Artigo de método

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

DOI:

10.3791/55224

⸱

3 de abril de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Oakland University, 2OU-WB Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, 3Department of Obstetrics and Gynecology, St. John Provindence - Providence Park Hospital, 4Department of Neurosurgery, Beaumont Health System

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentam-se um protocolo para a dissecção de cordão umbilical humano (UC) e a amostra da placenta fetal em cordão de revestimento (CL), geleia de Wharton (WJ), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP) para o isolamento e caracterização de células estromais mesenquimais (MSCs), utilizando a técnica de cultura de explante.

Resumo

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O cordão umbilical humano (UC) e placenta são de fontes não-invasivos, primitivas e abundantes de células estromais mesenquimatosas (MSC) que têm cada vez mais ganharam a atenção porque eles não representam quaisquer preocupações de ordem ética ou morais. Os métodos actuais para isolar MSC da UC produzir quantidades baixas de células com potencial de proliferação variáveis. Uma vez que a UC é um órgão anatomicamente-complexo, diferenças nas propriedades do MSC pode ser devido às diferenças nas regiões anatómicas do seu isolamento. Neste estudo, foram primeiro dissecados as amostras de medula / placenta em três regiões anatómicas distintas: UC, junção cabo-placenta (CPJ), e placenta fetal (FP). Em segundo lugar, duas zonas distintas, cordão de revestimento (CL) e geleia de Wharton (WJ), foram separadas. A técnica de cultura de explante foi então usado para isolar culas a partir das quatro fontes. O tempo necessário para a cultura primária de células dos explantes variou dependendo da origem do tecido. Crescimento das células ocorreu no prazo de 3-4 days dos explantes CPJ, ao passo que o crescimento foi observado após 7 - 10 dias e 11 - 14 dias a partir de Cl / WJ e FP explantes, respectivamente. As células isoladas eram aderentes ao plástico e exibido e morfologia de superfície marcadores fibroblastóides, tais como CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 e, de forma semelhante à da medula óssea (BM) derivada de MSCs. No entanto, a eficiência de formação de colónias das células variou, com CPJ-MSC e WJ-MSCs que mostra a eficiência mais elevada do que o BM-MSCs. MSCs de todas as quatro fontes diferenciadas em adipogênica, condrogênica e linhagens osteogênicas, indicando que eram multipotentes. CPJ-MSCs diferenciado de forma mais eficiente em comparação com outras fontes MSC. Estes resultados sugerem que o CPJ é o mais potente região anatómica e produz um maior número de células, com uma maior capacidade de proliferação e de auto-renovação in vitro. Em conclusão, a análise comparativa das MSCs a partir das quatro fontes indicaram que CPJ é uma fonte mais promissora de MSC para a terapia celular, regenerative medicina e engenharia de tecidos.

Introdução

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As células estaminais estão presentes em vários órgãos e tecidos do corpo. Eles possuem potencial regenerativo e desempenhar um papel importante na reparação de tecidos danificados no corpo por toda a extensão da vida humana 1, 2. Isso tem gerado um grande interesse em células-tronco adultas (ASC), tanto mais que, ao contrário das células-tronco embrionárias (CES), o uso de ASC não representam dilemas morais e éticos. Diversos estudos relataram o isolamento de ASCs, tais como as células estromais mesenquimais (MSCs); as células-tronco hematopoiéticas (HSCs); e diferentes células progenitoras, incluindo as várias fontes de adultos que variam a partir de medula óssea (BM) de tecido adiposo (TA) e polpa dentária 3, 4, 5. No entanto, o nero de ASC presentes na maioria dos nichos adultos é limitado, e o seu isolamento geralmente envolve um procedimento invasivo e doloroso com possível doadormorbidade site. Além disso, a idade do doador e stress ambiental pode também desempenhar um papel significativo na determinação da qualidade e actividade biológica das células isoladas 6, 7, 8. ASC também exibir proliferação limitada e potencial de diferenciação durante a cultura in vitro.

Para superar estas desvantagens de ASC atual, novas fontes tenham sido interpostos para isolar células-tronco. Estes esforços conduziram ao isolamento de células estaminais a partir de fontes perinatal, incluindo o sangue do cordão, fio tecido, a placenta, e fluido amniótico 9. Estas fontes ganharam atenção por causa de sua fácil e abundante disponibilidade de 10, 11, 12, 13. Além disso, os tecidos perinatais podem ser obtidas de forma não invasiva, e as células-tronco derivadas a partir delas sãomais primitivos do que ASC isoladas a partir de fontes de adulto 14, 15. Eles são isoladas a partir de tecidos obtidos no nascimento e são considerados ter sofrido alterações mínimas no genoma devido ao envelhecimento e ambientais stresses 16.

No entanto, as características relatadas de células estaminais a partir de fontes perinatais e o seu potencial de auto-renovação, bem como para diferenciar variar amplamente 11, 17. Isto pode ser em parte devido ao facto de que o cordão umbilical humano (UC) é um órgão complexo. Nós supomos que as regiões discretas de tecido perinatal criar nichos específicos responsáveis ​​pelas variações e natureza mais primitiva destas células estaminais, em comparação com ASC derivadas de fontes não-perinatais. Este estudo descreve a dissecção de amostras de medula / placenta em três regiões discretas anatómicas: UC, junção cabo-placenta (CPJ),d placenta fetal (FP). O UC foi adicionalmente dissecado em duas zonas: cordão de revestimento (CL) e geleia de Wharton (WJ). Análise das células isoladas a partir de Cl, WJ, CPJ, e FP demonstraram que todos eles exibiram morfologia f ibroblastóide e expressa marcadores MSC, mas eles diferem na sua auto-renovação e diferenciação. células CPJ-derivados exibiram uma maior taxa de proliferação e de auto-renovação potencial em comparação com UC-e células FP-derivados, tornando-os de uma fonte mais promissora para a terapia celular, medicina regenerativa e engenharia de tecidos.

Protocolo

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As amostras (n = 3) foram obtidos a partir do consentindo, doadores saudáveis ​​por meio de Beaumont Hospital BioBank, Royal Oak, MI e o Hospital Providence, Southfield, MI sob HIC- (HIC # 2012-101) e IRB (IRB # 820662- 3), respectivamente, aprovaram os protocolos e processados ​​como aprovado pelo IBC (2858), da Universidade de Oakland, Rochester, MI.

1. Processamento de Cordão Umbilical, Junção Cord-placenta, e Fetal Placenta e isolamento de células

  1. Assepticamente recolher amostras de UC aproximadamente 10 cm de comprimento, dos quais 5 - 6 centímetros ligados ao CPJ e 3 - 4 cm da FP. Colocar imediatamente cada amostra num meio copo de colheita contendo (DMEM com 4500 mg de glucose / mL e solução de antibiótico (0,1% de gentamicina, 0,2% de estreptomicina, e 0,12% de penicilina)) e armazenar a 4 ° C até ser transportado para o laboratório por colocando-o no gelo em uma caixa de isopor. Processar a amostra a 4 ° C no prazo de 2-4 horas de recolha.
  2. Colocar a amostra em um 150-mm placa de Petri mantidos emgelo em uma cabine de segurança biológica. Usando uma agulha e seringa, lavá-lo várias vezes com PBS gelado para remover coágulos sanguíneos. Certifique-se a amostra é mantida molhado com PBS durante o processamento e não deixá-lo seco. Para manter a esterilidade, lidar com a assepticamente uma amostra usando ferramentas cirúrgicas PBS e autoclavados durante todo o processamento da amostra.
  3. examinar cuidadosamente a amostra para identificar diferentes regiões anatômicas: UC, o CPJ, e FP. Primeiro dissecar a UC. Segure a extremidade fetal do UC com uma pinça e fazer cuidadosamente o primeiro corte apenas no topo do CPJ usando um par de tesouras. Adicione o segundo corte abaixo do CPJ para separar o CPJ (1,5-2,0 cm) a partir da PQ. Coloque a UC separada, CPJ, e FP em placas de Petri separadas para processamento adicional.
  4. Cortar o UC longitudinalmente com a ajuda de tesouras e pinças, completamente expondo os vasos sanguíneos e em torno WJ sem perturbar o epitélio.
  5. Raspe o WJ longe dos vasos sanguíneos e epitélio interior do subamnionutilizando um bisturi, e então remover os vasos sanguíneos. Certifique-se de coletar qualquer WJ perivascular permanecendo sob e ao redor dos vasos sanguíneos, e coloque o WJ coletados em uma placa de Petri separado.
  6. Recolhe-se o restante tecido, medula forro (CL), em uma placa de Petri separadas.
  7. Após a separação dos tecidos que representam CL, WJ, CPJ, e FP, substituir o PBS com 3 - 5 mL de solução de tripsina comercial e cortados separadamente cada um dos tecidos em peças de 1 a 2 mm com uma tesoura.
  8. Incubar os pedaços de tecido em solução de tripsina comercial a 37 ° C durante 30 minutos em uma incubadora de CO 2 a 5% para a digestão parcial das amostras. Observar a digestão parcial por meio da visualização de libertação de células utilizando um microscópio de contraste de fase.
  9. Para as amostras parcialmente digeridos, adicionar um volume igual de meio de cultura (CM; DMEM com 4500 mg / mL de glucose e 2 mM de L-glutamina, suplementado com 10% de soro humano / FBS e solução de antibiótico (0,1% de gentamicina, 0,2% de estreptomicina , e 0,12% penicillin)) para neutralizar a solução de tripsina comercial. Transferir o conteúdo para dentro de tubos de centrífuga de 50 ml e deixar os pedaços de tecido parcialmente digeridos assentar durante 3 min.
  10. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, incluindo as células individuais (que não se expandem de forma eficiente), e placa de 15 - 20 parcialmente digeridos pedaços de tecido em um 75-cm balão de cultura de 2 tecidos e adicionar 9 ml de CM. Incubar a 37 ° C e não perturbe os frascos de cultura durante 2 - 3 dias para permitir a aderência de pedaços de tecido.
    NOTA: A parte restante das amostras de tecido parcialmente digeridos podem ser criopreservadas para futuro isolamento de células.
  11. Após 3 dias de incubação, alterar o CM e olhar para o aparecimento de crescimento de células a partir do explante em uma base diária; o crescimento de células deve ser evidente a partir dos explantes aderentes depois de 3 - 4 dias, 7 - 10 dias, e 11 - 14 dias de incubação para CPJ, CL / WJ, e FP, respectivamente. Deste ponto em diante, mudar o CM depois a cada 3 dias ou comonecessário.
    NOTA: O crescimento celular atinge 70% de confluência de 7 - 10 dias após o crescimento inicial de células a partir do explante. Note-se que pedaços de tecido não aderentes não dará origem a qualquer conseqüência célula até que eles aderem ao plástico. Cuidados devem ser tomados para que o frasco não é perturbado, a fim de evitar o desprendimento das peças de tecido aderentes. Se existem quaisquer peças que flutuam após os 3 primeiros dias de cultura, eles podem ser resgatados por transferi-las para um novo frasco para fixação.
    NOTA: Quando o crescimento das células dos explantes de tecido atinge 70% de confluência, eles devem ser repicadas. Como afirmado acima, as MSCs a partir de Cl / WJ, FP, CPJ e vai atingir confluência em 10 - 14 dias, 14 - 20 dias, e 17 - 24 dias, respectivamente.
  12. Para subcultura de células crescido a partir de explantes, dissociam-se as células utilizando 1 - 2 ml de solução de tripsina comercial de 75 cm balão de cultura / 2 e incuba-se a 37 ° C durante 3 min. Neutraliza-se com 1 - 2 ml de CM e centrifugar 1500 xg durante 3 min. FaçoCertifique-se de girar a garrafa, enquanto a adição de tripsina, mesmo para espalhar por toda parte.
  13. NOTA: As células sedimentadas foram considerados passagem 0 (P0) e serão suspensos em CM, contadas, e subcultivadas a uma densidade de 1 x 10 4 / cm 2 para a amplificação, caracterização, e criopreservação. As células em excesso pode ser criopreservadas em P0.

2. Caracterizar as isolaram células

  1. Formadoras de colónias eficiência ensaio (CFE)
    1. Revestir os pratos de Petri de 100 mm (área de superfície de 60 cm2) com 0,1% de gelatina durante 30 minutos e colocá-los na incubadora de CO 2 a 37 ° C.
      NOTA: Apesar de não ser necessário, de gelatina de revestimento melhora a aderência celular.
    2. Remover o excesso de gelatina e semear a placa revestida com células P0 a uma concentração de 1,63 células / cm2. Adicionar 3 ml de CM e incubar numa incubadora de CO2 a 37 ° C.
    3. Monitorar as placas semeadas para o crescimento clonalpor microscopia de luz (LM) e alterar o meio a cada 3 dias.
    4. Depois de 10 - 14 dias de crescimento celular, lavar os pratos de Petri duas vezes com PBS e fixar as células em 4% de paraformaldeído durante 30 min à temperatura ambiente.
      NOTA: O paraformaldeído é tóxico. Por favor, praticar cuidado usando luvas e óculos durante o uso.
    5. Corar as células fixadas com 0,1% de violeta cristal durante 1 h à temperatura ambiente e lavar a placa com água da torneira até que o corante azul não ligado é ido.
    6. Contar o número de colónias formadas por, pelo menos, 50 células, utilizando LM.
  2. Expressão de marcadores de superfície celular
    1. Cultura das células isoladas a 70% de confluência, dissociam-se com a solução de tripsina comercial, e lavar e sedimento por centrifugação a 1500 xg durante 3 min. Suspender as células em tampão FACS (1x PBS com 2% de FBS e 0,1% de azida de sódio).
      NOTA: Azida de sódio é tóxico. Por favor, praticar cuidado usando luvas e óculos durante o uso.
    2. Corar as células (~ 10 6) com FITC ou APC marcadas com anticorpos MSC-específica (anticorpos conjugados com FITC contra: CD44 e CD90 ou anticorpos contra a APC-conjugados: CD29, CD73, e CD105) em tampão de SCAF, durante 30 minutos a 4 ° C no escuro.
    3. Centrifugar as células coradas a 670 xg durante 5 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 uL de tampão de SCAF.
    4. Analisar as células marcadas com o anticorpo usando FACS de acordo com o protocolo do fabricante.

Potencial 3. Diferenciação

  1. diferenciação adipogênica
    1. Cultura das células isoladas a 70% de confluência, dissociam-se com a solução de tripsina comercial, e lavar e sedimento por centrifugação a 1500 xg durante 3 min.
    2. Em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C, cultura das células a uma concentração de 100.000 células / poço de uma placa de 6 cavidades contendo 2 mL de CM.
    3. Após 24 h, substituir o CM com adipogenic meio de diferenciação (0,5 uM isobutil-metilxantina, 1 uM de dexametasona, 10 M de insulina, e 200 ^ M indometacina) e incubar. Alterar o meio de diferenciação a cada 3 dias ou sempre que necessário.
    4. Após 3 semanas de incubação, fixar as células com 2 ml de paraformaldeído a 4% por poço durante 30 minutos a temperatura ambiente e mancha com Oil Red O para detectar a produção de gotículas de gordura, a fim de analisar para diferenciação adipogica.
      NOTA: O paraformaldeído é tóxico. Por favor, praticar cuidado usando luvas e óculos durante o uso.
    5. Tratar as culas fixadas com 60% de isopropanol (2 mL / poço de placa de 6 poços) durante 5 min.
    6. Substituir o isopropanol com 2 ml de Oil Red O (mancha de filtro 3 partes de Óleo Vermelho O mancha e 2 partes de água destilada), incubar durante 15-30 minutos à temperatura ambiente, e lavar 3 - 4 vezes com água da torneira para remover qualquer corante libertado .
    7. Visualizar as gotículas lipídicas manchado de vermelho, indicativos de linhagem celular adipogénica, ucantar LM.
  2. diferenciação condrogênica
    1. Cultura isolada células a 70% de confluência, dissociam-se com a solução de tripsina comercial, e lava-se com PBS.
    2. Para sedimentar as células para indução condrogénica, centrífuga de 250.000 células em um tubo de centrífuga de 15 mL com 2 mL de CM a 11.000 x g durante 8 min. Incubar as peletes durante a noite a 37 ° C.
    3. Após 24 h, suavemente substituir o CM com meio condrogénica diferenciação (20 ng TGF-? 1, 10 ng de insulina, 100 nM de dexametasona, e 100 ^ M de ácido ascórbico), sem perturbar o sedimento e continuar a incubação. Alterar o meio de diferenciação a cada 3 dias ou sempre que necessário.
    4. Após 3 semanas de incubação, fixar as células com 2 ml de paraformaldeído a 4% por poço durante 30 minutos à temperatura ambiente. Criocorte e mancha com 1% de azul de toluidina para examinar a presen ou produo de matriz extracelular, a fim de determinar a diferenciação condrogénica.
      NOTA: Paraformaldehyde é tóxico. Por favor, praticar cuidado usando luvas e óculos durante o uso.
    5. Para cryosectioning, lavar cuidadosamente os sedimentos celulares colhidos duas vezes com PBS e fixar com 1 mL de 4% de paraformaldeído durante 30 min à temperatura ambiente.
      NOTA: O paraformaldeído é tóxico. Por favor, praticar cuidado usando luvas e óculos durante o uso.
    6. Lavam-se as peletes duas vezes com PBS para remover o paraf ormaldeido e transferir para uma solução / outubro de sacarose (1: 2, 20% de sacarose: OCT). Incubar à temperatura ambiente durante 24 h, para permitir que a solução a infiltrar-se completamente para dentro dos sedimentos celulares; isso permitirá que seccionamento suave.
    7. Transferir os grânulos para os moldes PTU. Congelar os moldes à temperatura de -20 ° C durante 4-6 h e criocorte cerca de 10 - 12 micron de espessura secções dos peletes de células utilizando um criostato para coloração com azul de toluidina.
    8. Lavam-se os criocortes suavemente com PBS; adicionar algumas gotas de corante azul de toluidina a 1%, cobrindo as secções de pelotas no slide completamente; e incUbate durante 1 h à temperatura ambiente.
    9. Lavam-se as lâminas com PBS várias vezes para Destain. Remover o excesso de corante por meio de imersão do slide, em solução à base de álcool-HCl (95% de álcool + 0,5 mL de HCl) várias vezes até que a cor azul não ligado é ido. Montar as secções coradas utilizando 100 uL de solução para a preservação a longo prazo da montagem das lâminas.
      NOTA: A coloração azul das seções indica a presença de glicosaminoglicanos e glicoproteínas e será observável usando LM.
  3. diferenciação osteogênica
    1. Mais uma vez, a cultura das células isoladas a 70% de confluência, dissociam-se com a solução de tripsina comercial, e lavar e sedimento por centrifugação a 1500 xg durante 3 min.
    2. Subcultura das células a uma concentração de 100.000 células / poço de placas de 6 cavidades contendo 2 mL de CM em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C.
    3. Após 24 h, substituir o CM com meio de diferenciação osteogénica (0,1 μ; M dexametasona, 10 uM β-glicerofosfato, fosfato e ascorbato de 50? M) e continuar a incubação. Alterar o meio de diferenciação a cada 3 dias ou sempre que necessário.
    4. Após 3 semanas de incubação, fixar as células com 2 mL de 4% de paraformaldeído por poço, durante 30 min à temperatura ambiente e mancha com vermelho de alizarina para detectar a presença de uma deposição de cálcio, a fim de determinar a diferenciação osteogénica.
      NOTA: O paraformaldeído é tóxico. Por favor, praticar cuidado usando luvas e óculos durante o uso.
    5. Lavar suavemente as culas fixadas duas vezes com água destilada e trata-se com 2% mancha vermelho de alizarina (2 mL / poço numa placa de 6 poços) durante 1 h à temperatura ambiente no escuro.
    6. Retire o excesso de corante por lavar cuidadosamente com água da torneira para que os depósitos de cálcio não desalojar.
    7. Visualizar os depósitos de cálcio vermelho-coradas utilizando LM.

4. quantitativa da Transcriptase Reversa da Polimerase Chana Reacção (qRT-PCR) Análise

  1. Cultura das células isoladas a 70% de confluência, dissociam-se com a solução de tripsina comercial, lavar, e sedimento por centrifugação a 1500 xg durante 3 min, para isolar o ARN celular total.
  2. Lavam-se as células com PBS para remover vestígios de FBS, e depois prosseguir para o isolamento de ARN utilizando um kit de purificação de RNA comercial, seguindo as instruções do fabricante.
  3. Purifica-se o ARN total isolado por tratamento com ADNase a 37 ° C durante 30 min, utilizando um termociclador. Sintetizar cDNA usando kit comercial seguindo as instruções do fabricante.
  4. Preparar as reacções de 10 ul de PCR em triplicado numa placa de 96 pos, com cada reaco contendo 5 uL de SYBR verde de PCR Supermix; 3 ul de água bidestilada; 0,5 de cada iniciador, directo e inverso; e 1 uL do ADNc diluo (1:10).
  5. Executar PCR sob os seguintes parâmetros: 10 min a 98 ° C, seguido por 44 ciclos de 30 s cada em 98 &# 176; C, 20 s a 60 ° C, e 30 s a 72 ° C.
  6. Normalizar a amplificação dos genes-alvo para os genes de referência, GAPDH e β-actina; as sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela 1.

5. Análise Estatística

  1. Realizar todas as análises usando o software estatístico. Apresentar os dados como a média ± SEM. Os resultados com um valor de p (** p ≤ 0,01 e * P ≤ 0,05) foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

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A dissecção e Isolamento de células do cordão umbilical humano, Junção Cord-placenta, e Fetal Placenta

tecido perinatal consiste em três regiões anatómicas discretas. O primeiro é a UC, contendo duas artérias e uma veia, bem como duas zonas distintas: CL (o revestimento exterior do cabo) e WJ (material gelatinoso em torno dos vasos sanguíneos no interior do cabo). A segunda é CPJ (a ligação entre o cabo e da placenta), e o terceiro é FP, que é imediatamente depois da CPJ (a cabo é inserido na placenta, que é fixado à parede do útero da mãe). O esquema do protocolo de isolamento de células a partir de tecido perinatal está representado na Figura 1. As quatro fontes-Cl, WJ, CPJ, e FP-são claramente identificáveis e foram separados para isolar as células dos explantes, como mostrado na Figura 2. Tele aparência de crescimento celular a partir de culturas de explantes foi rotineiramente monitorados e gravados por LM. células fibroblastóides aderentes foram observadas após 3-4 dias de cultura os explantes CPJ. As células com morfologia semelhante apareceu 7-8, 9-10, e 11-14 dias após a cultura, os explantes WJ, CL, e FP, respectivamente. O crescimento de células dos explantes que representam as várias fontes (CL, WJ, CPJ, e FP) é representado na Figura 3A. Estas células foram consideradas como P0. Quando as células foram subcultivadas P0, que apareceu a crescer clonalmente, exibindo uma morfologia f ibroblastóide semelhante ao da BM-MSCs. No entanto, eles exibiram variação no tempo de duplicação da população, que varia desde 32 h até 94 h para as células de CPJ e FP, como mostrado na Figura 3B e C. As culas de WJ e CL tinham tempos de duplicação semelhantes medial ao CPJ e FP. Uma análise posterior das células P0 indicaram que também variou na CFE, variando de 16 a 92 colónias.As células do CPJ teve a mais alta (92), enquanto que as células de PF teve a mais baixa (16) CFE. As células a partir de Cl e WJ tinham valores de CFE de 59 e 80 colónias, respectivamente (Figura 4A-C). As células de CL tinham valores CFE semelhantes à BM-MSCs. Estes resultados sugerem que as células derivadas do CPJ têm capacidades proliferativas e auto-renovação mais elevados.

Imunoexpressão dos isolaram células

As células isoladas a partir do CL, WJ, CPJ, e FP foram investigados para a expressão de marcadores específicos de células. P3-5 células exibido expressão positiva para MSCs marcadores tais como CD29, CD44, CD73, CD90, e CD105 (Figura 5A e B). Estas células são também conhecidos para expressar classe principal de histocompatibilidade I Marker, HLA-ABC, e não expressam classe marcador II, HLA-DR 3. As percentagens de células positivas para these marcadores seleccionados a partir de todas as quatro fontes foram semelhantes aos expressos pela norma BM-MSCs. No entanto, as proporções de IFM indicam que WJ- e células CPJ-derivados são quase semelhantes e são ainda mais elevados do que o CL e células FP-derivados (Figura 5C). Curiosamente, apesar de diferentes valores de CFE, todas as células a partir de diferentes fontes expressaram níveis similares de marcadores MSC. Com base nos resultados de marcadores de superfície de células, as células isoladas a partir de todos os quatro fontes foram consideradas como as MSCs. Uma análise mais aprofundada destes células revelou que eles também expressam genes de pluripotência, OCT4, NANOG, KLF4, e SOX2, como mostrado na Figura 5D. O CPJ-MSC tinha a mais alta expressão de marcadores de pluripotência, seguido por WJ-, CL e FP-MSC.

Potencial de diferenciação das MSCs isoladas

O padrão-ouro para a caracterização de MSCs é sua capacidade de diferentiate em várias linhagens. Os nossos resultados mostraram que as MSCs isoladas a partir de todas as fontes prontamente perinatais diferenciadas em tipos de culas adipogicas, condrogénicas, e osteogicas. Derivados adipogicas produzidas gotículas lipídicas que foram positivamente coradas com Oil Red O, como mostrado na Figura 6A. Toluidina coloração azul do derivado condrogénica de MSC demonstraram a presença de proteoglicanos e glicoproteínas que auxiliaram na produção de matriz extracelular (Figura 6B). Derivados de MSC osteogicas positivamente coradas com vermelho de alizarina indicar a presença dos depósitos de cálcio envolvidos na mineralização do osso, conforme mostrado na Figura 6C.

Como se esperava, a análise da transcrição das MSCs isoladas a partir de todas as fontes mostrou diferenciação de trilinhagem (Figura 6D -F). No entanto, o poteential de diferenciação variadas, dependendo da fonte de MSCs. derivados adipogicas de WJ-MSC foram 2 vezes maiores níveis de genes seleccionados adipogicas (CEBPβ, FABP4, e de PPAR?), em comparação com o CPJ-MSCs de expressão. CL e FP-MSC tinha a menor expressão destes genes. No caso de diferenciao condrogica, derivados CPJ-MSCs expressa genes seleccionados condrogénicas (SOX9 e COL2) 50 vezes mais elevada do que os derivados WJ- e FP-MSCs. Semelhante à pobre diferenciação adipogica de CL-MSC, que tinham menor potencial condrogénico, como evidente pela menor expressão de genes condrogénicas. CPJ-MSC também apresentaram o maior potencial de diferenciação osteogénica, tal como indicado pelos neis de transcritos de 2 vezes mais elevados de genes seleccionados osteogénicas (COL1, OPN, e OCN). No entanto, a expressão do marcador de progenitor foi mais elevada em RUNX2 derivados osteogénicas de WJ-MSC, indicando que estas células eram lento na resposta a condições de diferenciação. Mais uma vez, CL-MSCs mostraram pobresa diferenciação em linhagem osteogica. Estes resultados sugerem que CPJ-MSCs e WJ-MSCs exibida maior potencial de diferenciação de CL e FP-MSCs. A CL-MSC tinha o menor potencial para se diferenciarem em derivados das três linhagens.

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Figura 1: Representação esquemática do isolamento de células a partir de Cordão Umbilical, Junção Cord-placenta, e Fetal Placenta. Inspeccionar a amostra recolhida e prosseguir com a dissecção. Passo 1. dissecar manualmente e separar a amostra de medula / placenta em três regiões discretas: cordão umbilical (UC), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP). Separaram-se as duas zonas distintas de UC em cordão de revestimento (CL) e de Wharton Jelly (WJ) utilizando tesouras e pinças. Passo 2. Cortar cada um dos tecidos dissecados separadamente em 1-tO pedaços de 2 mm utilizando uma tesoura e parcialmente digerir as peças. Passo 3. Cultura os pedaços de tecido. Passo 4. Isolar as células dos explantes por tratamento com tripsina. Subcultura e caracterizar as células isoladas. Passo 5. As células isoladas e caracterizadas podem ser amplificados e usados para várias aplicações. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: A dissecção e cultura de explantes a partir de Cordão Umbilical, Junção Cord-placenta, e Fetal Placenta. São mostrados três diferentes regiões anatómicas da amostra de medula / placenta: UC (dividida em CL e WJ), o CPJ, e FP, bem como as artérias e veias associado. CL, WJ, CPJ,e FP foram separados por dissecção manual para isolar as células dos explantes. Cada uma das regiões dissecadas foi cortado separadamente em fragmentos pequenos e cultivadas em 75 cm 2 placas utilizando 9 mL de CM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Morfologia de culas isoladas a partir de Cordão Umbilical, Junção Cord-placenta, e Fetal Placenta. (A) crescimento celular a partir de explantes de CL, WJ, CPJ, e FP, como visualizado por LM. (B) Subcultura de células isoladas a partir de Cl, WJ, CPJ, e explantes FP apresentaram morfologia f ibroblastóide. A barra de escala representa 100 um (ampliação: 4X). (C) População tempo de duplicação de tele isolou células do CL, WJ, CPJ, e FP. BM-MSCs foram utilizados como um padrão. As barras de erro representam o erro padrão da média das medições em triplicado (** p ≤ 0,01 e * P ≤ 0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Eficiência de Células de Cordão Umbilical, Junção Cord-placenta, e Fetal Placenta formadoras de colónias. (A) o crescimento das células (P0) isoladas a partir de CL, WJ, CPJ, e FP, colocadas em placas a uma densidade clonal de 1,63 células / cm2, foram visualizados por LM. (B) As fotomicrografias de células coradas com violeta de cristal exibindo capacidade de formação de colónias. (C) uma única colónia de células coradas with violeta cristal. As barras de escala representam 100 um (ampliação: 4X). (D) representação gráfica do número de colónias formadas a partir das células derivadas de CL, WJ, CPJ, e FP. BM-MSCs foram utilizados como um padrão. As barras de erro representam o erro padrão da média das medições em triplicado (** p ≤ 0,01 e * P ≤ 0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Análise de MSC marcadores expressos pelas culas isoladas a partir de Cordão Umbilical, Junção Cord-placenta, e Fetal Placenta. (A) Expressão de marcadores de superfície mesenquimais (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 e) pelas células a partir de Cl, WJ, CPJ, e FP, como dissuadirminado por citometria de fluxo. (B e C) Representação gráfica das percentagens de culas positivas e as proporções medianas intensidade de fluorescência (IMF) para os marcadores de superfície mesenquimais seleccionados. rácios de MFI foram calculados dividindo o valor MFI do marcador (gerada pelo software com base na intensidade de fluorescência de populações de células fechadas) pelo valor MFI do isotipo. As barras de erro representam o erro padrão da média das medições em triplicado. (D) Expressão dos genes de pluripotência (OCT4, NANOG, KLF4, e SOX2) pelas células a partir de Cl, WJ, CPJ, e FP, tal como determinado por qRT-PCR. (** p ≤ 0,01 e * P ≤ 0,05). a expressão do gene foi normalizado para GAPDH e β-actina, e as barras de erro representam o erro padrão da média das medições em triplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 6: multilinhagens diferenciação das MSCs isoladas do cordão umbilical humano, Junção Cord-placenta, e Fetal Placenta. As células (A) foram incubadas em meio de diferenciao adipogica, durante 3 semanas e coradas com Oil Red O, indicando a presença de gotículas de gordura. (B) As pelotas de células foram incubadas em meio de diferenciao condrogica, durante 3 semanas. criocortes histológicos de culturas de pelotas foram coradas com azul de toluidina, indicando a presença de glicosaminoglicanos. (C) As células foram incubadas em meio de diferenciação osteogénica durante 3 semanas e coradas com vermelho de alizarina, exibindo a produção de depósitos de cálcio, sugerindo a mineralização óssea. Todas as imagens foram obtidas por LM. A barra de escala representa 100 um (ampliação: 4X). BM-MSCs nósre utilizado como um padrão. (DF) Expressão de genes seleccionados (CEBPβ, FABP4, e PPARy; SOX9, ACAN, e COL2; e COL1, RUNX2, OPN, e OCN representando a diferenciação das MSCs em adipogica, condrogénica, e linhagens osteogénicas, respectivamente), tal como determinado por análise de qRT-PCR (** p ≤ 0,01 e * P ≤ 0,05). a expressão do gene foi normalizado para GAPDH e β-actina, e as barras de erro representam o erro padrão da média das medições em triplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gene Seqüências de primers Comprimento do produto
OCT4 Forward-CCCCTGGTGCCGTGAA 97
Reverse-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG
NANOG AAAGAATCTTCACCTATGCC Encaminhar 110
GAAGGAAGAGGAGAGACAGT reversa
KLF4 Encaminhar CGAACCCACACAGGTGAGAA 94
reversa TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC
SOX2 TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA Encaminhar 75
reversa CTGGGGCTCAAACTTCTCTC
SOX9 Encaminhar AGCGAACGCACATCAAGAC 85
reversa CTGTAGGCGATCTGTTGGGG
COL2 Encaminhar CTCGTGGCAGAGATGGAGAA 252
reversa CACCAGGTTCACCAGGATTG
UMA LATA AGCCTGCGCTCCAATGACT Encaminhar 103
COL1 AAGGTCATGCTGGTCTTGCT Encaminhar 114
reversa GACCCTGTTCACCTTTTCCA
RUNX2 Encaminhar TGCTTCATTCGCCTCACAAA 111
reversa AGTGACCTGCGGAGATTAAC
OPN Encaminhar CATACAAGGCCATCCCCGTT 112
reversa TGGGTTTCAGCACTCTGGTC
OCN TAAACAGTGCTGGAGGCTGG Encaminhar 191
reversa CTTGGACACAAAGGCTGCAC
CEBPβ Encaminhar TATAGGCTGGGCTTCCCCTT 94
reversa AGCTTTCTGGTGTGACTCGG
FABP4 TTAGATGGGGGTGTCCTGGT Encaminhar 158
reversa GGTCAACGTCCCTTGGCTTA
PPAR? Encaminhar GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC 74
reversa ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG
GAPDH ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG Encaminhar 101
reversa GCCATCACGCCACAGTTTC
ACTIN AATCTGGCACCACACCTTCTAC Encaminhar 170
reversa ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC

Tabela 1: Lista de Primer Seqüências Humanos utilizados neste estudo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os recentes avanços na investigação sobre células estaminais não só melhorou a compreensão dos processos básicos de desenvolvimento, mas também proporcionou oportunidades promissoras para o uso de células-tronco em biotecnologia, farmacêutica, terapia celular, medicina regenerativa, e aplicações de engenharia de tecidos 18, 19, 20. Enquanto os CES pluripotentes isoladas de embriões são a mais promissora, eles enfrentam desafios técnicos e dilemas éticos 21, 22, 23. As células induzidas pluripotentes estaminais (iPSCs) derivadas de células adultas fornecer uma alternativa, mas eles também enfrentam problemas técnicos e de segurança similares 23. Além disso, iPSCs podem não ser estáveis ​​geneticamente ou podem ter sido submetidos a mudanças genéticas, limitando assim o seu uso terapêutico. As células-tronco também foram relatados em uma variedade de tis pós-natalsues e órgãos. As fontes mais comuns destas ASC são a medula óssea, tecido adiposo e tecido muscular. No entanto, a partir de fontes ASC pós-natais têm limitado potencial de crescimento e de diferenciação 24, 25. Eles também sofrem devido ao envelhecimento e exposição a pressões ambientais e, portanto, nem sempre são eficazes para aplicações terapêuticas 26, 27, 28. Isso nos e outros, levaram a procurar novas fontes de células-tronco que são mais ingênua do que ASC.

Nós temos investigado fontes perinatais para células estaminais primitivas como uma alternativa a ASC. Neste relatório, é proporcionado um método fiável, robusto e simples para isolar as MSCs humanas a partir de amostras de medula / placenta. Em comparação com outras fontes e os métodos utilizados para o isolamento de ASCs, este método proporciona um método eficaz e não invasivo para o isolamento de grandes quantidades de higMSCs h-qualidade. Acentua ainda mais o maior potencial de crescimento e diferenciação das MSCs perinatais em comparação com as MSCs a partir de fontes de adulto, tais como BM.

A UC anexando o feto para a placenta é um grande órgão com regiões anatómicas distintas, incluindo duas artérias, uma veia, Cl, e WJ (tecido que envolve os vasos sanguíneos). Diversos estudos relataram o isolamento de MSCs a partir de todo o cabo, o WJ, ou a placenta, com um crescimento variável e diferenciação potenciais de 25, 29. No entanto, até à data, nenhum estudo efectivamente investigado e comparado as células de diferentes regiões anatómicas da amostra de medula / placenta. Nós fornecemos aqui um método sistemático e simples para a dissecção da UC, o CPJ, e conectado FP para o isolamento de MSCs. Mostramos também um protocolo abrangente e simples para caracterizar e avaliar a qualidade das células isoladas por determinação da sua capabil proliferaçãodades, bem como as suas potencialidades auto-renovação e diferenciação. Este método é reprodutível e origina uma grande quantidade de MSCs de qualidade superior.

Descobrimos que a digestão parcial de pedaços de tecido de 1-2 mm de tamanho utilizando uma solução de tripsina comercial que produziu as células reprodutível a partir dos explantes, enquanto que a digestão completa de tecido em células individuais tiveram rendimentos pobres de células isoladas. No entanto, um estudo relatou que maiores explantes de tecido de UC aproximadamente 10 mm de tamanho foram óptimos para o isolamento de células 30. Por outro lado, outro estudo sugere que o método de explante de tecido resultou em um ciclo de cultura mais longo e menor rendimento de células em comparação com o método de digestão com enzimas de 31. Em relatórios anteriores, o tratamento de tecidos com fio colagenase II e hialuronidase, separadamente ou na sequência da tripsina, foram realizadas para isolar células do cordão 32, 33 , 34. Não só há uma grande variação nos métodos de digestão do tecido do cordão antes da cultura, mas também as células isoladas parecia ser heterogêneo. O uso de enzimas duras por períodos de tempo mais longos pode degradar a membrana celular, que afecta a adesão e proliferação celular. Os resultados deste método revelou que parcialmente digeridos explantes de tecido perinatais fornecida crescimento de células sem causar dano celular extensa, manteve a viabilidade, e obteve-se maiores quantidades de populações homogéneas de MSCs.

Embora o protocolo para a dissecção e isolamento de células a partir dos explantes é simples, alguns dos passos podem provar ser um desafio. Em primeiro lugar, garantir a adesão explante, permitindo a sua fixação à superfície do frasco de cultura. Isto pode ser facilitada pela utilização de uma pequena quantidade de meio, cobrindo apenas os pedaços de tecido para as primeiras 2 h de cultura, e, em seguida, adicionando cuidadosamente o meio restante. Segunda, limitar o número de explantes para menos do que 15 por frasco T75. Muito pouco espaço entre as peças ou muitas peças por frasco são inibitórios para crescimento celular. Terceiro, os pedaços de tecido que não aderem à superfície do frasco de cultura após 3 dias de incubação deve ser transferida para um novo frasco de cultura e aderência. Em quarto lugar, pedaços de tecido a ser cultivado deve ser livre de detritos celulares, que inibe a ligação. Em quinto lugar, a cultura de grandes pedaços requer mais médio e não melhora a eficiência conseqüência celular. Por fim, as culturas de explantes monitorizar de perto, em particular após o aparecimento de crescimento de células, como as células podem tornar-se rapidamente confluente e diferenciar dependendo da fonte de tecido. Algumas limitações da técnica incluem a falta de especialização em dissecando as amostras para separar o CL, WJ, CPJ, e FP; um pequeno tamanho da amostra, o que resulta em baixo rendimento WJ; e retardados de processamento-as amostras são obrigados a ser processado dentro de 2-4 h de recolha de avoID de uma perda na recuperação de células.

O padrão de ouro para a caracterização das MSCs é a capacidade de aderir ao plástico, formar o fenótipo fibroblástica, e diferenciar-se em múltiplas linhagens. Estes são também os critérios normalmente utilizados para a definição de MSC, conforme descrito pelo ISCT 35. Neste estudo, as células isoladas a partir de todos os quatro fontes eram aderentes ao plástico e tiveram express positiva para os marcadores de MSC (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 e), mas a expressão negativa para o marcador CD45 hematopoiético. Além disso, eles expressa antigénio de leucócitos humanos (HLA) de classe I, mas foram negativos para HLA de classe II. Em comparação com o BM-MSCs, WJ- e células CPJ-derivados eram mais elevados. Estes resultados são consistentes com os relatórios anteriores de UC-derivado MSC 33, 36, 37, 38. Além disso, os nossos resultados mostraram que CL, WJ-, CPJ-, FP-MSC expressa plurigenes de potência, tais como OCT4, NANOG, e SOX2; no entanto, a sua expressão foi mais baixa do que a de CES, como relatado anteriormente 39. Estes resultados eram também de acordo com um estudo anterior que relataram a expressão de marcadores de pluripotência em células perinatais-40 derivada. Curiosamente, verificou-se que a expressão do marcador pluripotentes foi maior em CPJ-MSC do que em células isoladas a partir de outras fontes. Observou-se também que a UC-MSCs exibiu maior potencial de auto-renovação do BM-MSCs 41. Curiosamente, apesar de semelhança das suas características fenotípicas, as células isoladas a partir dos quatro fontes tinham valores CFE variáveis. No entanto, com exceção de FP-MSC, todos eles tinham melhores valores CFE que BM-MSCs. CPJ-MSCs teve o maior valor CFE e taxa de proliferação quando comparado com todos os outros MSCs. Além disso, WJ- e CPJ-MSC exibidos os potenciais de diferenciação mais elevadas do que BM-MSCs. CL-MSC mostrou a diferenciação menospotencial em todas as três linhagens (ou seja, adipogica, condrogénica, e osteogénicas), enquanto CPJ-MSC teve o maior potencial de diferenciação de trilinhagem e FP-MSCs exibiu o potencial de diferenciação menos adipogica.

Em conclusão, os nossos resultados mostraram que a qualidade e quantidade de MSCs isoladas diferiu entre os quatro fontes na amostra de medula / placenta. CPJ-MSCs tinha mais capacidade de proliferação e maior potencial de auto-renovação. Eles também foram potentes na sua diferenciação em tipos de células de trilinhagem. Devido ao seu baixo tempo de duplicação, CPJ-MSC pode ser rapidamente expandido 1000 vezes e utilizadas para a droga de alto rendimento ou rastreio biomaterial. Essas células poderiam ser uma fonte mais promissora para a terapia celular e aplicações de medicina regenerativa.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estudo foi apoiado pela OU-WB ISCRM, Oakland University e Michigan Head and Spine Institute. N. Beeravolu e C. McKee recebeu o Prêmio de Pesquisa de Pós-Graduação Provost da Universidade de Oakland. Agradecemos S. Bakshi pela revisão do manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM com 4.500 mg/mL de glicoseInvitrogen11995065
FBSAleken BiologicalsFBSS500
Isobutil-metilxantinaSigmaI5879-250mg
DexametasonaSigmaD4902-100mg
InsulinaProspecCYT-270
IndometacinaSigmaI7378-5G
TGFβ 1ProspecCYT-716
Ácido ascórbicoSigmaA-7631
Ascorbato 2-fosfatoSigmaA-8960
β-glicerofosfatoSigmaG-6251
TrypLEInvitrogen50591419
GeneJET Kit de purificação de RNAThermo ScientificK0732
DNasePromegaM6101
kit iScriptBiorad1708891
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix KitBiorad1725274
4% paraformaldeídoAffymetrix19943
OCTThermo ScientificSH75-125D
Óleo Vermelho O American MasterTech ScientificSTORO100
Toluidine blueThermo ScientificS71363
Cristal violetaSigmaC3886
Alizarin red stainThermo ScientificS25131
APC Mouse anti-Human CD29BD Biosciences 
APC Mouse anti-humano CD34BD Biosciences 
FITC Mouse anti-Human CD44BD Biosciences 
FITC Mouse anti-Human CD45BD Biosciences 
APC Mouse anti-Human CD73BD Biosciences 
FITC Mouse anti-Human CD90BD Biosciences 
APC Mouse anti-Human CD105BD Biosciences 
CentrífugaIEC93522M-2
CO2 incubadoraThermo ScientificHera Cell 150i
Microscópio óptico (LM)Nikon Instruments Inc.Olympus
HemacytometerThermo Scientific0267151B
CryostatLeicaCM3050 S
FACS Canto II e Diva SoftwareBD Biosciences Canto II 
TermocicladorMJ Research Inc.PTC-100
Bio-RadCFX96
559883555824555478555482560847561969 562408 Sistema de PCR em Tempo Real

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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