Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Junção neuromuscular (JNM) é uma sinapse química formada pela conexão entre a placa terminal motor da fibra muscular e o axônio do neurônio motor terminal. O MNJ foi mostrado para jogar um papel crucial, quando a comunicação entre o músculo e do nervo é prejudicada, como ocorre no envelhecimento ou esclerose lateral amiotrófica (ela). Como o músculo e nervo comunicar-se em uma maneira de bidirecional^1,2, sendo capaz de medir defeitos MNJ separadamente do músculo defeitos pode fornecer novos insights sobre sua interação fisiopatológica. Com efeito, esta avaliação funcional pode ajudar a avaliar se alterações morfológicas ou bioquímicas reduzem neurotransmissão funcionalidade de sinalização.

A comparação da resposta contrátil muscular, provocada pela estimulação do nervo e a resposta do mesmo músculo evocado por estimulação direta de sua membrana tem sido proposta como uma medida indireta da funcionalidade do MNJ. Com efeito, desde a membrana neurotransmissão de by-pass de estimulação sinalização, quaisquer diferenças nas duas respostas contráteis podem são imputáveis mudanças no MNJ. Esta abordagem foi extensivamente proposta para ratos^3,4,5,6,7e também usada para reunir informações sobre modelos de rato^8,9,10,11,12.

Aqui, descrevemos em detalhe um procedimento para excisar e testar duas preparações nervo-músculo, i. e. as preparações sóleo-isquiático e frênico-diafragma. Usando um Custom-Made software, nós projetamos um protocolo de teste contínuo que combina a medição de vários parâmetros que caracterizam a funcionalidade tanto Mioneural e músculo, desse modo, produzindo uma avaliação abrangente dos prejuízos MNJ separadamente do músculo. Em particular, o protocolo mede a força de contração muscular, a cinética de músculo, a curva força-frequência para direta e estímulos nervosos, a neurotransmissão falha¹³ para um despedimento e as frequências tetânica e a fadiga intratetanic⁷.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de ética da Unidade de Histologia e Embriologia Médica da Universidade Sapienza de Roma e foram realizados de acordo com a versão atual da Lei Italiana sobre a Proteção dos Animais.

1. Configuração experimental

1. Montar o sistema experimental composto por 1 atuador/transdutor, 2 estimuladores, 1 aparelho muscular in vitro, 1 banho preparatório de tecidos, 1 eletrodo de sucção, 1 osciloscópio digital, 1 estereomicroscópio, 1 iluminador de luz fria, 1 placa de aquisição, 1 bloco de conectores e um computador pessoal.
   NOTA: Aqui o software de comando foi programado no LabView e foi projetado para garantir alta flexibilidade, precisão e repetibilidade das estimulações. Para cada estimulação, o usuário pode selecionar a largura do pulso, frequência, duração e decidir se ela é entregue à membrana ou através do nervo. O usuário também pode selecionar a duração do período de descanso antes de cada estimulação.

2. Avaliações das propriedades contráteis da JNM dos músculos sóleo e diafragma

1. Aquecimento do sistema
   1. Prepare o tampão de toque Krebs < classe de sup = "refex>14 e coloque-o em um banho do aparelho de montagem e no banho de tecido preparatório. Colocar uma cápsula de 60 mm preparada com 4 ml de silicone no banho preparatório de tecidos.
   2. Ligue o banho-maria circulante e ajuste a temperatura para 30 °C para o músculo sóleo e 27 °C para o músculo diafragma.
   3. Deixe a mistura de 95% de O₂ - 5% de CO₂ fluir para ambos os banhos.
   4. Ligue o atuador/transdutor e os dois estimuladores de pulso e ajuste os valores atuais para 300 mA para estimulação da membrana e 5 mA para estimulação nervosa.
      NOTA: O valor da corrente de 300 mA demonstrou anteriormente não induzir nenhuma contração significativa nos ramos nervosos quando a D-tubocurarina é adicionada à solução¹⁵. O valor de corrente de 5 mA corresponde à quantidade de corrente necessária para estimular o músculo através do nervo sem criar uma sobreposição com a estimulação da membrana induzida por meio da solução. Como a distância entre o eletrodo de sucção e o músculo depende do comprimento do nervo, esse valor de corrente deve ser cuidadosamente ajustado antes de cada experimento, conforme descrito abaixo.
2. Dissecção do sóleo e do diafragma
   1. Sacrifique o camundongo por luxação cervical para minimizar o sofrimento e extirpe imediatamente os músculos para teste da seguinte maneira.
   2. Preparação, dissecção e configuração sóleo-ciática
      1. Pulverize etanol a 70% na perna do rato e remova a pele que cobre a perna. Faça uma incisão na parte superior da perna com uma tesoura e puxe a pele com firmeza. Isole o tendão de Aquiles da tíbia e, em seguida, corte o tendão de Aquiles com uma tesoura.
      2. Prenda firmemente o tendão com uma pinça e puxe suavemente o músculo gastrocnêmio junto com o sóleo. Uma vez que o tendão proximal do sóleo esteja exposto, corte toda a panturrilha com uma tesoura enquanto ainda segura o tendão de Aquiles. Coloque imediatamente a amostra de tecido no banho preparatório de tecido.
      3. Coloque o banho preparatório sob o estereomicroscópio e fixe o bezerro à placa de silicone usando pinos de aço inoxidável de 0,20 mm de diâmetro. Usando uma pinça, prenda o tendão proximal do sóleo e puxe-o suavemente para expor a inervação ciática.
      4. Uma vez que a inervação é exposta (Figura 1), remova cuidadosamente o tecido circundante para expor cerca de 5 mm do nervo. Use uma tesoura fina para cortar o nervo. Enquanto aperta firmemente o sóleo no tendão proximal com uma pinça, puxe-o novamente e excise-o cortando o tendão de Aquiles com uma tesoura.
      5. Passe um fio de náilon pelo orifício do braço de alavanca do atuador/transdutor. Crie um laço na extremidade do fio e segure o tendão de Aquiles antes de puxar o fio para trás até que o músculo atinja o banho do aparelho de montagem. Prenda o tendão proximal dentro do grampo fixo e amarre o fio de náilon ao redor do braço da alavanca. Permita que o músculo se equilibre na solução.
      6. Determine o comprimento ideal inicial (L₀).
         1. Primeiro, alongue o músculo para pré-carregá-lo a 10 mN (este valor garante a força máxima de contração (com base na experiência)). Em seguida, alongue suavemente o músculo para alterar a pré-carga e estimule-o com uma série de pulsos únicos. O comprimento ideal é alcançado quando a força máxima de contração é medida.
   3. Preparação, dissecção e configuração diafragmórnica
      1. Pulverize etanol 70% na pele do rato. Remova a pele que cobre o músculo diafragma fazendo uma incisão sobre o esterno com uma tesoura e puxando a pele com firmeza.
      2. Com uma tesoura, corte o abdômen horizontalmente abaixo do esterno e remova suavemente o intestino e os órgãos com uma pinça. Use uma tesoura grossa para cortar a coluna.
      3. Corte as costelas cerca de 1 cm sobre o esterno e prossiga horizontalmente. Remova suavemente os órgãos externos com uma pinça e corte a coluna para obter um anel circular de costelas contendo o diafragma.
      4. Lave a preparação em um prato contendo o tampão Krebs Ringer e, em seguida, coloque-o no prato de silicone dentro do banho preparatório de tecidos, com a parte superior voltada para cima e o esterno voltado para a frente.
      5. Usando o estereomicroscópio, remova cuidadosamente os pulmões e os órgãos restantes; o nervo frênico será visível no lado direito (Figura 2A).
      6. Apare as nervuras para deixar um anel de cerca de 2 mm ao longo do diafragma.
      7. Com uma pinça, fixe um pino de aço inoxidável de 0,20 mm de diâmetro no tendão central do diafragma no ponto correspondente à inervação do nervo frênico e outro pino nas costelas no mesmo eixo para identificar a faixa diafragmática de interesse.
      8. Fixe dois pinos adicionais no tendão central e outros dois pinos nas nervuras de cada lado da tira selecionada para colocar o diafragma. Se necessário, limpe o nervo frênico do tecido conjuntivo circundante usando uma pinça.
      9. Usando uma lâmina curva, corte o diafragma em ambos os lados da inervação para identificar uma tira tendão-músculo-costela, conforme mostrado em Figura 2B.
      10. Passe um fio de náilon pelo orifício do braço de alavanca do atuador/transdutor. Crie um laço na extremidade do fio e segure o tendão antes de puxar o fio para trás até que o músculo atinja o banho do aparelho de montagem.
      11. Prenda as nervuras dentro do grampo fixo e amarre o fio de náilon ao redor do braço da alavanca.
      12. Permita que o músculo se equilibre na solução e determine o comprimento ideal inicial (L0).
          1. Alongue o músculo para pré-carregá-lo a 5 mN. Alongue suavemente o músculo para alterar a pré-carga e estimule-a com uma série de pulsos únicos. O comprimento ideal é alcançado quando a força máxima de contração é medida.

Figura 1 - Preparação do nervo sóleo-ciático. Nervo sóleo-ciático durante operação cirúrgica para os testes funcionais. O ciático é exposto usando um par de pinças. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 - Preparação do nervo diafragma-frênico. A figura mostra uma fase da excisão do preparo do nervo diafragma-frênico (A) e a tira a ser montada para testes funcionais (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Medindo as propriedades da JNM separadamente da contratilidade muscular
   1. Defina a melhor intensidade de corrente para a estimulação através do nervo e verifique se os pulsos de corrente fornecidos através do eletrodo de sucção não provocam contração muscular pela propagação da corrente no banho.
      1. Coloque o eletrodo de sucção perto do músculo e puxe o nervo para dentro. Enquanto aumenta suavemente a intensidade da corrente (a partir de 5 mA), estimule o músculo com uma série de pulsos únicos. O valor ideal da corrente é determinado quando a força de contração é máxima.
      2. Empurre o nervo para fora do eletrodo e forneça alguns pulsos únicos. Certifique-se de que o músculo não se contraia devido à sobreposição com a estimulação da membrana por meio da solução. Puxe o nervo novamente.
   2. Inicie o programa e selecione o arquivo de entrada para executar o protocolo de teste desejado.
      NOTA: O arquivo de entrada inclui todos os parâmetros de estimulação necessários para executar todo o protocolo. Embora a mesma estrutura de protocolo seja usada para os dois músculos, os parâmetros de estimulação diferem dependendo do protocolo refere-se aos músculos sóleo ou diafragma.
      1. Estimulação do nervo sóleo-ciático (ver Tabela 1)
         1. Use as seguintes larguras de pulso para todas as estimulações elétricas: 1,4 ms para estimulação do nervo ciático e 0,1 ms para estimulação direta do sóleo. O protocolo completo dura aproximadamente 65 min.
      2. Estimulação do nervo diafragmórmico-frênico (ver Tabela 2)
         1. Use as seguintes larguras de pulso para todas as estimulações elétricas: 1,8 ms para estimulação do nervo frênico e 0,2 ms para estimulação direta do diafragma. O protocolo completo dura aproximadamente 55 min.
      3. Ao final do protocolo experimental, medir o comprimento e o peso úmido do músculo usando um paquímetro analógico com precisão de 0,05 mm e uma balança de precisão com precisão de 0,1 mg, respectivamente.
         1. Calcule a área da seção transversal (CSA) dividindo a massa muscular pelo produto do comprimento ideal da fibra (L_f) e a densidade do músculo esquelético de mamíferos (1,06 mg/mm³)¹⁶.
            NOTA: L_f é obtido multiplicando-se L₀ pela relação comprimento da fibra/comprimento do músculo (0,71 para o músculo sóleo¹⁶ e 1 para o músculo diafragma¹⁷).

Tabela 1 - Protocolo de estimulação do nervo sóleo-ciático. A tabela lista a sequência de testes que formam o protocolo completo para testar as preparações do nervo sóleo-ciático.

Tabela 2 - Protocolo de estimulação do nervo diafragma-frênico. A tabela lista a sequência de testes que formam o protocolo completo para testar as preparações do nervo diafragma-frênico.

3. Análise dos dados

NOTA: No final do protocolo, calcule todos os parâmetros desejados da seguinte forma.

1. De estimulação de pulso único
   1. Calcule a força de contração (mN; força ativa máxima gerada durante a contração) e a força de contração específica (mN/mm²). Calcule-o subtraindo o valor inicial da pré-carga à força máxima gerada pelo músculo. Calcule a força de contração específica como força de contração dividida pelo músculo CSA.
   2. Calcule o tempo até o pico de tensão (TTP) (ms) como o tempo entre a liberação do pulso e a força de contração.
   3. Calcule o tempo de meio relaxamento (1/2RT) (ms) como o tempo desde a força de contração até 50% da força de contração.
   4. Calcule dF/dt (mN/ms) como o valor máximo da derivada da força durante a fase contrátil.
   5. Calcule -dF/dt (mN/ms) como o valor máximo da derivada da força durante a fase de relaxamento.
2. De estímulos de trem de pulso
   1. Calcule a força não fundida (mN) e a força específica não fundida (mN/mm²). Calcule-o subtraindo o valor inicial da pré-carga à força máxima gerada pelo músculo. Calcule a força específica não fundida como a força não fundida dividida pelo músculo CSA.
      NOTA: A força não fundida é a força ativa máxima gerada durante um trem de pulso com uma frequência inferior à frequência tetânica.
   2. Calcule a força tetânica (mN) e a força tetânica específica (mN / mm2); a força máxima é a força ativa máxima gerada durante um trem de pulso entregue na frequência tetânica. Calcule-o subtraindo o valor inicial da pré-carga à força máxima gerada pelo músculo. Calcule a força tetânica específica como a força tetânica dividida pela ACT do músculo.
   3. Calcule a curva de força-frequência. Plote o valor da força (ou força específica) obtida para cada estimulação versus a frequência crescente de estimulação. Normalmente, começa com a estimulação de pulso único e termina com a frequência tetânica.
3. Dos paradigmas da fadiga
   1. Calcule a falha de neurotransmissão (NF) como:
      
      onde MF é a diminuição da força após a estimulação muscular e F é a diminuição da força após a estimulação nervosa, medida no primeiro trem de pulso após a estimulação muscular.
   2. Calcule a fadiga intratetânica (IF) como:
      
      onde F_lp é a força gerada pelo músculo no último pulso de estimulação, e F_m é a força máxima gerada pelo músculo durante o mesmo trem de pulso. Em relação à estimulação nervosa, calcule a fadiga intratetânica no primeiro trem de pulso imediatamente após a estimulação direta.

4. Análise estatística

NOTA: Os modelos de análise estatística devem ser escolhidos de acordo com a comparação da resposta muscular às estimulações nervosas e de membrana dentro do mesmo modelo animal ou entre 2 modelos animais diferentes^18,19.

1. Use o teste t de Student para TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt se comparar apenas as respostas musculares a estímulos diretos e indiretos. Se comparar preparações musculares obtidas de 2 linhagens de camundongos diferentes, use ANOVA de 2 vias com tipo de estimulação e tensão de camundongo como fatores fixos. Quando a ANOVA de 2 vias retornar um resultado significativo, use testes de comparação múltipla para procurar diferenças estatísticas.
2. Para curva de força-frequência (se comparar apenas as respostas musculares a estímulos diretos e indiretos), use ANOVA de 2 vias com tipo de estimulação e frequência de estimulação como fatores fixos. Use testes de comparação múltipla, se necessário.
   1. Se comparar preparações musculares obtidas de 2 linhagens de camundongos diferentes, use ANOVA de 3 vias com tipo de estimulação, frequência de estimulação e tensão de camundongo como fatores fixos.
      1. Quando a ANOVA de 3 vias produzir um efeito significativo dos fatores tensão animal e tipo de estimulação, use a ANOVA de 2 vias para identificar diferenças significativas entre 2 grupos de cada vez. Por exemplo, as diferenças entre a resposta muscular dos 2 grupos à estimulação da membrana ou entre a resposta muscular às estimulações diretas e indiretas dentro de um grupo podem ser avaliadas.
3. Fadiga intratetânica
   NOTA: Como o protocolo foi projetado para induzir fadiga em resposta à estimulação nervosa, mesmo em camundongos controle, esse parâmetro só pode ser usado para investigar diferenças entre 2 cepas de camundongos, e uma análise estatística dentro de um único grupo sempre produziria diferenças significativas.
   1. Para comparar dois grupos, use ANOVA de 3 vias com tipo de estimulação, tempo e tensão do camundongo como fatores fixos. Quando a ANOVA de 3 vias produz um efeito significativo dos fatores tensão animal e tipo de estimulação, use a ANOVA de 2 vias para identificar diferenças significativas entre 2 grupos de cada vez, como para a curva de força-frequência.
4. Para falha de neurotransmissão, use ANOVA de 2 vias com tensão animal e tempo como fatores fixos. Se retornar resultados significativos, use testes de comparação múltipla para pesquisar diferenças estatísticas.
   NOTA: Como esse parâmetro retorna apenas um valor para cada cepa de mouse, ele permite que diferentes modelos de mouse sejam comparados.
5. Para peso, comprimento e ACS muscular, use o teste t de Student para investigar as diferenças ao comparar preparações músculo-nervosas de diferentes modelos animais.

O protocolo descrito fornece informações sobre denervação funcional em diversas doenças neuromusculares ou envelhecimento-sarcopenia. Este protocolo pode ser usado para determinar se (e, em caso afirmativo, em que nível) alterações musculares são devido a seletivas mudanças que ocorrem no músculo em si ou na transmissão neuromuscular. Os dados mostrados abaixo são os resultados de um trabalho anterior de nosso grupo18, realizado sobre o modelo de rato transgénico SOD1G93A de esclerose amiotrófica lateral na fase final da doença20. O rato transgénico SOD1G93A ubiquitously overexpresses o mutante antioxidante da enzima superóxido dismutase 1 (SOD1). Figuras 3 e 4 mostram os valores de força tetânica para o nervo isquiático-sóleo (à esquerda) e para as preparações nervo frênico-diafragma (à direita) e dF/dt. Estes resultados demonstram a capacidade da técnica aqui proposta para detectar os defeitos funcionais nos músculos transgênicos que estão relacionados com o MNJ em oposição aos estritamente relacionada com o músculo em si. Com efeito, por força tetânica e dF/dt, músculos sóleo SOD1G93A exibido uma resposta contrátil reduzida, em comparação com o músculo de controle, quando estimulado diretamente e exibido uma redução quando estimulado através do nervo. Por outro lado, leves alterações foram observadas estes dois parâmetros quando tiras de músculo diafragma foram estimuladas através da membrana, Considerando que alterações significativas foram detectadas quando o músculo diafragma foi estimulado através do nervo.

Figura 3 - Cinética contrátil. Quer dizer ± SEM das dF/dt para os sóleo (A) e o diafragma (B) os preparativos. Espécimes de sóleo exibido uma desaceleração significativa para baixo quando estimulado diretamente (-27%) e uma nova diminuição quando estimulado através do nervo (-58%). Espécimes de diafragma exibido uma desaceleração somente quando estimulada através do nervo (-30%). Adaptado de Rizzuto et al. 18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 - Força tetânica. Quer dizer SEM ± da força tetânica de específica para os sóleo (A) e o diafragma (B) os preparativos. Espécimes de sóleo exibido uma desaceleração significativa para baixo quando estimulado diretamente (-26%) e uma nova diminuição quando estimulado através do nervo (-50%). Espécimes de diafragma exibido uma diminuição de força só quando estimulado através do nervo (-44%). Adaptado de Rizzuto et al. 18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A avaliação da fadiga intratetanic e da neurotransmissão falha permitiu parâmetros específicos de JNM a ser medido. A Figura 5 mostra os valores médios de fadiga intratetanic (se) medido durante o paradigma de fadiga tetânica para músculos sóleo (Figura 5A) e tiras de diafragma (Figura 5B). Conforme relatado na seção de protocolo, o paradigma de fadiga que aplicamos foi desenvolvido de forma a salientar o MNJ embora não o músculo. Como resultado, o se medido para a estimulação direta do músculo nunca foi alterada. Com efeito, o se calculado para a estimulação do nervo é o parâmetro que deve ser considerado para comparações entre estirpes de mouse diferente. Nossos resultados mostram que o se foi significativamente menor em transgénico sóleo e os músculos diafragma do que as contrapartes de controle. Essa diferença foi maior no diafragma, na qual foi detectado um defeito pequeno músculo, e menor no sóleo, em que o dano muscular significativo já tinha medido. Ele deve ter em mente que, desde que o músculo sóleo transgénicos foi significativamente danificado, a avaliação MNJ só foi correta para até 8 min. de estimulação, que é o tempo que leva para o músculo transgênico retornar o valor nulo da força quando estimulado. Sóleo transgênico se valores após 8 min de estimulação basicamente expressam ruído.

Figura 5 - Fadiga intratetanic. Intratetanic fadiga para os músculos sóleo (A) e o diafragma (B) exibido um decréscimo significativo na funcionalidade de JNM transgénico. Os valores são média ± SEM. adaptado de Rizzuto et al. 18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 6 mostra o fracasso da neurotransmissão na frequência tetânica medida no sóleo (figura 6A) e amostras de diafragma (Figura 6B). De acordo com os resultados, se nenhum defeito na neurotransmissão foi detectado no músculo sóleo, Considerando que os espécimes de músculo diafragma exibido um aumento significativo no cansaço da junção neuromuscular.

Figura 6 -Falha de neurotransmissão. Falha de neurotransmissão não exibir quaisquer alterações em que os músculos de sóleo (A), enquanto destacou um decréscimo significativo na funcionalidade de JNM em transgênicos tiras do diafragma (B). Os valores são média ± SEM. adaptado de Rizzuto et al. 18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.