" para fazer uma pequena abertura na conjuntiva e expor a esclera subjacente.
   13. Use a pinça para agarrar a borda da margem restante conjuntiva, junto ao limbo e girar o olho por via nasal, de modo que o eixo pupilar é um ângulo de aproximadamente 30 graus em relação ao topo da mesa (Figura 1). Continuou segurando a margem da conjuntiva é necessário fornecer uma Counter-força durante a inserções de agulha e manter o olho em um ângulo ideal.
   14. Para fazer um furo piloto para injeção de célula, posicione a extremidade de uma agulha chanfrada estéril 31-calibre insulina em 1.200-1.500 µm posterior ao limbo com a abertura da ponta virada para cima.
   15. Ajuste o ângulo da agulha insulina para que é 10-15 graus acima da esclera (tangente a um plano imaginário no local da injeção pretendido). Lentamente penetra o esclera coroide complexo a uma profundidade de agulha, de cerca de 500 µm. O rato pigmentado, o fim de agulha 'desaparecerá' abaixo a coroide pigmentada. Para a marca da agulha de insulina usada aqui, a distância entre a ponta da agulha para o chanfro é 500 µm.
   16. Retire cuidadosamente a agulha de insulina (um pequeno derrame de sangue pode ser visto).
   17. Se o sangramento excessivo é observada, lança um olho pode ser aplicada para limpar o buraco, se necessário. Sangramento contínuo após o aplicativo lança indica um navio pode ter sido danificado.
   18. Guie a agulha do injetor carregado célula RPE no orifício piloto, com a abertura virada para baixo e em um ângulo de cerca de 10-15 graus em relação à superfície local da esclera.
   19. Insira cuidadosamente a agulha do injetor no orifício piloto a uma profundidade de cerca de 500 µm para acessar o espaço subretinal. Deve haver sobre uma margem de 100 µm entre a borda da marca de caneta preta e o ponto onde a agulha é coberta pela coroide pigmentada (Figura 1 e 1 D).
   20. Pergunte a assistente delicadamente pressione o êmbolo da seringa injetora para injetar o volume apropriado de células (aproximadamente 1,2 µ l). Prepare-se fornecer uma Counter-força como o assistente pressiona o êmbolo.
       Nota: Treino simulado prévio com o assistente pode fornecer o cirurgião e o assistente com a experiência necessária com esta etapa.
   21. E visualmente focando a caneta marca borda, segurar o injector no lugar para 25-30 s e então puxar lentamente o injector. Uma pequena quantidade de refluxo é comumente observada.
       Nota: Se o refluxo não for observado, pode ter havido uma injeção intravitreal. Se você vê refluxo através do selo ou células de enchimento sob a esclera, a injeção era muito rasa.
   22. Enxágue o efluxo celular do local da injeção com a lavagem do olho estéril 3 vezes e coletar o excesso com um aplicador de algodão.
   23. Aplique uma gota de lubrificante de olho no olho operado e transferir o rato para a estação da OCT para examinar a localização das células transplantadas e o tamanho da bolha do subretinal.

3. pós-injeção de tratamento

1. Tratamento de apaziguador de dor e anti-inflamatório
   1. Injete buprenorfina em 0,1 mg/kg de peso corporal em soro fisiológico por via subcutânea para diminuir a dor.
   2. Injete dexametasona em 1,6 mg/kg de peso corporal em solução salina por injeção intraperitoneal (I.P.) para controle da inflamação.
2. Recuperação de animais
   1. Retorne o rato da gaiola de recuperação sob uma lâmpada de calor para manter a temperatura corporal.
   2. Observe o olho operado por sinais de hemorragia.
   3. Observe o rato para assegurar que se trata da anestesia.
   4. Retornar o animal recuperado para uma gaiola fresca e sinalizar a gaiola com um cartão de cirurgia e monitorar diariamente por sinais de aflição, hemorragia ocular ou opacidades da córnea. Notificar o veterinário imediatamente se existem preocupações.

Usando a técnica descrita neste artigo, nós consistentemente entregues células hRPESC-RPE no espaço subretinal de ratos RCS controlando precisamente a localização, ângulo e profundidade da inserção de agulha injector no tecido (figura 1B-D ). Imediatamente seguinte transplante, um exame de OCT foi realizado para observar o local da injeção e a bolha subretinal criado pelas células transplantadas. Avaliação de OCT pós-cirúrgica serve como uma ferramenta de triagem para avaliar a qualidade das injeções e monitoramento de danos na retina ou hemorragia. Ambos a subretinal bolha (Figura 2A, C e D) e o local da injeção (Figura 2A e B) pode ser visto claramente sob a OCT de digitalização. A bolha subretinal resolve-se geralmente em 24 horas após a injeção. Medição do tamanho das bolhas é difícil usando a OCT, podemos estimar a área de bolha, assumindo que é igual à área de preservação de fotorreceptoras pelo transplante de células. Demonstramos anteriormente que um 1 injeção µ l de 50.000 células pode resultar em economia de cerca de 6-7% área da retina ao redor do local de injeção13RCS. Como mostrado na Figura 2A, C e D, o retinal camadas estavam intactas no local da injeção, sem sangue, foi detectada a bolha, e não células foram observadas no vítreo, demonstrando o mínimo de trauma causado pela injeção. Além disso, imagens representativas de OCT de injeções falhadas também foram incluídas para referência (Figura 2E e F).

Com o uso da OCT como uma ferramenta de feedback, nós aperfeiçoamos o ângulo e a profundidade de inserção da agulha injetora no tecido. Uma vez otimizado, este método permitido-nos alcançar uma taxa de sucesso de 90,8% subretinal acesso com apenas 5,7% cirúrgica falhar, baseado nos resultados de mais de 300 injeções subretinal anteriores realizadas em nossos outros estudos13 (tabela 1). Em 3,5% restantes, os PTU não foram realizados por vários motivos, incluindo os olhos, não em uma posição adequada devido ao isoflurano associada a anestesia olho rolando17.

7 dias após o transplante, os olhos de rato operados foram enucleados, fixo e seccionado para análise reagidos. Uma célula humana marcador nuclear (Hunu)18 e uma célula RPE marcador (OTX2)19 foram usados para detectar as células transplantadas. Figura 3 mostrou uma espessa camada de células RPE transplantadas no espaço subretinal que, uma semana após a injeção, positivamente foi manchado com ambos os marcadores, confirmando a identidade e a entrega bem sucedida de transplantes. Em uma semana após a injeção, o grande número de células, como mostrado na Figura 3, pode rapidamente recusar um pequeno número mais tarde devido a resposta imune do hospedeiro mesmo em imunodeprimidos RCS ratos20. No entanto, como mencionado acima, a camada de fotorreceptoras degenerado dos olhos de rato RCS pode ser encontrada para ser resgatado pelo menos 2 meses após o transplante com hRPESC-RPE13.

Figura 1 : Uma imagem de células de hRPESC-RPE P2 4 semana de idade e uma demonstração do ângulo e a profundidade que a agulha do injetor usa durante a injeção. (A) uma imagem de contraste de fase de células de hRPESC-RPE P2 4 semana de idade usada para a injeção. Barra de escala = 100 µm. (B) um esquema mostrando a distância de 600 µm entre a borda do marcador e a ponta da agulha injetora medido por uma microescala. A graduação mínima da microescala é 100 µm. (C) um desenho mostrando a seção transversal da estrutura anatômica de um olho de rato e uma vista lateral do ângulo e profundidade que a agulha do injetor insere-se na parede do olho. O eixo da pupila do olho do rato é de 30 graus em relação à parte superior de tabela e a agulha do injetor é de 15 graus em relação à superfície local do globo ocular. (D) um desenho animado mostrando o ponto de partida do marcador na agulha o injector e a vista superior do local da injeção, onde 500 µm da agulha injetora é inserido em um espaço de 100 µm e o tecido é deixado entre a abertura do orifício da injeção e a borda do marke r. o local do furo é 1.200-1.500 µm posterior ao limbo. A ponta da agulha é mostrada em seu lado, mas deve ser virada para baixo durante a injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Imagens da OCT do olho operado rato imediatamente após a injeção. (A) uma imagem de B-scan de OCT de olho operado, mostrando um site subretinal bleb e injeção, sem hemorragia intravitreal. (B) uma OCT intensidade projeção (VIP) imagem de volume de uma série de B-scan, que representa a imagem de fundo do enface da área injetada. O site de injeção pequena é visível na imagem VIP mostrando o mínimo de trauma. (C) uma imagem ampliada de OCT de (A) mostrando as células transplantadas no espaço subretinal com todas as camadas da retina marcado. Esta imagem demonstrou que as células transplantadas foram localizadas no espaço subretinal. (D) uma imagem de B-scan de OCT mostrando uma bolha subretinal de tamanho médio. (E) uma imagem de B-scan de OCT mostrando uma injeção subretinal falhou com CS localizado no espaço intravitreal. (F) uma imagem de B-scan de OCT mostrando uma injeção subretinal falhou com a retina inteira perfurem no local da injeção. Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Reagidos coloração da retina congelado seções após transplante de células de hRPESC-RPE. (A) humano célula nuclear marcador (Hunu) coloração indica a detecção de células RPE humanas transplantadas. (B, E) Contador de célula nuclear coloração (4', 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) mostrando as camadas da retina, o transplante e camada RPE. (C) uma imagem mesclada de Hunu e DAPI, indicando que as células transplantadas hRPE estão localizadas no espaço subretinal. A separação entre a camada RPE e transplante é um artefato de processamento associado com cryo-proteger os olhos RCS para seções congeladas. (D) RPE marcador (OTX2) coloracao celular de células humanas transplantadas RPE. (F) uma imagem mesclada de OTX2 e DAPI. Barra de escala = 20µm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Resumo das injeções subretinal de dez coortes experimentais em ratos RCS.

Os autores não têm nada para divulgar.