3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Resumo

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

Resumo

Engenharia cartilagem permanece um desafio devido às dificuldades de criação de um implante funcional in vitro semelhante ao tecido nativo. Uma abordagem recentemente explorada para o desenvolvimento de substitutos autólogos envolve a diferenciação de células estaminais em condrócitos. Para iniciar este condrogénese, um grau de compactação das células estaminais é necessário; Assim, foi demonstrada a viabilidade de células magneticamente de condensação, tanto dentro de andaimes espessas e livres de andaime, utilizando as fontes de campo magnico em miniatura como atractores de células. Esta abordagem também magnética foi usada para guiar fusão agregado e para construir livre de andaime, organizada, tridimensional (3D) tecidos vários milímetros de tamanho. Além de ter um tamanho aumentado, o tecido formado pela fusão magnética-driven apresentou um aumento significativo na expressão de colagénio II, e observou-se uma tendência similar para a express de agrecano. Como a cartilagem nativa foi submetido a forças tchapéu influenciado sua estrutura 3D, a maturação dinâmica também foi realizada. Um bio-reactor que fornece estímulos mecânicos foi utilizado para a cultura dos andaimes magneticamente semeadas ao longo de um período de 21 dias. Biorreactor maturação largamente melhorada condrogénese nos andaimes celularizados; a matriz extracelular obtida sob estas condições era rico em colagénio II e agrecan. Este trabalho descreve o potencial inovador de condensação magnética de células estaminais marcados e maturação dinâmico num biorreactor para uma melhor diferenciação condrogénica, ambas isentas de andaime e dentro de suportes de polissacáridos.

Introdução

nanopartículas magnéticas já são utilizados na clínica como agentes de contraste para ressonância magnética (MRI), e suas aplicações terapêuticas continuar expandindo. Por exemplo, recentemente, tem sido mostrado que as células marcadas podem ser manipuladas in vivo, utilizando um campo magnético externo e podem ser dirigidas e / ou mantido a um sítio definido de implante ^{1, 2, 3.} Na medicina regenerativa, eles podem ser utilizados para manipular tecidos organizados in vitro ^4, incluindo tecido vascular ^5,

Protocolo

1. Construção dos dispositivos magnéticos

NOTA: Os dispositivos usados para a sementeira de células variam dependendo da aplicação (Figura 1). Para formar agregados, o número de células é limitado a 2,5 x 10 ⁵ / agregado, de modo que as pontas magnéticos devem ser muito fina (750 um de diâmetro). Para semear as andaimes 1,8 centímetros ^2/7 mm de espessura, os ímans devem ser maiores (3 mm de diâmetro) e vai garantir a migração de células através dos poros do andaime.

1. Construção de um dispositivo com micro-imans para a formao de agregados (Figura 1A)
   1. Fazer micro-fu....

Resultados

Em primeiro lugar, os agregados podem ser formados individualmente usando micro-imans através do depósito de 2,5 x 10 ⁵ culas estaminais marcados (Figura 2A). Estes agregados individuais (~ 0,8 mm de tamanho) pode, então, ser fundidos em estruturas maiores, graças à fusão sequencial, induzida magneticamente. Por exemplo, no dia oito de maturação condrogénica, os agregados foram colocados em contacto aos pares para formar dupletos; quádruplos foram montados no .......

Discussão

Primeiro, porque as técnicas aqui apresentadas dependem da internalização de nanopartículas magnéticas, uma questão importante é o resultado das nanopartículas, uma vez que localizar dentro das células. É verdade que as nanopartículas de ferro pode provocar potencial toxicidade ou a capacidade de diferenciação prejudicada dependendo do seu tamanho, de revestimento, e tempo de exposição ^{de 19, 22.} No entanto, vários estudos têm demonstrado nenhum impacto sobre a .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nanopartículas de óxido de ferro (maghemita) (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Fabricado e doado por C. Mé nager	Diâmetro médio de 8,1 nm e carga superficial negativa
Polissacarídeo Andaimes pululano/dextrano	LIOAD - Universidade Nantes	Feito e dado por C. Le Visage	Preparado a partir de uma mistura 75:25 de pululano/dextrano em condições alcalinas (10  M NaOH). Porosidade: 185-205  µ m; Espessura: 7  milímetro; Área de superfície: 1,8  cm2.
Sistema de Regeneração TisXell	QX900-002	QuinXell Technologies	com câmara de cultura de 500 mL
Gaiola para andaimes: Histosette II M492	VWR	720-0909
Célula estaminais mesenquimais (MSC)	Lonza	PT-2501	Foram utilizados três lotes independentes
MSCGM BulletKit médio	Lonza	PT-3001	Para o meio completo, adicione o BulletKit fornecido (contendo soro, glutamina e antibióticos) ao meio MSCGM
DMEM com Glutamax I	Life Technologies	31966-021	Sem piruvato de sódio, sem HEPES
Meio RPMI 1640, sem Glutamina	Life Technologies	31870-025	Sem piruvato de sódio, sem HEPES
PBS sem CaCl2 sem MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Tripsina-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicilina (10,000  U/mL) / Estreptomicina (10.000  µ g/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Solução de piruvato de sódio 100 mM	Sigma	S8636
Ácido L-ascórbico 2-fosfato	Sigma	A8960	Prepare a solução concentrada (25 mM) em água destilada extemporaneamente
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a solução estoque de 175 mM diluída em água destilada e armazene a 4 horas; ° C
Dexametasona	Sigma	D4902	Prepare a solução estoque de 1 mM diluída em etanol 100% e armazene a -20  ° C
TGF-beta 3 proteína 10  µ g	Interchim	30R-AT028
Citrato de trissódio	VWR	33615.268	Prepare o 1  M solução estoque diluída em água destilada e armazene a 4  ° C
Pululanase de Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase de Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
Kit de extração de RNA NucleoSpin	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Transcriptase reversa	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µ g/mL: Use diluído 1/2 e coloque 1 µ L por amostra
RNAs recombinantes no inibidor da ribonuclease	Promega	N2511	40 U/µ L: coloque 1 µ L por amostra
PCR nucleotídeo dNTP mix (10  mM cada)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Sistema de PCR em Tempo Real	Life Technologies	4381792
Solução de formalina 10% com tamponamento neutro	Sigma	HT5012
Solução de OCT	VWR	361603E
Isopentano	Sigma	M32631
Azul de toluidina O	VWR	1.15930.0025
Etanol absoluto	VWR	20821.310
Tolueno	VWR	1.08323.1000
Meio de montagem Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer para qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'Aggrecan
Primer para qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Collagen
II Primer para qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'

Biorreator biaxial da