Uma avaliação funcional da junção neuromuscular (JNM) pode fornecer informações essenciais sobre a comunicação entre o músculo e do nervo. Aqui descrevemos um protocolo para avaliar exaustivamente o músculo e o MNJ funcionalidade usando duas preparações diferentes de nervo-músculo, ou seja, sóleo-isquiático e frênico-diafragma.
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Artigo de método
Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Funcionalidade de junção neuromuscular (JNM) desempenha um papel crucial ao estudar as doenças em que a comunicação entre neurônio motor e músculo é prejudicada, como envelhecimento e esclerose lateral amiotrófica (ela). Aqui descrevemos um protocolo experimental que pode ser usado para medir a funcionalidade MNJ combinando dois tipos de estimulação elétrica: direto de estimulação da membrana muscular e a estimulação através do nervo. A comparação da resposta muscular para esses dois estímulos diferentes pode ajudar a definir, a nível funcional, potenciais alterações no MNJ que levam ao declínio funcional no músculo.
Preparações dex vivo E são adequadas para estudos bem controlados. Aqui descrevemos um protocolo intensivo para medir vários parâmetros do músculo e funcionalidade Nicotínico para a preparação do nervo isquiático-sóleo e para a preparação nervo frênico-diafragma. O protocolo dura aproximadamente 60 minutos e é realizado ininterruptamente por meio de uma custom-made software que mede as propriedades de cinética de contração muscular, a relação força-frequência de estimulação do músculo e do nervo e dois parâmetros específicos para a funcionalidade de JNM, ou seja, falha de neurotransmissão e fadiga intratetanic. Esta metodologia foi utilizada para detectar danos em preparações de nervo-músculo sóleo e diafragma usando SOD1G93A mouse transgénico, um modelo experimental de ALS que ubiquitously overexpresses o mutante antioxidante da enzima superóxido dismutase 1 (SOD1).
Introdução
Junção neuromuscular (JNM) é uma sinapse química formada pela conexão entre a placa terminal motor da fibra muscular e o axônio do neurônio motor terminal. O MNJ foi mostrado para jogar um papel crucial, quando a comunicação entre o músculo e do nervo é prejudicada, como ocorre no envelhecimento ou esclerose lateral amiotrófica (ela). Como o músculo e nervo comunicar-se em uma maneira de bidirecional1,2, sendo capaz de medir defeitos MNJ separadamente do músculo defeitos pode fornecer novos insights sobre sua interação fisiopatológica. Com efeito, esta avaliação funcional pode ajudar a avaliar se alterações morfológicas ou bioquímicas reduzem neurotransmissão funcionalidade de sinalização.
A comparação da resposta contrátil muscular, provocada pela estimulação do nervo e a resposta do mesmo músculo evocado por estimulação direta de sua membrana tem sido proposta como uma medida indireta da funcionalidade do MNJ. Com efeito, desde a membrana neurotransmissão de by-pass de estimulação sinalização, quaisquer diferenças nas duas respostas contráteis podem são imputáveis mudanças no MNJ. Esta abordagem foi extensivamente proposta para ratos3,4,5,6,7e também usada para reunir informações sobre modelos de rato8,9,10,11,12.
Aqui, descrevemos em detalhe um procedimento para excisar e testar duas preparações nervo-músculo, i. e. as preparações sóleo-isquiático e frênico-diafragma. Usando um Custom-Made software, nós projetamos um protocolo de teste contínuo que combina a medição de vários parâmetros que caracterizam a funcionalidade tanto Mioneural e músculo, desse modo, produzindo uma avaliação abrangente dos prejuízos MNJ separadamente do músculo. Em particular, o protocolo mede a força de contração muscular, a cinética de músculo, a curva força-frequência para direta e estímulos nervosos, a neurotransmissão falha13 para um despedimento e as frequências tetânica e a fadiga intratetanic7.
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade Sapienza de Roma-Unidade de Histologia e Embriologia Médica e foram realizados de acordo com a versão atual da Lei Italiana sobre a Proteção de Animais.
1. Configuração experimental
- Monte o sistema experimental composto por 1 atuador/transdutor, 2 estimuladores, 1 aparelho muscular in vitro, 1 banho de tecido preparatório, 1 eletrodo de sucção, 1 osciloscópio digital, 1 estereomicroscópio, 1 iluminador de luz fria, 1 placa de aquisição, 1 bloco de conexão e um computador pessoal.
NOTA: Neste caso, o software de comando foi programado em LabView e foi projetado para garantir alta flexibilidade, precisão e reprodutibilidade das estimulações. Para cada estimulação, o usuário pode selecionar a largura do pulso, a frequência, a duração e decidir se a estimulação é aplicada à membrana ou através do nervo. O usuário também pode selecionar a duração do período de repouso antes de cada estimulação.
2. Avaliações das propriedades contráteis da JNM dos músculos sóleo e diafragma
- Aquecimento do sistema
- Prepare o tampão de Krebs Ringer14 e coloque-o em um banho do aparelho de montagem e no banho de tecido preparatório. Coloque uma placa de 60 mm preparada com 4 ml de silicone no banho de tecido preparatório.
- Ligue o banho de água circulante e ajuste a temperatura para 30 °C para o músculo sóleo e para 27 °C para o músculo diafragma.
- Permita que uma mistura de 95% O2 - 5% CO2 flua para ambos os banhos.
- Ligue o atuador/transdutor e os dois estimuladores de pulso e ajuste os valores de corrente para 300 mA para estimulação da membrana e para 5 mA para estimulação do nervo.
NOTA: O valor de corrente de 300 mA já foi previamente demonstrado não induzir contração significativa nos ramos nervosos quando a D-tubocurarina é adicionada à solução15. O valor de corrente de 5 mA corresponde à quantidade necessária para estimular o músculo através do nervo, sem gerar sobreposição com a estimulação da membrana induzida pela solução. Como a distância entre o eletrodo de sucção e o músculo depende do comprimento do nervo, esse valor de corrente deve ser cuidadosamente ajustado antes de cada experimento, conforme descrito abaixo.
- Dissecação dos músculos sóleo e diafragma
- Sacrifique o camundongo por dislocação cervical para minimizar o sofrimento e imediatamente remova os músculos para teste conforme descrito a seguir.
- Preparação do sóleo-ciático, dissecação e montagem
- Aspergir etanol 70% na pata do camundongo e remover a pele que cobre a pata. Faça uma incisão na parte superior da pata com uma tesoura e, em seguida, puxe firmemente a pele. Isole o tendão de Aquiles da tíbia e, então, corte o tendão de Aquiles com uma tesoura.
- Prenda firmemente o tendão com uma pinça e puxe suavemente o músculo gastrocnêmio junto com o sóleo. Quando o tendão proximal do sóleo for exposto, corte toda a panturrilha com uma tesoura, mantendo ainda o tendão de Aquiles. Coloque imediatamente a amostra de tecido no banho de tecido preparatório.
- Coloque o banho preparatório sob o microscópio estereoscópico e fixe a panturrilha na placa de silicone usando pinos de aço inoxidável com diâmetro de 0,20 mm. Com uma pinça, prenda o tendão proximal do sóleo e puxe suavemente para expor a inervação ciática.
- Quando a inervação for exposta (Figura 1), remova cuidadosamente o tecido circundante para expor cerca de 5 mm do nervo. Use uma tesoura fina para cortar o nervo. Enquanto segura firmemente o sóleo no tendão proximal com uma pinça, puxe novamente e remova-o cortando o tendão de Aquiles com uma tesoura.
- Passe um fio de náilon através do orifício do braço da alavanca do atuador/transdutor. Crie um laço na extremidade do fio e segure o tendão de Aquiles antes de puxar o fio de volta até que o músculo alcance o banho do aparelho de montagem. Prenda o tendão proximal na braçadeira fixa e amarre o fio de náilon ao redor do braço da alavanca. Deixe o músculo se equilibrar na solução.
- Determine o comprimento inicial ótimo (L0).
- Primeiro, estique o músculo para pré-carregá-lo em 10 mN (esse valor garante a força máxima de contração rápida, com base na experiência). Em seguida, estique suavemente o músculo para alterar o pré-carga e estimule-o com uma série de pulsos únicos. O comprimento ótimo é alcançado quando a força máxima de contração rápida é medida.
- Preparação do diafragma-frênico, dissecação e montagem
- Aspergir etanol 70% na pele do camundongo. Remova a pele que cobre o músculo diafragma fazendo uma incisão sobre o esterno com uma tesoura e puxando firmemente a pele.
- Com uma tesoura, corte o abdome horizontalmente abaixo do esterno e remova suavemente o intestino e os órgãos com uma pinça. Use uma tesoura grossa para cortar a coluna vertebral.
- Corte as costelas cerca de 1 cm acima do esterno e prossiga horizontalmente. Remova suavemente os órgãos externos com uma pinça e corte a coluna vertebral para obter um anel circular de costelas contendo o diafragma.
- Lave a preparação em uma placa contendo o tampão de Krebs Ringer e, em seguida, coloque-a na placa de silicone dentro do banho de tecido preparatório, com o lado superior voltado para cima e o esterno voltado para frente.
- Usando o microscópio estereoscópico, remova cuidadosamente os pulmões e os órgãos remanescentes; o nervo frênico será visível no lado direito (Figura 2A).
- Recorte as costelas para deixar um anel de aproximadamente 2 mm ao longo de todo o diafragma.
- Com uma pinça, fixe um pino de aço inoxidável com diâmetro de 0,20 mm no tendão central do diafragma no ponto correspondente à inervação pelo nervo frênico, e outro pino nas costelas no mesmo eixo para identificar a faixa de diafragma de interesse.
- Fixe dois pinos adicionais no tendão central e outros dois pinos nas costelas em ambos os lados da faixa selecionada para estender o diafragma. Se necessário, limpe o nervo frênico do tecido conjuntivo circundante usando uma pinça.
- Usando uma lâmina curva, corte o diafragma em ambos os lados da inervação para identificar uma faixa de tendão-músculo-costela conforme mostrado na Figura 2B.
- Passe um fio de náilon através do orifício do braço da alavanca do atuador/transdutor. Crie um laço na extremidade do fio e segure o tendão antes de puxar o fio de volta até que o músculo alcance o banho do aparelho de montagem.
- Prenda as costelas na braçadeira fixa e amarre o fio de náilon ao redor do braço da alavanca.
- Deixe o músculo se equilibrar na solução e determine o comprimento inicial ótimo (L0).
- Estique o músculo para pré-carregá-lo em 5 mN. Estique suavemente o músculo para alterar o pré-carga e estimule-o com uma série de pulsos únicos. O comprimento ótimo é alcançado quando a força máxima de contração rápida é medida.
Figura 1 - Preparação do nervo ciático-sóleo. Nervo ciático-sóleo durante a cirurgia para os testes funcionais. O ciático é exposto utilizando um par de pinças. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2 - Preparação do diafragma com nervo frênico. A imagem mostra uma fase da dissecação da preparação do diafragma com nervo frênico (A) e a tira a ser montada para testes funcionais (B). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
- Medindo propriedades da junção neuromuscular separadamente da contratilidade muscular
- Defina a intensidade de corrente ideal para a estimulação através do nervo e verifique que os pulsos de corrente entregues pelo eletrodo de sucção não provocam contração muscular pela dispersão da corrente no banho.
- Posicione o eletrodo de sucção próximo ao músculo e puxe o nervo para dentro dele. Aumentando gradualmente a intensidade da corrente (iniciando em 5 mA), estime o músculo com uma série de pulsos únicos. O valor ideal de corrente é determinado quando a força do contração tônica for máxima.
- Empurre o nervo para fora do eletrodo e aplique alguns pulsos únicos. Certifique-se de que o músculo não contraia devido à sobreposição com a estimulação da membrana por meio da solução. Puxe novamente o nervo para dentro do eletrodo.
- Inicie o programa e selecione o arquivo de entrada para executar o protocolo de teste desejado.
NOTA: O arquivo de entrada inclui todos os parâmetros de estimulação necessários para executar todo o protocolo. Embora a mesma estrutura de protocolo seja usada para os dois músculos, os parâmetros de estimulação diferem dependendo de o protocolo se referir aos músculos sóleo ou diafragma.- Estimulação do nervo ciático-sóleo (ver Tabela 1)
- Utilize as seguintes larguras de pulso para todas as estimulações elétricas: 1,4 ms para estimulação do nervo ciático e 0,1 ms para estimulação direta do sóleo. O protocolo completo dura aproximadamente 65 min.
- Estimulação do nervo frênico-diafragma (ver Tabela 2)
- Utilize as seguintes larguras de pulso para todas as estimulações elétricas: 1,8 ms para estimulação do nervo frênico e 0,2 ms para estimulação direta do diafragma. O protocolo completo dura aproximadamente 55 min.
- No final do protocolo experimental, meça o comprimento e o peso úmido do músculo utilizando um paquímetro analógico com precisão de 0,05 mm e uma balança de precisão com precisão de 0,1 mg, respectivamente.
- Calcule a área da seção transversal (AST) dividindo a massa muscular pelo produto do comprimento ótimo da fibra (Lf) e pela densidade do músculo esquelético de mamífero (1,06 mg/mm3)16.
NOTA: Lf é obtido multiplicando L0 pela razão entre o comprimento da fibra e o comprimento do músculo (0,71 para o músculo sóleo16 e 1 para o músculo diafragma17).
- Calcule a área da seção transversal (AST) dividindo a massa muscular pelo produto do comprimento ótimo da fibra (Lf) e pela densidade do músculo esquelético de mamífero (1,06 mg/mm3)16.
- Estimulação do nervo ciático-sóleo (ver Tabela 1)
- Defina a intensidade de corrente ideal para a estimulação através do nervo e verifique que os pulsos de corrente entregues pelo eletrodo de sucção não provocam contração muscular pela dispersão da corrente no banho.
| Tipo de experimento | Frequência | Duração | Repetições | Estimulação muscular ou nervosa | Objetivo |
| (Hz) | (s) | ||||
| Contração única | Impulso único | 1 | Músculo | Força e cinética da contração única | |
| Repouso | 30 | ||||
| Contração única | Impulso único | 1 | Nervo | ||
| Repouso | 30 | ||||
| Contração única | Impulso único | 1 | Músculo | ||
| Repouso | 30 | ||||
| Contração única | Impulso único | 1 | Nervo | ||
| Repouso | 120 | ||||
| Tetania incompleta | 40 | 0,8 | 1 | Nervo | Curvas força/frequência para estimulações nervosas e musculares |
| Repouso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 60 | 0,8 | 1 | Músculo | |
| Repouso | 180 | ||||
| Tetania completa | 80 | 0,8 | 1 | Nervo | |
| Repouso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 20 | 0,8 | 1 | Músculo | |
| Repouso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 60 | 0,8 | 1 | Nervo | |
| Repouso | 180 | ||||
| Tetania completa | 80 | 0,8 | 1 | Músculo | |
| Repouso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 20 | 0,8 | 1 | Nervo | |
| Repouso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 40 | 0,8 | 1 | Músculo | |
| Repouso | 300 | ||||
| Paradigma de fadiga | 35 | 0,8 | 1 estimulação muscular seguida por 14 estimulações nervosas com intervalo de repouso de 1,2 s cada, repetido 20 vezes | Falha na neurotransmissão (NF) | |
| Repouso | 900 | ||||
| Paradigma de fadiga | 80 | 0,8 | 1 estimulação muscular seguida por 14 estimulações nervosas com intervalo de repouso de 1,2 s cada, repetido 20 vezes | Falha na neurotransmissão (NF) e fadiga intratetânica (IF) | |
Tabela 1 - Protocolo de estimulação do nervo ciático-sóleo. A tabela lista a sequência de testes que compõem o protocolo completo para testar preparações do nervo ciático-sóleo.
| Tipo de experimento | Frequência | Duração | Repetições | Estimulação muscular ou nervosa | Objetivo |
| (Hz) | (s) | ||||
| Contração única | Impulso único | 1 | Músculo | Força e cinética da contração única | |
| Repouso | 30 | ||||
| Contração única | Impulso único | 1 | Nervo | ||
| Repouso | 30 | ||||
| Contração única | Impulso único | 1 | Músculo | ||
| Repouso | 30 | ||||
| Contração única | Impulso único | 1 | Nervo | ||
| Repouso | 120 | ||||
| Tetania incompleta | 60 | 0,5 | 1 | Nervo | Curvas força/frequência para estimulações nervosa e muscular |
| Repouso | 120 | ||||
| Tetania completa | 100 | 0,5 | 1 | Músculo | |
| Repouso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 40 | 0,5 | 1 | Nervo | |
| Repouso | 120 | ||||
| Tetania incompleta | 20 | 0,5 | 1 | Músculo | |
| Repouso | 120 | ||||
| Tetania incompleta | 80 | 0,5 | 1 | Nervo | |
| Repouso | 150 | ||||
| Tetania incompleta | 80 | 0,5 | 1 | Músculo | |
| Repouso | 150 | ||||
| Tetania incompleta | 20 | 0,5 | 1 | Nervo | |
| Repouso | 120 | ||||
| Tetania completa | 100 | 0,5 | 1 | Músculo | |
| Repouso | 150 | ||||
| Tetania completa | 100 | 0,5 | 1 | Nervo | |
| Repouso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 60 | 0,5 | 1 | Músculo | |
| Repouso | 300 | ||||
| Paradigma de fadiga | 35 | 0,33 | 1 estimulação muscular seguida por 14 estimulações nervosas com tempo de repouso de 0,67 s cada, repetido 20 vezes | Falha na neurotransmissão (FN) | |
| Repouso | 900 | ||||
| Paradigma de fadiga | 80 | 0,33 | 1 estimulação muscular seguida por 14 estimulações nervosas com tempo de repouso de 0,67 s cada, repetido 20 vezes | Falha na neurotransmissão (FN) e fadiga intratetânica (FI) | |
Tabela 2 - Protocolo de estimulação do nervo frênico-diafragma. A tabela lista a sequência de testes que compõem o protocolo completo para testar preparações do diafragma-nervo frênico.
3. Análise de dados
OBSERVAÇÃO: Ao final do protocolo, calcule todos os parâmetros desejados da seguinte maneira.
- A partir da estimulação por pulso único
- Calcule a força de contração (mN; força ativa máxima gerada durante a contração) e a força específica de contração (mN/mm)2). Calcule-o subtraindo o valor inicial da pré-carga da força máxima gerada pelo músculo. Calcule a força específica de contração como a força de contração dividida pela área de seção transversal (CSA) do músculo.
- Calcule o tempo para a tensão máxima (TTP) (ms) como o tempo entre a liberação do pulso e a força do contração rápida.
- Calcule o tempo de meia-relaxação (1/2RT) (ms) como o tempo decorrido entre a força de contração e 50% da força de contração.
- Calcule dF/dt (mN/ms) como o valor máximo da derivada da força durante a fase contrátil.
- Calcule -dF/dt (mN/ms) como o valor máximo da derivada da força durante a fase de relaxamento.
- A partir de estimulações com trem de pulsos
- Calcular a força não fundida (mN) e a força específica não fundida (mN/mm)2). Calcule-o subtraindo o valor inicial da pré-carga da força máxima gerada pelo músculo. Calcule a força não fundida específica como a força não fundida dividida pela área da seção transversal (CSA) do músculo.
OBSERVAÇÃO: A força não-fusionada é a força ativa máxima gerada durante um trem de estímulos com frequência inferior à frequência tetânica. - Calcule a força tetânica (mN) e a força tetânica específica (mN/mm²); a força máxima é a força ativa máxima gerada durante uma série de estímulos aplicada na frequência tetânica. Calcule-a subtraindo o valor inicial da pré-carga da força máxima gerada pelo músculo. Calcule a força tetânica específica dividindo a força tetânica pela área da seção transversal (CSA) do músculo.
- Calcule a curva força-frequência. Represente graficamente o valor da força (ou força específica) obtido para cada estimulação em função da frequência crescente de estimulação. Normalmente, inicia-se com a estimulação por pulso único e termina-se com a frequência tetânica.
- Calcular a força não fundida (mN) e a força específica não fundida (mN/mm)2). Calcule-o subtraindo o valor inicial da pré-carga da força máxima gerada pelo músculo. Calcule a força não fundida específica como a força não fundida dividida pela área da seção transversal (CSA) do músculo.
- De paradigmas de fadiga
- Calcule a falha na neurotransmissão (FN) como:
onde MF é a diminuição da força após a estimulação muscular e F é a diminuição da força após a estimulação nervosa, medida no primeiro trem de estímulos após a estimulação muscular. - Calcule a fadiga intratetânica (IF) como:
onde Flp é a força gerada pelo músculo no último pulso de estimulação, e Fm é a força máxima gerada pelo músculo durante a mesma sequência de estímulos. Em relação à estimulação do nervo, calcule a fadiga intratetânica na primeira sequência de estímulos imediatamente após a estimulação direta.
- Calcule a falha na neurotransmissão (FN) como:
4. Análise estatística
OBSERVAÇÃO: Os modelos de análise estatística devem ser escolhidos de acordo com a comparação da resposta muscular tanto à estimulação nervosa quanto à membranar ser realizada dentro do mesmo modelo animal ou entre dois modelos animais diferentes18,19.
- Utilize o teste t de Student para TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt ao comparar apenas as respostas musculares à estimulação direta e indireta. Ao comparar preparações musculares obtidas de duas linhagens diferentes de camundongos, utilize ANOVA de dois fatores, com tipo de estimulação e linhagem do camundongo como fatores fixos. Quando a ANOVA de dois fatores apresentar um resultado significativo, utilize testes de comparação múltipla para identificar diferenças estatísticas.
- Para a curva força-frequência (ao comparar apenas as respostas musculares à estimulação direta e indireta), utilize ANOVA de dois fatores com tipo de estimulação e frequência de estimulação como fatores fixos. Utilize testes de comparação múltipla, se necessário.
- Ao comparar preparações musculares obtidas de duas linhagens diferentes de camundongos, utilize ANOVA de três fatores com tipo de estimulação, frequência de estimulação e linhagem do camundongo como fatores fixos.
- Quando a ANOVA de três fatores indicar um efeito significativo dos fatores linhagem do animal e tipo de estimulação, utilize ANOVA de dois fatores para identificar diferenças significativas entre dois grupos por vez. Por exemplo, pode-se avaliar as diferenças entre a resposta muscular dos dois grupos à estimulação da membrana ou entre as respostas musculares à estimulação direta e indireta dentro de um único grupo.
- Ao comparar preparações musculares obtidas de duas linhagens diferentes de camundongos, utilize ANOVA de três fatores com tipo de estimulação, frequência de estimulação e linhagem do camundongo como fatores fixos.
- Fadiga intratetânica
NOTA: Como o protocolo foi projetado para induzir fadiga em resposta à estimulação nervosa mesmo em camundongos controle, este parâmetro só pode ser usado para investigar diferenças entre duas linhagens de camundongos, e uma análise estatística dentro de um único grupo sempre resultaria em diferenças significativas.- Para comparar dois grupos, utilize ANOVA de três fatores com tipo de estimulação, tempo e linhagem do camundongo como fatores fixos. Quando a ANOVA de três fatores indicar um efeito significativo dos fatores linhagem do animal e tipo de estimulação, utilize ANOVA de dois fatores para identificar diferenças significativas entre dois grupos por vez, da mesma forma que na curva força-frequência.
- Para falha na neurotransmissão, utilize ANOVA de dois fatores com linhagem do animal e tempo como fatores fixos. Se os resultados forem significativos, utilize testes de comparação múltipla para identificar diferenças estatísticas.
NOTA: Como este parâmetro fornece apenas um valor para cada linhagem de camundongo, permite a comparação entre diferentes modelos de camundongos. - Para peso, comprimento e ACS do músculo, utilize o teste t de Student para investigar diferenças ao comparar preparações músculo-nervos de diferentes modelos animais.
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Resultados
O protocolo descrito fornece informações sobre denervação funcional em diversas doenças neuromusculares ou envelhecimento-sarcopenia. Este protocolo pode ser usado para determinar se (e, em caso afirmativo, em que nível) alterações musculares são devido a seletivas mudanças que ocorrem no músculo em si ou na transmissão neuromuscular. Os dados mostrados abaixo são os resultados de um trabalho anterior de nosso grupo18, realizado sobre o modelo de rato transgénico S...
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Discussão
O protocolo experimental descrito acima fornece uma maneira ideal de medir e discriminar qualquer alterações funcionais ocorridas diretamente no músculo ou indirectamente a nível da junção neuromuscular. Uma vez que esta técnica baseia-se em uma medida indireta da funcionalidade de JNM, não pode ser usado para determinar se qualquer defeito está relacionado às alterações morfológicas ou a alterações bioquímicas. Por outro lado, ele fornece uma maneira eficaz de determinar se as alterações morfológicas ou bioquímicas redu...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Trabalho no laboratório dos autores foi apoiado pela Fondazione Roma e Teleton (conceder n. GGP14066).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de Alavanca de Modo Duplo | Aurora Científica Inc. | Atuador/transdutor | 300B |
| Estimulador Bifásico de Alta Potência | Aurora Científica Inc. | 701B | (nervo) |
| Estimulador bifásico de alta potência | Aurora Científica Inc. | Estimulador de pulso | 701C |
| Aparelho muscular in vitro | Aurora Científica Inc. | 800A | |
| Radnoti | 158400 | ||
| Eletrodo de Sucção Monopolar | A-M Systems | 573000 | com referência caseira |
| Osciloscópio | Estereomicroscópio Tektronix | TDS2014 | |
| Nikon | SMZ 800 | ||
| Iluminador de luz fria | Óptica Fotônica | PL 3000 | |
| Placa de aquisição | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Bloco de conectores | National Instruments | NI 2110 | |
| Computador pessoal | AMD Phenom II x4 970 | Processador 3,50 Ghz com software Windows 7 | |
| LabView 2012 | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonato Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | tampão fisiológico |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Cloreto de cálcio CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anidro, pó, ≥ 97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥ 99,5% (titulação) |
| Pratos 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Poliestireno |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Kit de Elastômero 0.5Kg. |
| Termostato | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Bomba | Newa Mini | MN 606 | para aquário |
| Resistência ao calor Termocabo Lucky | Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Balde | de 10 litros | Polipropileno | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mistura de gás | |
| #5 Fórceps | Ferramentas Fine Science | 11252-20 | 2 itens |
| Tesoura de Mola - Lâminas de 8 mm | Ferramentas Fine Science | 15024-10 | excisão de nervo |
| Tesoura Afiada | Ferramentas de Belas Ciências | 14059-11 | remoção muscular |
| Tesoura Delicada | Wagner | 02.06.32 | externo do animal Cabo de |
| Bisturi de Estudante #3 | Ferramentas de Belas Ciências | 91003-12 | |
| Lâminas de bisturi #10 | Ferramentas de ciência fina | 10010-00 | |
| Lâminas de Bisturi #11 | Ferramentas de Ciência Fina | 10011-00 | |
| fio de nylon e Oslash; 0,16 mm | qualquer |
Referências
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
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