Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Summary

Uma avaliação funcional da junção neuromuscular (JNM) pode fornecer informações essenciais sobre a comunicação entre o músculo e do nervo. Aqui descrevemos um protocolo para avaliar exaustivamente o músculo e o MNJ funcionalidade usando duas preparações diferentes de nervo-músculo, ou seja, sóleo-isquiático e frênico-diafragma.

Abstract

Funcionalidade de junção neuromuscular (JNM) desempenha um papel crucial ao estudar as doenças em que a comunicação entre neurônio motor e músculo é prejudicada, como envelhecimento e esclerose lateral amiotrófica (ela). Aqui descrevemos um protocolo experimental que pode ser usado para medir a funcionalidade MNJ combinando dois tipos de estimulação elétrica: direto de estimulação da membrana muscular e a estimulação através do nervo. A comparação da resposta muscular para esses dois estímulos diferentes pode ajudar a definir, a nível funcional, potenciais alterações no MNJ que levam ao declínio funcional no músculo.

Preparações dex vivo E são adequadas para estudos bem controlados. Aqui descrevemos um protocolo intensivo para medir vários parâmetros do músculo e funcionalidade Nicotínico para a preparação do nervo isquiático-sóleo e para a preparação nervo frênico-diafragma. O protocolo dura aproximadamente 60 minutos e é realizado ininterruptamente por meio de uma custom-made software que mede as propriedades de cinética de contração muscular, a relação força-frequência de estimulação do músculo e do nervo e dois parâmetros específicos para a funcionalidade de JNM, ou seja, falha de neurotransmissão e fadiga intratetanic. Esta metodologia foi utilizada para detectar danos em preparações de nervo-músculo sóleo e diafragma usando SOD1^G93A mouse transgénico, um modelo experimental de ALS que ubiquitously overexpresses o mutante antioxidante da enzima superóxido dismutase 1 (SOD1).

Introduction

Junção neuromuscular (JNM) é uma sinapse química formada pela conexão entre a placa terminal motor da fibra muscular e o axônio do neurônio motor terminal. O MNJ foi mostrado para jogar um papel crucial, quando a comunicação entre o músculo e do nervo é prejudicada, como ocorre no envelhecimento ou esclerose lateral amiotrófica (ela). Como o músculo e nervo comunicar-se em uma maneira de bidirecional^1,2, sendo capaz de medir defeitos MNJ separadamente do músculo defeitos pode fornecer novos insights sobre sua interação fisiopatológica. Com efeito, esta avaliação funcional pode ajudar a avaliar se alterações mo....

Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de ética da Unidade de Histologia e Embriologia Médica da Universidade Sapienza de Roma e foram realizados de acordo com a versão atual da Lei Italiana sobre a Proteção dos Animais.

1. Configuração experimental

1. Montar o sistema experimental composto por 1 atuador/transdutor, 2 estimuladores, 1 aparelho muscular in vitro, 1 banho preparatório de tecidos, 1 eletrodo de sucção, 1 osciloscópio digital, 1 estereomicroscópio, 1 iluminador de luz fria, 1 placa de aquisição, 1 bloco de conectores e um computador pessoal.
   NOTA: Aqui o software de comando foi prog....

Results

O protocolo descrito fornece informações sobre denervação funcional em diversas doenças neuromusculares ou envelhecimento-sarcopenia. Este protocolo pode ser usado para determinar se (e, em caso afirmativo, em que nível) alterações musculares são devido a seletivas mudanças que ocorrem no músculo em si ou na transmissão neuromuscular. Os dados mostrados abaixo são os resultados de um trabalho anterior de nosso grupo¹⁸, realizado sobre o modelo de rato transgénico S.......

Discussion

O protocolo experimental descrito acima fornece uma maneira ideal de medir e discriminar qualquer alterações funcionais ocorridas diretamente no músculo ou indirectamente a nível da junção neuromuscular. Uma vez que esta técnica baseia-se em uma medida indireta da funcionalidade de JNM, não pode ser usado para determinar se qualquer defeito está relacionado às alterações morfológicas ou a alterações bioquímicas. Por outro lado, ele fornece uma maneira eficaz de determinar se as alterações morfológicas ou bioquímicas redu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de Alavanca de Modo Duplo	Aurora Científica Inc.	Atuador/transdutor	300B
Estimulador Bifásico de Alta Potência	Aurora Científica Inc.	701B	(nervo)
Estimulador bifásico de alta potência	Aurora Científica Inc.	Estimulador de pulso	701C
Aparelho muscular in vitro	Aurora Científica Inc.	800A
	Radnoti	158400
Eletrodo de Sucção Monopolar	A-M Systems	573000	com referência caseira
Osciloscópio	Estereomicroscópio Tektronix	TDS2014
	Nikon	SMZ 800
Iluminador de luz fria	Óptica Fotônica	PL 3000
Placa de aquisição	National Instruments	NI PCIe-6353
Bloco de conectores	National Instruments	NI 2110
Computador pessoal	AMD Phenom II x4 970		Processador 3,50 Ghz com software Windows 7
LabView 2012	National Instruments
Krebs-Ringer Bicarbonato Buffer	Sigma-Aldrich	K4002	tampão fisiológico
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S5761
Cloreto de cálcio CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901	anidro, pó, ≥ 97%
Buffer HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	≥ 99,5% (titulação)
Pratos 60mm x 15mm	Falcon	353004	Poliestireno
Silicone	Sylgard	184 Silicone	Kit de Elastômero  0.5Kg.
Termostato	Dennerle	DigitalDuomat 1200
Bomba	Newa Mini	MN 606	para aquário
Resistência ao calor Termocabo Lucky	Reptile	61403-1	50/60Hz 50W
Balde	de 10 litros		Polipropileno
O2 + 5%CO2	siad		Mistura de gás
#5 Fórceps	Ferramentas Fine Science	11252-20	2 itens
Tesoura de Mola - Lâminas de 8 mm	Ferramentas Fine Science	15024-10	excisão de nervo
Tesoura Afiada	Ferramentas de Belas Ciências	14059-11	remoção muscular
Tesoura Delicada	Wagner	02.06.32	externo do animal Cabo de
Bisturi de Estudante #3	Ferramentas de Belas Ciências	91003-12
Lâminas de bisturi #10	Ferramentas de ciência fina	10010-00
Lâminas de Bisturi #11	Ferramentas de Ciência Fina	10011-00
fio de nylon e Oslash; 0,16 mm	qualquer