Artigo de método

Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

DOI:

10.3791/55220

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12 de agosto de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neural Stem Cell Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Subretinal injeção tem sido amplamente aplicada em estudos pré-clínicos de terapia de reposição de células-tronco para degeneration macular age-related. Neste artigo visualizado, descrevemos uma técnica de injeção subretinal menos arriscado, reproduzíveis e precisamente modificados através da abordagem trans-escleral para entregar as células nos olhos de rato.

Resumo

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Doenças degenerativas da retina, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI) são a principal causa de perda de visão irreversível em todo o mundo. AMD é caracterizada por degeneração de células epiteliais pigmento retinal (RPE), que são uma monocamada de células apoiando funcionalmente e anatomicamente, envolvendo em torno da retina neural. Tratamentos farmacológicos atuais para o não-neovascular AMD (AMD seco) apenas retardar a progressão da doença, mas não podem restaurar a visão, necessitando de estudos que visam identificar novas estratégias terapêuticas. Substituindo as células RPE degenerativas com promessa de porões de células saudáveis para tratar DMRI seca no futuro. Extensos estudos pré-clínicos de terapias de substituição de células-tronco para AMD envolvem o transplante de células-tronco derivadas de células de RPE no espaço subretinal de modelos animais, em que é aplicada a técnica de injeção subretinal. A abordagem mais utilizada nestes estudos pré-clínicos de animais é através da rota trans-escleral, que é dificultada pela falta de visualização directa da extremidade da agulha e muitas vezes pode resultar em danos na retina. Uma abordagem alternativa através do vítreo permite a observação direta da posição final da agulha, mas carrega um alto risco de traumas cirúrgicos como mais tecidos oculares são perturbados. Nós desenvolvemos um método modificado injeção trans-escleral menos arriscado e reprodutíveis que usa agulha definidos ângulos e profundidades com êxito e consistentemente fornecer células RPE no espaço subretinal rato e evitar danos excessivos da retina. Células entregadas desta forma tem previamente demonstradas para ser eficaz em ratos Royal College of Surgeons (RCS) pelo menos 2 meses. Esta técnica pode ser usada não só para o transplante de células, mas também para a entrega de pequenas moléculas ou terapias de gene.

Introdução

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A retina humana situado na parte traseira as funções do olho como um tecido sensorial leve e desempenha um papel crítico na percepção de visão. Disfunção de células da retina ou morte celular, portanto, causa problemas de visão ou cegueira permanente. Distúrbios envolvendo a degeneração ou disfunção das células nas diferentes camadas da retina são conhecidos como doenças degenerativas da retina, entre os quais a AMD é o tipo mais comum e a principal causa de cegueira irreversível em idosos nos países desenvolvidos 1,2. O processo patológico da AMD é associado com o acúmulo de "drusen" entre a camada RPE e membrana de Bruch a subjacente, que por sua vez prejudica o apoio da RPE da fisiologia fotoreceptor, levando à atrofia da retina neural e perda de visão3, 4,5. Até agora, não existe cura para avançados (não-neovascular) AMD seco. O surgimento da terapia de células-tronco como um novo paradigma na medicina regenerativa traz a esperança de substituir as células RPE disfuncionais ou mortas com células-tronco derivadas de células saudáveis. De fato, estudos pré-clínicos extensivos de transplantar células (por exemplo, células-tronco embrionárias humanas)-tronco-células derivadas de RPE em modelos animais RPE-degenerativas têm sido realizados6,7, alguns dos quais têm progredido para ensaios clínicos8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Recentemente, uma fonte alternativa de células-tronco residentes na camada RPE humana, as células-tronco humanas RPE (hRPESCs), foi identificada pelo nosso laboratório e está sendo usada atualmente em estudos pré-clínicos de terapia de transplante de celular (hRPESC-RPE) de derivados-RPE hRPESC para AMD 10 , 11 , 12 , 13.

A técnica de injeção subretinal é aplicada nos estudos pré-clínicos mencionados acima por vários grupos, incluindo o nosso grupo. Existem duas abordagens gerais para injeção subretinal em animais: trans-vitreal e trans-escleral. A abordagem trans-vitreal tem a vantagem de ser capaz de observar diretamente o fim da agulha que penetra no olho anterior, cruza a vitreal toda cavidade adjacente à lente e penetra a retina para trás para o olho para alcançar o apresentam o cirurgião espaço de15,de14,16. No entanto, exige perturbar a retina em dois locais (anteriores e posteriores), carrega o risco de danificar a lente e pode resultar em refluxo de células para o vítreo, quando a agulha é recolhida. Em contraste, a abordagem trans-esclera, em princípio, evita envolvimento da retina e vítreo e refluxo sai do olho. Em roedores pigmentadas, o cirurgião pode inicialmente observar a penetração da esclera, mas após a passagem para a coroide pigmentada, o fim da agulha não está visível. Sem observação directa, romper a retina é comum e pode resultar em dissecção da retina e entrega de células e/ou sangue para o vítreo. Além disso, porque a superfície do olho é curvo, é muito difícil saber qual agulha ângulos e profundidades são mais eficazes para a trans-escleral injeções.

Neste artigo visualizado, apresentamos um método de injeção subretinal trans-escleral informado pelo uso de avaliações pós-cirúrgicos com a tomografia de coerência óptica (OCT), que permite um exame detalhado do local da injeção. Nossa técnica de injeção trans-escleral utiliza locais definidos, ângulos e profundidades para agulhas de injeção produzir trauma cirúrgico muito baixo e alta confiabilidade. Aqui, demonstramos especificamente a injeção de células hRPESC-RPE no espaço subretinal do rato RCS, um modelo pré-clínico de AMD humana. Com este método de injeção, com sucesso e consistentemente foram entregues as células hRPESC-RPE no espaço de subretinal olhos de rato RCS com uma taxa de sucesso muito alta. Injeção de células anteriormente foi encontrada para resultar na preservação dos FOTORRECEPTORES RCS pelo menos 2 meses após injeção13. Este procedimento é realizado sob o microscópio de dissecação e é fácil de aprender. Requer duas pessoas (um cirurgião e assistente) para realizar a injeção e o tempo médio de injeção para cada animal é menos de 5 minutos. Os ângulos definidos e profundidades para agulhas de injeção tornam possível para os laboratórios, onde a OCT está indisponível, para alcançar o sucesso injeção subretinal. Ele permite acesso subretinal altamente reprodutível e pode ser usado não só para o transplante de células, mas também para terapias medicamentosas de entrega e gene.

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Protocolo

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Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) na Universidade Estadual de Nova York em Albany.

1. preparação pre-injeção

  1. Preparação de uma suspensão de células de hRPESC-RPE
    Nota: Todas as seguintes etapas são executadas no capô de cultura de tecido estéril e familiaridade com técnica estéril básica é necessária.
    1. Isolar as células primárias hRPE de doador humano olhos com idades entre 50-90 anos e células de cultura em placas boas 2412. Cryopreserve as células na passagem 1, conforme necessário e descongelamento e cultura passagem 2 células (P2) para 4-5 semanas (figura 1A) para injeção.
    2. Remover o meio de cultura12 e suavemente poços de lavar duas vezes com 500 µ l pré aquecido 1 X fosfato tamponada salina de Dulbecco sem cálcio & magnésio (1 x DPBS-CMF) adicionando 1 X DPBS-CMF em poços utilizando uma pipeta de 1.000 µ l e removê-lo usando um vácuo.
    3. Adicione 300 µ l de tripsina/DNAse para cada poço. Incube as células hRPESC-RPE em tripsina/DNAse (kU 4 DNase por 1 mL de 0,25% do trypsin-EDTA) para 4 min a 37 ° C para dissociar as células.
    4. Verifique as células sob o microscópio para ver se eles têm arredondado. Continue a incubar as células em tripsina/DNase por um adicional 2 min, se eles não capturou ainda.
    5. Uma vez que as células são arredondadas, use uma pipeta de 1.000 µ l Triture as células desanexadas do poço e transferir a tripsina/DNase contendo células isoladas em um tubo cônico de 15 mL, com igual volume de meio de cultura previamente aquecido, para inactivar a tripsina/DNase.
    6. Lavar os poços com 1 pré-aquecido X DPBS-CMF pipetando delicadamente acima e para baixo, especialmente em torno das bordas do poço; em seguida, adicione estas células ao anterior tubo cónico.
    7. Centrifugar o tubo cônico em 286 x g por 5 min a 4 ° C para as células de Pelotas.
    8. Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 1 mL de meio de cultura.
    9. Conte as células usando um hemocytometer.
    10. Centrifugar a 286 x g por 5 min a 4 ° C para as células de Pelotas.
    11. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em estéril equilibrado sal solução (BSS) a 50.000 células / µ l (entregar 50.000 pilhas no 1 µ l de volume durante a injeção subretinal).
    12. Transferi a suspensão de célula final (CS) para um tubo de 1,7 mL microcentrifuga e manter em uma mistura de água gelada até o uso de injeção.
  2. Preparação do injector do celular
    1. Introduza uma agulha estéril de calibre 33 chanfrada a seringa de injeção e o parafuso firmemente para montar o injector.
    2. Irrigue o injector com 100% de etanol, 5 - 6 vezes.
    3. Irrigue o injector com etanol 70% 5 - 6 vezes.
    4. Irrigue o injector com BSS 5 - 6 vezes.
    5. Marca a agulha do injetor com uma caneta marcador preto estéril em uma posição de 600 µm longe da ponta da agulha ao microscópio dissecação (figura 1B).
    6. Coloque o injetor em um micromanipulador para injeção.

2. apresentam injeção

  1. Área cirúrgica e preparação do animal
    1. Pesar um rato RCS de 4-5 semanas (60-100 g) e anestesia-lo usando o sistema de distribuição de vapor de isoflurano.
      Nota: Para induzir anestesia manter a taxa de fluxo do isoflurano em 5%. Confirme a profundidade da anestesia com as patas e então reduzir a taxa de fluxo de 2-3% para a manutenção da anestesia durante a cirurgia.
    2. Coloque uma cortina de cirurgia estéril, com uma almofada de aquecimento por baixo, no palco do microscópio dissecação para configurar uma área cirúrgica estéril.
    3. Transferir o rato para a área cirúrgica e coloque o rato em um cone de nariz conectado ao sistema para manter a anestesia de isoflurano.
    4. Cobrir o corpo do rato com gaze. Belisca o dedo do rato para confirmar a anestesia total.
  2. Trans-escleral subretinal injeção sob o microscópio
    1. Aplique uma gota de lubrificante do olho no olho não-operados do rato.
    2. Posicione o rato no seu lado direito com seu olho esquerdo virado para o teto por injeção, a cabeça para a direita do cirurgião e suas costas voltadas para o cirurgião.
    3. Apare qualquer bigodes que cubram o olho com uma pequena tesoura.
    4. Uma pequena quantidade de lavagem do olho do lado temporal do olho esquerdo do gotejamento e recolher o excesso no lado nasal com um aplicador de algodão para lavar o olho.
    5. Dilate a pupila com fenilefrina tropicamida e 2,5% 1% (acabada de fenilefrina 10% diluindo-o em solução salina 0,9% estéril no dia da cirurgia) para um exame de OCT pós-injeção aplicando uma gota de cada um.
    6. Puxe delicadamente a pele ao redor do olho, 4 - 6 vezes para abrir a pálpebra para que o olho é um pouco proptosed para facilitar o acesso às regiões posteriores ao limbo.
    7. Aplique uma gota de lavagem do olho e manter o olho úmido.
    8. Delicadamente, Triture o CS (preparado na etapa 1.1.12) e carregar o injetor com 1,2 µ l de CS. O extra 0,2 µ l é usado para compensar o recuo da injeção.
      Nota: Baseado em nossas medições, sobre 5.000-8.000 células perdem-se no recuo com uma injeção de 50.000 células / µ l que equivale a cerca de 10-16% de perda de célula e um extra de 0,2 µ l de CS foi injetado para compensar essa perda de célula.
    9. Coloque o injetor repleto de CS em um micromanipulador (ou ter um assistente que segure) verticalmente como RPE células tendem a afundar-se facilmente em suspensão.
    10. Aplique uma gota de proparacaine de 0,5% (anestesia tópica local) no olho e retire o excesso com um aplicador de algodão.
      Nota: Esta etapa deve suprimir o reflexo corneal e impedir que o olho piscar durante as etapas subsequentes.
    11. Use pinças para agarrar a conjuntiva posterior ao limbo, girar o olho por via nasal e levantar a conjuntiva para fazer uma "barraca".
    12. Use uma tesoura para cortar o topo da "tenda" para fazer uma pequena abertura na conjuntiva e expor a esclera subjacente.
    13. Use a pinça para agarrar a borda da margem restante conjuntiva, junto ao limbo e girar o olho por via nasal, de modo que o eixo pupilar é um ângulo de aproximadamente 30 graus em relação ao topo da mesa (Figura 1). Continuou segurando a margem da conjuntiva é necessário fornecer uma Counter-força durante a inserções de agulha e manter o olho em um ângulo ideal.
    14. Para fazer um furo piloto para injeção de célula, posicione a extremidade de uma agulha chanfrada estéril 31-calibre insulina em 1.200-1.500 µm posterior ao limbo com a abertura da ponta virada para cima.
    15. Ajuste o ângulo da agulha insulina para que é 10-15 graus acima da esclera (tangente a um plano imaginário no local da injeção pretendido). Lentamente penetra o esclera coroide complexo a uma profundidade de agulha, de cerca de 500 µm. O rato pigmentado, o fim de agulha 'desaparecerá' abaixo a coroide pigmentada. Para a marca da agulha de insulina usada aqui, a distância entre a ponta da agulha para o chanfro é 500 µm.
    16. Retire cuidadosamente a agulha de insulina (um pequeno derrame de sangue pode ser visto).
    17. Se o sangramento excessivo é observada, lança um olho pode ser aplicada para limpar o buraco, se necessário. Sangramento contínuo após o aplicativo lança indica um navio pode ter sido danificado.
    18. Guie a agulha do injetor carregado célula RPE no orifício piloto, com a abertura virada para baixo e em um ângulo de cerca de 10-15 graus em relação à superfície local da esclera.
    19. Insira cuidadosamente a agulha do injetor no orifício piloto a uma profundidade de cerca de 500 µm para acessar o espaço subretinal. Deve haver sobre uma margem de 100 µm entre a borda da marca de caneta preta e o ponto onde a agulha é coberta pela coroide pigmentada (Figura 1 e 1 D).
    20. Pergunte a assistente delicadamente pressione o êmbolo da seringa injetora para injetar o volume apropriado de células (aproximadamente 1,2 µ l). Prepare-se fornecer uma Counter-força como o assistente pressiona o êmbolo.
      Nota: Treino simulado prévio com o assistente pode fornecer o cirurgião e o assistente com a experiência necessária com esta etapa.
    21. E visualmente focando a caneta marca borda, segurar o injector no lugar para 25-30 s e então puxar lentamente o injector. Uma pequena quantidade de refluxo é comumente observada.
      Nota: Se o refluxo não for observado, pode ter havido uma injeção intravitreal. Se você vê refluxo através do selo ou células de enchimento sob a esclera, a injeção era muito rasa.
    22. Enxágue o efluxo celular do local da injeção com a lavagem do olho estéril 3 vezes e coletar o excesso com um aplicador de algodão.
    23. Aplique uma gota de lubrificante de olho no olho operado e transferir o rato para a estação da OCT para examinar a localização das células transplantadas e o tamanho da bolha do subretinal.

3. pós-injeção de tratamento

  1. Tratamento de apaziguador de dor e anti-inflamatório
    1. Injete buprenorfina em 0,1 mg/kg de peso corporal em soro fisiológico por via subcutânea para diminuir a dor.
    2. Injete dexametasona em 1,6 mg/kg de peso corporal em solução salina por injeção intraperitoneal (I.P.) para controle da inflamação.
  2. Recuperação de animais
    1. Retorne o rato da gaiola de recuperação sob uma lâmpada de calor para manter a temperatura corporal.
    2. Observe o olho operado por sinais de hemorragia.
    3. Observe o rato para assegurar que se trata da anestesia.
    4. Retornar o animal recuperado para uma gaiola fresca e sinalizar a gaiola com um cartão de cirurgia e monitorar diariamente por sinais de aflição, hemorragia ocular ou opacidades da córnea. Notificar o veterinário imediatamente se existem preocupações.

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Resultados

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Usando a técnica descrita neste artigo, nós consistentemente entregues células hRPESC-RPE no espaço subretinal de ratos RCS controlando precisamente a localização, ângulo e profundidade da inserção de agulha injector no tecido (figura 1B-D ). Imediatamente seguinte transplante, um exame de OCT foi realizado para observar o local da injeção e a bolha subretinal criado pelas células transplantadas. Avaliação de OCT pós-cirúrgica serve como uma ferramenta de...

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Discussão

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A técnica de injeção subretinal descrita neste artigo é através da via trans-escleral, onde a agulha do injetor penetra as camadas externas (complexo de esclera-coroide-RPE) da parede do olho, sem prejudicar a retina neural ou perturbar a cavidade vítrea. Uma abordagem alternativa trans-vitreal tem um risco potencial de dano de lente, levando à catarata, desde que a lente dos roedores ocupa a maioria da cavidade vítrea. Comparado a esse método, nossa técnica é menos arriscada e faz com que o mínimo de trauma como a agulh...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer a Patty Lederman pela sua assistência na cirurgia e Susan Borden para preparação de células RPE. Também reconhecemos a C028504 de NYSTEM de financiamento para este projeto. Justine, d. Miller é suportado pelo NIH grant F32EY025931.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% Tripsina-EDTA (1x)Life Technologies25200-072
DNAse ISigmaDN-25
1xDulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e Magnésio (1xDPBS-CMF)Corning Cellgro431219
Solução salina balanceada estéril (BSS)Alcon00065079550
Lavagem dos olhos estérilMoore Medical75519
Solução estéril de solução salina a 0,9%Hospira488810
Solução oftálmica de cloridrato de proparacaína (0,5%)Akorn17478026312
Solução oftálmica de tropicamida, USP (1%)Bausch & Solução
, estoque USP (10%)Bausch & Lomb42702010305Isso é usado para fazer 2,5% de fenileferina
BuprenexPatterson433502
dexametasonaAPP Pharmaceuticals63323051610
100% EtanolThermo Scientific615090040
70% EtanolRicca Chemical Company2546.70-5
Gel Lubrificante GenTeal EstérilNovartis78042947
Colírio Estéril Systane Ultra LubrificanteAlcon00065143105
células hRPESC-RPENão disponível comercialmenteConsulte a "Referência #12" para isolamento e manutenção de células.
Placas de 24 poçosCorning3526
Tubos cônicos (15 ml)Sarstedt62554002
Tampa da microcentrífuga com anel de vedaçãoLPS incL233126
Tubos de microcentrífuga sem tampa (1,7 ml)LPS incL233041
CentrífugaEppendorf5804R
Toalhete estéril com álcoolMcKesson58-204
Aplicadores de ponta de algodão estérilMcKesson24-106-2S
Lanças Weck-Cel estéreisBeaver-Visitec International 
Campos cirúrgicos estéreis Gaze McKesson25-515
McKesson16-4242
Seringa Nanofil (10 ul)World Precision InstrumentsNanofil
Agulha chanfrada de calibre 33World Precision InstrumentsNF33BV-2
Agulhas de seringa de insulina calibre 31Becton Dickinson328418
RatoMundo Precision Instruments555041FT
Tesoura de Mola Micro Dissecante VannasRobozRS-5602
Bomba de circulação de água T StrykerTP700
Almofada de aquecimentoKent ScientificTPZ-814
Sistema de anestesia animalWorld Precision InstrumentsEZ-7000
BalanceOhausPA1502
Microscópio estéreoZeissStemi 2000
Microscópio fonte de luzSchottACE series
Sistema de Imagem Oftálmica de Domínio Espectral Bioptigen EnvisuBioptigenR2210
Viscot Industries1416S-100
Miniatura de BalançaTed Pella Inc13623
Lâmpada de Ponto de Aquecimento Infravermelho EXO-TERRAPT2144Este é usado como uma lâmpada de aquecimento para animais durante a fase de recuperação pós-cirúrgica
oftálmica de fenileferina Lomb 24208058559 para os Olhos 0008680 pinça dentada Caneta Marcador Preto Estéril

Referências

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